白细胞抗原系统检测.ppt

白细胞抗原检测白细胞抗原检测目 录第一节 HLA血清学检测HLA抗原检测HLA抗体检测第二节 HLA细胞学检测第三节 HLA分子生物学检测HLA的分子生物学检测方法HLA常见基因分型方法比较HLA分型模棱两可结果的原因及其对策第四节 粒细胞抗原抗体检测第一节第一节 HLAHLA血清学检测血清学检测重点提示HLA抗原检测掌握微量淋巴细胞毒实验的原理及其影响因素HLA抗体检测方法淋巴细胞毒方法流式细胞仪方法ELISA方法Luminex检测技术掌握不同方法的原理及其优缺点微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验HLA抗原的血清学分型方法用一系列已知的抗HLA标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别微量淋巴细胞毒实验原理基于抗原抗体反应抗原抗体免疫复合物在补体的作用破坏细胞膜利用染料或其它方法鉴定和区分死活细胞计分法：NIH计分法 HLAHLA抗血清的来源抗血清的来源 HLA抗体血清来源同种免疫刺激产生HLA同种抗体HLA抗原免疫刺激动物杂交瘤技术人群存在的天然抗体微量淋巴细胞毒试验的影响因素微量淋巴细胞毒试验的影响因素 HLA抗血清抗血清来源和抗体种类、抗血清效价、抗血清特性、抗血清质量 淋巴细胞淋巴细胞活性、淋巴细胞纯度、淋巴细胞数量、淋巴细胞上抗原表达异常 孵育时间和温度 补体活性 染色和固定时间血清学抗原分型方法评价血清学抗原分型方法评价 血清学方法抗原分型检测HLA-类和类抗原检测HLA-类抗原相对容易检测HLA-类抗原需要分离和纯化淋巴细胞易受多种因素影响其错误率相对较高HLA血清学某一座位上只能检测到一个抗原，而基因分型存在两个不同等位基因，应考虑到无效等位基因HLAHLA抗体检测抗体检测补体依赖的淋巴细胞毒方法（CDC）采用淋巴细胞作为靶细胞抗原易受多种因素影响，检测敏感性最低ELISA 方法ELISA方法能检测HLA-I和HLA-II抗体流式细胞术采用淋巴细胞作为靶细胞抗原结合荧光检测技术特点Luminex检测技术结合荧光流式细胞仪和免疫标记技术可区分HLA-I和HLA-II抗体可鉴定抗体的属性和强度HLAHLA抗体检测抗体检测Luminex检测技术检测技术 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞每种磁珠上包被一种抗原多种磁珠可以在同一体系内反应待测血清与磁珠孵育存在HLA抗体时，形成抗原-抗体复合物加入荧光标记的抗人IgG抗体形成抗原-抗体-荧光标记抗体复合物Luminex仪测定微球磁珠上的荧光值判定HLA抗体的强度和特异性微球磁珠荧光值大小每种磁珠的反应特性第二节第二节 HLAHLA细胞学检测细胞学检测 重点提示掌握下列方法的基本原理及其应用混合细胞培养方法（mixed lymphocyte culture，MLC）纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养（MLC）二个无关个体的淋巴细胞在体外混合一起培养二者组织相容性抗原不同，互相刺激对方的T细胞发生增殖增殖反应强度与组织相容性抗原的差异程度成正比转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大、核内DNA和RNA合成增加MLC用于HLA-D抗原分型实体器官移植前的快速相容性检测分为双向MLC和单向MLC混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养双向MLC双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞抗原相同或相容，则刺激作用很小，细胞无变化抗原不相容，则刺激作用大，细胞被活化并产生增殖单向MLC一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解单一个体淋巴细胞的刺激强度和应答程度纯合细胞分型方法纯合细胞分型方法纯合细胞分型方法（也称为阴性分型）已知HLA-Dw型别的经灭活的纯合子细胞作为刺激细胞待检细胞作为反应细胞两种细胞进行单向混合淋巴细胞培养若不发生或仅发生弱的增殖反应表明受检细胞具有与纯合子分型细胞相同的HLA-Dw型别，它可能为特定HLA-Dw型的纯合子或杂合子发生增殖反应表明受检细胞不具有纯合子细胞拥有的HLA-Dw型别预致敏淋巴细胞（预致敏淋巴细胞（PLPL）预致敏淋巴细胞（PL）仅对一种单体型具有识别增殖能力，而处于静止状态的小淋巴细胞作为应答细胞参与了初次MLC反应，经过增殖后又回到小淋巴细胞遇到相应抗原刺激后，迅速发生淋巴细胞转化和增殖预致敏淋巴细胞试验预致敏淋巴细胞试验预致敏淋巴细胞试验（又称为阳性分型法)PL细胞作为已知的分型细胞待检淋巴细胞作为刺激细胞待检淋巴细胞分别与一系列的预致敏淋巴细胞进行单向MLC待检细胞与预致敏淋巴细胞预先识别的抗原相同，预致敏淋巴细胞会迅速增殖预致敏淋巴细胞分型试验是用阳性反应作为判定标准第三节第三节 