犬猫弓形虫病的诊断及防控.ppt

犬猫弓形虫病的诊断及防控犬猫弓形虫病的诊断及防控主要内容弓形虫病概述弓形虫病的实验室诊断犬猫弓形虫防治刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫。属于孢子虫纲、真球虫目、弓形虫科。因其虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。在弓形虫生活史中有五个不同形态阶段即速殖子、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，其中对人体具致病或传染性的阶段为速殖子、包囊和卵囊。弓形虫病概述弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染而引起的一种呈世界性分布且严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。犬猫可以感染并传播弓形虫病，随着家养宠物逐渐增多，人与宠物密切接触，人群弓形虫的感染率亦逐年上升。全球估计约有三分之一的人口感染，中国（2004年）人群平均感染率亦达到7.88%。弓形虫的生活史 弓形虫的整个生活史发育需要经过2个宿主,猫科动物为终末宿主，人和其他动物为中间宿主。弓形虫病的实验室诊断病原学诊断免疫学诊断分子生物学诊断病原学诊断a 直接涂片或组织切片检查法 将所采集的检查病料直接涂抹或压印在玻片上，用姬氏染液或瑞氏染液染色镜检。发现典型的新月形滋养体或组织包囊可确诊。此法诊断弓形虫病非常准确，但检出率低。b动物接种法 动物接种法即将病料研磨后过滤加PBS或液体病料离心浓缩，取上清腹腔接种幼龄小鼠，观察发病情况。如未获成功，则可采取小鼠的肝、脾、淋巴结及脑等组织制成组织悬液再腹腔接种健康小鼠，如此盲传2-3代，可提高检出率，之后没有发现弓形虫虫体才可以认为阴性。病原学诊断方法简单，结果可靠，但该方法检出率低，耗时长，而且有动物接种法有扩散病原的危险。亦由其特异性和敏感性的原因，常常导致诊断的错误。新的弓形虫病诊断方法主要在于提高敏感性和特异性，以及使操作更为简便、快速。免疫学诊断a 间接血凝实验（IHA）其原理是建立在抗原与抗体特异性结合基础上的。本法具有操作简便、微量、快速、特异、廉价等特点，适合辅助诊断和大规模流行病学调查，也是国内各实验室最常用方法之一。但IHA存在着敏感性不很高，一般不能反应现症感染的缺点。b酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA可检测抗弓形虫的IgM、IgA、IgG、IgE抗体及C抗原(循环抗原)。ELISA用于诊断弓形虫病作了较多研究，衍生出多种方法，如间接ELISA、PPA-ELISA(金萄菌A蛋白-酶联免疫吸附试验)、ABC-ELISA(生物素-亲和素过氧化物酶联免疫吸附试验)、BA-ELISA(亲和素生物素ELISA)、Dot-ELISA (斑点酶联免疫吸附试验)、双夹心ELISA等。目前研究表明ELISA具有敏感性高、特异性强、检测速度较以往的检测方法有了很大提高、受检样本多等特点，然而目前我国弓形虫病诊断试剂盒品种繁杂，质量参差不齐，无统一标准，给弓形虫病的诊断与防治造成严重危害。双抗体夹心ELISA间接ELISA 目前研究表明ELISA具有敏感性高、特异性强、检测速度较以往的检测方法有了很大提高、受检样本多等特点，然而目前我国弓形虫病诊断试剂盒品种繁杂，质量参差不齐，无统一标准，给弓形虫病的诊断与防治造成严重危害。c间接荧光抗体试验（IFAT）是以完整的弓形虫为抗原，采用荧光标记的二抗检测特异 IgM和IgG。IFA具有简便、快速、敏感、特异和重复性强等优点，检测弓形虫表面膜抗原的特异性抗体IgM和 IgG。感染后的第7天至第8天，首先出现IgM，持续数周至数月，如果IgM水平升高，提示有近期感染。分子生物学诊断1核酸分子杂交(DNA探针技术)核酸分子杂交技术是用一定的示踪物对特定基因序列的核酸片段进行标记，通过与待测样本中互补片段的特异性结合来进行诊断。