组织标本的处理.ppt

病理检验技术 杀死取材及固定杀死取材及固定病理切片 病理标本的一种。制作时将部分有病变的组织或脏器经过各种化学品和埋藏法的处理，使之固定硬化，在切片机上切成薄片，粘附在玻片上，染以各种颜色，供在显微镜下检查，以观察病理变化，作出病理诊断，为临床诊断和治疗提供帮助。病理诊断的应用通过活体组织检查、脱落和细针穿刺细胞学检查以及尸体剖检，应用形态学的观察方法，并结合临床医学各个分科以及组织化学、免疫组织化学、分子生物学、超微结构和各种形态定量研究等知识和手段，为临床最终提供可靠的诊断依据，确定疾病的性质，查明死亡原因。与其他诊断手段如B超、常规放射、CT、MRI及同位素相比，目前世界各国医学界公认最可信赖、重复性最强、准确性最高的仍然是病理诊断，因为病理诊断报告是明确的疾病名称，临床医师主要根据病理报告决定治疗原则、估计预后以及解释临床症状和明确死亡原因。病理切片制作切片的主要过程有：（1）取材（2）固定（3）脱水（4）包埋（5）切片（6）染色（7）封固。动物致死法麻醉法麻醉法 可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或玻璃瓶内进行麻醉。也可用4%戊巴比妥做静脉注射，剂量一般按动物体重每公斤1ml；或用20%氨基酸乙酯（尿烷或乌拉坦）作腹腔注射，剂量一般按动物每kg5ml。适用于鼠等小动物。空气栓塞法空气栓塞法 如兔可用50ml注射器将空气有耳静脉推入，使动物很快死亡。一般适用于大动物，如兔、犬、猫等动物。动物致死法击头法击头法 如大、小鼠等小动物，可用重物猛击后头部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。断头法断头法 青蛙、小鼠等小动物可用剪刀剪去其头部，如反射尚未消失，则可用探针插入椎管中，破坏脊髓。较大动物如兔等，可用斧头迅速砍头致死。股动脉放血法股动脉放血法 动物经吸收乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。注意事项上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用于血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下部神经分泌物的染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。无论何种致死法，都要求动作迅速，因为动物一旦死亡，其组织与细胞即开始自溶。组织学检查，特别是细胞学观察，要求材料新鲜。怎样取材？取材工具取材工具：取材刀具必须锋利。切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊取标本，以免损害组织造成人为组织变化，给诊断带来困难或导致错诊，漏诊。怎样取材？标本的选取标本的选取：应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm2为佳，厚度以35mm为度，过大过厚会影响对标本的固定，另一方面也影响切片的制作。特殊目的者应属例外。常规活检标本的取材注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的边缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。材料新鲜 最好是动物的心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内。例如：脏器的上皮组织最易变质，应争取在半小时内处理完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。小标本的活检取材常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。它们体积小，因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水，特别是由胃镜、肠镜等所取的组织，取材时一定要滴上伊红，以防止丢失。活检组织多用活检钳夹取。尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下：1 心和大血管 左心室一块，右心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。2 肺 右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。3 肝 右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。4 肾 两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。5 脾、胰、膀胱、胸腺、睾丸或卵巢 各一块6 肾上腺 右、右各一块7 消化道 食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块8 子宫 宫颈和宫体数块9 脑 左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块10 脑下垂体 一块，前叶或包括前后叶取材注意事项取材时对大体标本（肉眼标本）绘制图象，进行仔细描述。包括形状、大小，硬度，颜色，病灶（或可疑病变）部位等。对所取的组织应定位编号。切取镜检组织块后，可将剩余的组织放入70%洒精中保存，这样有利于日后再取材切片时的细胞染色。取材注意事项勿使组织块受挤压勿使组织块受挤压 切取组织块用得刀剪要锋利，切割是不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织、细胞。取材时，组织块可稍取大一点，以便在固定后，将组织块的挤压或损伤部位修去。尽量保持组织的原有形态尽量保持组织的原有形态 新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形；神经、肌肉组织等，则可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。取材注意事项要熟悉取材的部位要熟悉取材的部位 要能准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；脊髓取腰膨大与颈膨大处；肺应取有细支气管即带有软骨片的小支气管部位等。动物品种的选择动物品种的选择 如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片为佳。内耳与胰岛细胞的观察，多取材于豚鼠。欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。取材注意事项选好组织块的切面选好组织块的切面 熟悉某些器官的组织成分，然后决定其切面的走向；纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。如一长管状器官以横切面较好。保持材料的清洁保持材料的清洁 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用PBS或生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。切除不需要的部分切除不需要的部分 特别是组织的脂肪等，应尽可能清除掉，否则将给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。组织固定固定是指将各种组织浸入防腐剂内，使细胞内的物质为不溶性。固定的作用即是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态，且能适于某些研究程序。固定的意义凡是需要制作作病理检验标本的各种组织，无论是制作切片标本，还是制作巨体标本，首先必须固定。在制作切片过程中，固定最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。