HLAHLA分子生物学检测分子生物学检测 重点提示HLA的分子生物学检测方法掌握PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex检测技术、基因芯片、PCR-SBT的基本原理掌握HLA常见基因分型方法的特点及其适用范围HLA高分辨分型中模棱两可结果的原因及其对策 明确其形成原因掌握4种常见方法的原理及其应用HLAHLA分子生物学检测分子生物学检测HLA基因分型技术主要方法PCR序列特异性引物（PCR sequence specific primer,PCR-SSP）PCR序列特异性寡核苷酸探针技术（PCR sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSO）Luminex检测技术基因芯片核苷酸序列测定法（PCR sequence based-typing，PCR-SBT）PCRPCR序列特异性引物序列特异性引物PCR序列特异性引物（PCR-SSP）根据HLA等位基因核苷酸碱基序列的差异性，设计出一系列特异性引物引物3端最后一个碱基是否与其等位基因DNA模板配对起决定作用根据多对引物扩增的结果可以指定HLA基因型方法操作简单，快速耗时较短，结果判断简便有低分辨和高分辨分型试剂，为实验室常用的方法之一可能出现假阳性带或漏带现象某些罕见的HLA等位基因存在错误结果PCRPCR序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针PCR序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)利用核酸互补的杂交技术特异性引物扩增目的DNA片段PCR扩增产物与特异性探针进行杂交酶促反应体系或显色（影）溶液进行显色无颜色显示基因片段与探针不互补显示颜色基因片段与探针互补根据多个探针杂交信号结果进行HLA分型指定LuminexLuminex检测技术检测技术Luminex检测技术原理是利用核酸互补的杂交技术每一种微球上只固定一种已知序列的特异性探针利用特异性引物扩增目的DNA片段PCR扩增产物与多种微球在同一孔内进行特异性杂交杂交后加入荧光显色剂Luminex检测仪绿色激光束检测杂交信号Luminex检测仪红色激光束区分探针的种类扩增基因片段与探针不互补，在微球上无荧光显示扩增基因片段与探针互补，在微球上有荧光显示根据荧光值强度大小可以判定待测片段是否与探针互补基因芯片技术基因芯片技术基因芯片技术技术原理是根据核酸互补的杂交技术，并结合激光共聚焦荧光检测系统特性在特定载体（玻璃、硅等）上高密度有序地排列特定寡核苷酸片段作为探针对待检标本HLA基因片段进行扩增并荧光标记将待测标记的HLA基因片段与特定探针进行杂交基因片段与探针不互补，该探针位置无荧光显示基因片段与探针互补，该探针位置可显示荧光通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，根据荧光值强度大小可以判定待测片段是否与探针互补核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法（PCR-SBT）扩增目的DNA片段对扩增片段进行测序分析指定HLA等位基因型别根据测序序列中核苷酸多态性位点碱基情况，与已知可能的等位基因的序列进行比较直接检测基因的核苷酸序列属于高分辨方法，结果准确性最高直接双链测序过程中存在模棱两可基因型结果新一代测序技术新一代测序技术新一代测序（NGS）技术市场上有多种技术平台，其测序原理上存在差异NGS已应用于HLA分型其关键在于如何系统建立好HLA位点的DNA文库片段扩增和测序步骤则取决于所用的技术平台应用于HLA-I和HLA-II位点分型单链测序结果NGS进行HLA分型存在一定的偏差HLAHLA常见基因分型方法比较常见基因分型方法比较模棱两可结果产生的原因模棱两可结果产生的原因PCR-SSP的模棱两可结果PCR-SSP方法针对同一座位上不同等位基因碱基多态性位点设计引物引物可特异性针对单一或多个等位基因只扩增某特定的单一等位基因可直接指定特定单一等位基因引物对常扩增HLA某一座位数个等位基因存在多种可能性PCR-SSP方法可产生一定的模棱两可分型结果采用不同引物对的组合方式来指定或排除某个等位基因等位基因数量较多而且引物大多针对多个等位基因模棱两可结果产生的原因模棱两可结果产生的原因PCR-SSO的模棱两可结果探针的序列决定其特异性部分探针只与某一等位基因序列互补杂交标本与该探针杂交可明确无误地指定相应特定等位基因绝大多数探针能够与多种等位基因序列互补杂交无法单纯依靠这种探针进行等位基因指定探针反应格局表通过数理逻辑关系指定HLA基因型大量探针往往针对多个等位基因，错综复杂的杂交格局，导致产生模棱两可的分型结果模棱两可结果产生的原因模棱两可结果产生的原因PCR-SBT的模棱两可结果双链测序反应得到的序列是两个等位基因序列的组合测序获得的序列与多种等位基因的组合序列完全匹配有三种情况可能引起模棱两可的结果测序区域未包括这些等位基因核苷酸的区分点A*74:01和A*74:02仅在第1号外显子存在差别(第67位)大多数等位基因未测定全部外显子序列HLA-A*02:08、HLA-A*03:06缺乏第4外显子序列多种等位基因组合在测序区域内具有相同的杂合序列DRB1*03:01:01G+DRB1*13:32、DRB1*03:06+DRB1*13:93和DRB1*03:12+DRB1*13:40的组合在2号外显子表现为完全相同的杂合序列模棱两可结果区分的策略模棱两可结果区分的策略模棱两可结果区分的方法常见及确认等位基因原则（Common alleles and well documented alleles，CWD）结合多种方法结果进行综合判断改用其它厂家的试剂增加测序的范围或杂交的探针数采用单链DNA抽提技术采用单链扩增技术采用组特异性测序引物技术克隆转染后形成单链后检测CWDCWD原则原则 HLA等位基因定义为三大类常见等位基因（Common alleles）指那些在参考群体中频率大于0.001的等位基因确认等位基因（Well-documented alleles）至少在五个独立非亲缘个体中或者三个独立非亲缘个体中并伴有特定的单体型被检测到的等位基因罕见等位基因（Rare alleles)除常见等位基因和确认等位基因以外的所有等位基因它们的频率很低CWDCWD原则原则 CWD原则CWD原则分型中将常见等位基因和确认等位基因合并为CWD,当模棱两可的等位基因组合中出现CWD等位基因可能需要进一步区分，而出现罕见等位基因组合，其临床分型中实际意义有限，可予以排除单链单链DNADNA抽提技术抽提技术单链DNA抽提技术将个体两个等位基因进行分离根据等位基因序列设计生物素标记的特异性探针（仅与某一等位基因互补）探针与标本基因组DNA进行杂交反应杂交后将形成单一等位基因DNA/特异性探针复合物加入链亲和素标记磁珠，将形成单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物洗涤后溶液中只含有单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物单链单链DNADNA抽提技术抽提技术单链分离技术探针结合杂交互补选择性获取单体型商业产品HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA 图为单链抽提图为单链抽提C*01:02后测序的一段序列后测序的一段序列单链扩增技术单链扩增技术该技术原理类似于PCR-SSP选择合适的引物只扩增个体两个等位基因的特定等位基因比对序列设计特异性引物重点在于引物序列TGGCGCCCCGAACCCTCG 图为单链扩增图为单链扩增A*24:02后测序的一段序列后测序的一段序列组特异性测序引物技术组特异性测序引物技术 该技术原理利用特异性引物进行测序反应在测序过程中设计特异性的测序引物该引物只能与某一个等位基因的序列互补该引物测序将得到与引物序列互补的某个特定等位基因的序列A-98T CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA 图为A*02:01,11:01用特异性引物测序后的比较 第四节第四节 粒细胞抗原抗体检测粒细胞抗原抗体检测 重点提示掌握粒细胞抗原、抗体检测血清学诊断方法的原理 粒细胞凝集试验粒细胞免疫荧光试验 流式细胞技术单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验ELISA方法掌握HNA系统基因分型技术原理及其适应范围 PCR限制性片段长度多态性PCR序列特异性引物PCR直接测序法多重SNaPshot 