由于核酸分子杂交的高度特异性和检测方法的高度灵敏性，使得该技术成为分子生物学领域内应用最广泛的基本技术之一。20世纪80年代末，DNA探针检测弓形虫病的方法应用较多。从探针来源看，目前用于弓形虫检测的探针多为特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探针，但其制备需要一定条件，费用较高。2 聚合酶链式反应（PCR）PCR是近年来学者们研究的热点之一，已广泛应用于弓形虫DNA的检测，具有敏感、特异、检测迅速等优点。PCR成功与否的关键在于特异而敏感的引物的选取。目前，常用的检测弓形虫的靶基因有P 3O基因、B 1基因、529 bp片段,它们在弓形虫基因组中均具有高度保守的特点。a 多重PCR 多重PCR是为了同时检测几种病原体而在一个反应体系中加入多对引物以扩增不同的DNA片段，操作快速简便。在多重测定中，密切相关的病原体株是由于扩增不同的序列而分开的，所有模板共有序列的引物可为扩增提供阳性对照。b定量竞争性PCR 定量PCR是设计与目的基因有相同引物结合部位(同源性竞争模板)或有不同引物结合部位(异源性竞争模板)的内参照，通过扩增后内参照的DNA产物含量来推算标本中目的DNA或mRNA的含量，是一种定量准确的PCR方法。c 原位PCR 原位PCR是将原位杂交的定位性与PCR的高敏感性结合起来的技术，能在组织切片或细胞涂片上原位对特定 DNA或RNA进行扩增，省略了提取DNA的繁琐步骤，对于样本量少或不能获得较大样本组织的检测提供了一个可行方法。d另外，PCR技术与免疫学检测技术相结合，又出现了PCRELISA及免疫PCR(IPCR)的新技术，具有PCR的灵敏性、核酸杂交的特异性及ELISA的酶联放大作用，故而检测结采更灵敏、更准确。3单克隆抗体技术单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)是用经特异性抗原刺激的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交、融合后分泌的一种单一的特异性抗体。McAb具有高度特异性与同质性，以McAb为探针可对特定靶抗原进行识别、分析，以及鉴定抗原的免疫反应性。McAb作为诊断试剂，虽具有高度特异性，且易于标准化，但由于McAb识别特异性决定簇的特点可能导致缺乏足够敏感性。4基因芯片技术基因芯片(genechip)又称DNA 微阵(DNA mic roa rra y)或DNA 芯片(DNA c hip),它是指按特定排列方式固定有大量基因探针的硅片、玻片或塑料片,借助核酸分子杂交的特性对DNA 样品的序列信息进行高效解读和分析。具有高通量、平行性的特点，可同时对多种疾病进行检测。该技术已在弓形虫致病机理，分析其感染过程宿主基因表达谱等基础研究中广泛应用。犬猫弓形虫防治预防措施a 加强宠物养护知识的培训和宣传，增强群防群治意识 b 加强宠物市场管理及兽医检疫制度建设c 提高自我防护意识不与宠物有过分亲密的接触 d疫苗研究进展弓形虫疫苗种类繁多，具体可分为：全虫疫苗；虫体特异组分疫苗；基因工程疫苗；核酸疫苗。弓形虫病疫苗从最早采用的死虫疫苗已发展到核酸疫苗、基因工程疫苗及活载体疫苗。基因工程疫苗生产过程复杂，技术难度大，生产成本高，免疫活性也不太理想，从而限制了此类疫苗的推广应用。近几年来，核酸疫苗又成为国内外学者新的研究热点。目前，核酸疫苗技术已在利什曼原虫、疟原虫等的疫苗研制中得到尝试及应用，显示出良好的保护作用，而弓形虫核酸疫苗的研制尚处于起步阶段。小结我国宠物数量巨大，宠物弓形虫病研究还刚起步，应加强宠物弓形虫病的调查研究，掌握弓形虫病的流行规律，建立适合于环境污染评价和宠物弓形虫病诊断的新型检测技术，随着弓形虫病原学分子生物学流行病学的深入研究，弓形虫检测技术及疫苗研究的不断发展，对于弓形虫感染途径和预防策略会有更进一步的认识，其感染率可望逐渐下降。