固定不良在以后制片的任何阶段皆不能补救。因此制片的优劣首先取决于最初固定适当与否。固定的目的和效果 迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。使组织成分对染料有不同的亲和力，经过染色处理后易于辨认。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。使组织块硬化，便于制作薄片。固定剂的选择 理想的固定剂应该具备下列几种性能：1、渗透性强：固定剂必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，不致弥散。2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象。实际上经过固定后的组织，由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然导致组织出现不同程度的收缩或膨胀。因此，良好的固定剂应尽量减少组织发生这类变化。固定剂的选择3、固定剂应该有利组织切片和染色，这其中含有两种意义：(1)固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。例如：重铬酸钾对于类脂质具有一定媒染作用；中性福尔马林比一般福尔马林所固定组织更优于核的染色。(2)固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存下来，以便染色。例如：酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为酒精和二甲苯溶解或较少地溶解，并可用石蜡包埋进行切片。糖原的证明，则宜使用非水溶性固定剂如无水酒精、Camoy氏固定液等。常用的固定剂甲醛水溶液 甲醛与蛋白质是在分子间的交联上起反应，最终产生一种不溶性产物。它经过络合交联，使蛋白质固定，能较好地保存脂类；对肝糖也有固定作用，但必须及时固定及时处理，以免产生水解。甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较小，多用于大块组织固定，如全脑或手术大标本等。固定时间为12-48小时，固定完毕必须经流水冲洗。中性福尔马林（4%甲醛）：甲醛溶液10ml，水 90 ml缓冲福尔马林液：甲醛溶液10ml，1*PBS 90ml4%多聚甲醛：500mlPBS中加入40g多聚甲醛+，加热至60（温度不能太高，防止甲醛逸出），搅拌，同时滴加 0.1N NaOH至澄清，自然冷却后用PBS定容到1000ml，调PH至7.4 常用的固定剂 酒精酒精 具有固定、硬化、脱水等作用，用于固定时以8095%的浓度为好。其渗透力较弱，高浓度能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，故经酒精固定的组织，核的着色不良，不宜于染色的固定。高尔基复合体、线粒体的固定，应避免用酒精。酒精做单纯固定剂时，多用于组织化学中的糖原固定。经酒精固定的标本不需洗涤，可用较高浓度酒精直接进行脱水，也可暂存于70%酒精中。固定的方法小块组织固定法小块组织固定法 从人体或动物取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛的方法。蒸汽固定法蒸汽固定法 比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醇蒸气固定。主要用于血液活细胞涂片以及某些薄膜组织等的固定。如血液涂片，应在血片未干燥前就与锇酸蒸气接触。具体操作：准备培养皿一个，其中滴入12%锇酸水溶液23滴，将血液涂片放置其中。固定30秒钟至1分钟，立即水洗后进行染色，然后封片或其它保存处理。固定的方法注射、灌注固定法注射、灌注固定法 将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身。适用于某些体积较大的组织块或固定液极难渗入的内部。（1）局部灌注固定 如肺可将固定液从气管或支气管注入，眼球则可从眼后房注入固定液。肝、肾等脏器可从肝、肾动脉注入固定液，同时，切断其静脉以便血液排出。脑的固定，须在动物麻醉后，暴露颈动脉，以注射针尖向着头部的方向注入固定液，液体的出口可开在颈静脉或左心房上。（2）全身灌注固定 较大动物如兔、猫、狗、猴及整个人体，往往采用输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血，即输入固定液与放血同时进行。病理检验技术 石蜡包埋技术石蜡包埋技术脱水常用的固定剂中含有很多水分，在石蜡或包埋前，必须用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，再让蜡将该溶剂置换，完成包埋步骤。将组织块内水份置换的过程就叫脱水。脱水剂必须具有在特征：a 能与水按比例混合；b 高浓度，一般指不含水分；c 能与透明剂混合。前二特性能达到逐步除去组织块内的水份，使组织块内的水份全部被脱水剂所取代；后一特性则为下一步骤中的透明剂完全取代组织内的脱水剂创造条件。脱水酒精：是制片最常用的试剂，脱水能力比较强，又能硬化组织。在以酒精作为脱水剂时，应该先从低浓度开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时。组织脱水不尽,随后的透明,浸蜡都会受到影响,较差质量的切片,很容易造成在染色时脱片。脱水将组织和标有编号的小字条一并放入铜网中，一般情况下，组织经过70，80，90，95，无水乙醇的脱水程序，即可达到脱水的要求。透明透明又称媒浸。常用的脱水剂如酒精等，不能溶解石蜡与之相混合，因此必须使用一种既可以同和石蜡相混合的媒剂，当组织脱水后，浸蜡之前将组织投入这种媒剂中。由于两剂能相混合，也由于这种媒剂比酒精比重大，组织中的酒精就被该媒剂取代，待酒精被该媒剂完全取代后，组织即成透明状态，因此我们称这种媒剂为透明剂，在制片中的这一过程就称为透明。透明常用的透明剂有二甲苯、甲苯、苯、香柏油、氯仿、冬青油、苯甲酸甲酯及松节油等。在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般以达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明。、如组织块不能透明，呈白色混浊状态时，则为脱水不彻底，此时需再放入脱水剂中，等彻底脱水后才能透明。浸蜡组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于5460温箱内进行。浸蜡组织浸蜡时间应视组织种类大小和结构不同而异。标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响。厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心，而且厚的组织常带入的透明剂比较多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。包埋包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。石蜡包埋法石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。自动包埋机包埋包埋模、包埋盒、自动包埋机手工包埋组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。待石蜡表面凝固前将标签贴于其上蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。石蜡包埋的注意事项过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求在60左右。包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。