技术粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞凝集试验（GAT方法）分离新鲜的粒细胞在Terasaki微量板上进行实验待测粒细胞与标准抗血清反应后或标准粒细胞与待检血清反应后在显微镜下观察粒细胞凝集情况依据细胞凝集情况来判定抗原或抗体的特性早期建立的方法，操作简单方法灵敏度、特异性都不高HLA抗体和某些高滴度的免疫复合物会导致假阳性结果粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞免疫荧光试验（GIFT）直接法用于检测粒细胞抗原荧光标记的粒细胞抗体与待检粒细胞反应有相应的抗原存在时可形成抗原抗体反应通过荧光显微镜检测荧光的情况间接法用于检测粒细胞抗体或抗原分离出新鲜的粒细胞与待检血清反应存在相应抗体时可形成抗原抗体结合物洗涤后加入荧光标记的抗人IgG反应，继续形成抗原-抗体-荧光标记抗人IgG结合物，洗涤后通过荧光显微镜检测荧光的情况敏感性、特异性均优于GAT法需要荧光显微镜，实验干扰因素较多粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞抗原、抗体检测诊断方法流式细胞技术检测粒细胞抗原或抗体以抗体检测为例阐述其原理将粒细胞与待检血清进行反应存在相应抗体时可形成抗原抗体结合物洗涤后加入荧光标记的抗人IgG-Fc、IgM-Fc继续形成抗原-待检抗体-荧光标记抗人Ig结合物通过流式细胞计数仪检测荧光的情况该方法敏感性、特异性较好粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞抗原、抗体检测诊断方法单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验(MAIGA方法)粒细胞与待检血清反应，存在相应抗体可形成抗原抗体复合物加入特定的单克隆抗体，形成单克隆抗体-抗原-抗体三联复合物细胞裂解离心获取上清液（含三联复合物），将其加入到包被特定抗体的ELISA板微孔内反应，可形成包被抗体-单克隆抗体-粒细胞抗原-待测抗体复合物洗涤后加入酶标记的抗人IgG抗体形成包被抗体-单克隆抗体-粒细胞抗原-待测抗体-酶标抗体复合物显色剂比色分析，根据显色程度判定抗体情况粒细胞抗原、抗体检测诊断方法粒细胞抗原、抗体检测诊断方法ELISA方法特异性单克隆抗体包被的微板加入粒细胞抗原和待检血清反应存在相应抗体可形成包被抗体-抗原-待测抗体复合物加入酶标记的抗人IgG形成包被抗体-抗原-待测抗体-酶标抗体复合物加显色剂进行比色分析根据显色程度判断抗体的有无和强度ELISA方法敏感性和特异性较好HNAHNA系统基因分型技术系统基因分型技术PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)PCR扩增目的DNA片段，产物采用合适的限制性内切酶消化切割成不同大小片段，电泳后进行分辨HNA不同等位基因的酶切图谱不同PCR-RFLP方法简便，分型时间较短已成功用于HNA-4a 和-5a的分型PCR序列特异性引物（PCR-SSP）根据HNA系统等位基因核苷酸碱基序列差异性设计引物引物3端碱基与等位基因的特异性碱基相匹配根据PCR 产物的有无进行等位基因的分型实验室最常用的分子诊断方法文献报道HNA-1、-3、-4和-5系统基因分型的PCR-SSP方法HNAHNA系统基因分型技术系统基因分型技术PCR直接测序法（PCR-SBT）PCR扩增HNA系统目的DNA片段利用双脱氧测序方法对扩增片段进行测序分析根据测序序列指定HNA等位基因PCR-SBT 分型结果准确，可以识别新的突变点已应用于HNA-1、-3、-4和-5系统基因分型多重SNaPshot技术单碱基延伸原理为基础，利用多重PCR对多个SNP 位点进行分型SNaPshot为中等通量SNP分型技术检测费用较PCR-SBT明显降低在同一体系中检测HNA-1、-3、-4和-5系统等位基因本章小结HLA分型技术有血清学方法、细胞学方法和基因分型方法血清学方法常见为微量淋巴细胞毒试验易受抗血清、淋巴细胞、反应温度和时间、补体和判定等影响细胞学分型方法主要包括混合淋巴细胞培养法、纯合分型细胞试验和预致敏淋巴细胞试验基因分型方法检测其基因碱基核苷酸多态性情况常见的方法为PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex技术、PCR-SBT、基因芯片存在模棱两可基因型结果，有多种解决方法CWD指定原则、组特异性测序引物技术和单链扩增技术本章小结HLA抗体检测常见的方法为淋巴细胞毒方法、流式细胞仪方法、ELISA方法、Luminex检测技术粒细胞抗原或抗体血清学方法主要有粒细胞凝集试验、粒细胞免疫荧光试验、单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验、流式细胞技术和ELISA等粒细胞抗原系统基因分型方法常见为PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SBT和多重SNaPshotThank you!