核医学第8章-受体的放射性配基结合分析.ppt

第八章 受体的放射性配基结合分析radioligand binding assay,RBA受受体体:细细胞胞表表面面或或亚亚细细胞胞组组分分中中的的一一种种分分子子，可可以以识识别别并并特特异异地地与与有有生生物物活活性性的的化化学学信信号号物物质质(配配体体)结结合合，从从而而激激活活或或启启动动一一系系列列生生化化反反应应，最最后后导致该信号物质特定的生物效应。导致该信号物质特定的生物效应。迄迄今今为为止止，所所有有已已发发现现的的受受体体都都是是具具有有特特定定氨氨基基酸酸序序列列和和特特定定构构型型的的蛋蛋白白质质。每每一一种种受受体体在在细细胞胞上都有特定的宏观分布和微观分布。上都有特定的宏观分布和微观分布。1.1.概概 论论 一、受体功能一、受体功能1.1.识识别别特特异异的的信信号号物物质质-配配基基，识识别别的的表表现现在在于于两者的特异结合。两者的特异结合。2.2.把把识识别别和和接接受受的的信信号号准准确确无无误误的的放放大大并并传传递递到到细细胞胞内内部部，同同时时启启动动一一系系列列胞胞内内生生化化反反应应，最最后后导导致致特特定定的的细细胞胞反反应应，使使得得胞胞外外信信号号转转换换为为胞内信号。胞内信号。受体接受细胞外的特定信号受体接受细胞外的特定信号 (神经递质、激神经递质、激素、某些药物和毒物等，称为素、某些药物和毒物等，称为配基，配基，ligandligand)，通，通过受体后特定的信号传递系统，引起细胞特定的过受体后特定的信号传递系统，引起细胞特定的生物效应，因此是高等动物适应环境、协调整体生物效应，因此是高等动物适应环境、协调整体各种细胞功能的关键性分子。各种细胞功能的关键性分子。受体及其信号传递系统参与了体内多种生理、受体及其信号传递系统参与了体内多种生理、病理过程，例如肿瘤的生成、免疫应答、补体激病理过程，例如肿瘤的生成、免疫应答、补体激活等。活等。根据在细胞中的定位，把所有的受体分为根据在细胞中的定位，把所有的受体分为:1.膜受体膜受体2.核受体核受体 二、受体的分类:1 1、膜受体：、膜受体：膜受体的分子一般由几条到几十条氨基酸链膜受体的分子一般由几条到几十条氨基酸链组成组成胞膜外胞膜外、胞膜内胞膜内及及跨膜区跨膜区三部分。三部分。配基从细胞的外侧与受体的胞外部分或跨膜配基从细胞的外侧与受体的胞外部分或跨膜部分上特定的结合位点结合，使受体分子发部分上特定的结合位点结合，使受体分子发生构型变化，通过膜内部分将信息传给相应生构型变化，通过膜内部分将信息传给相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。的信息传递机制，引起细胞功能变化。根据膜受体的跨膜结构又可以分为：根据膜受体的跨膜结构又可以分为：a)单链跨膜受体：包括单链跨膜受体：包括酪氨酸激酶型受体酪氨酸激酶型受体，如各，如各种生长因子受体；种生长因子受体；非激酶型受体非激酶型受体，如细胞因子受，如细胞因子受体。体。b)G蛋白偶联受体：受体的氨基酸链蛋白偶联受体：受体的氨基酸链7次跨越细胞次跨越细胞膜，在人体内分布很广泛。膜，在人体内分布很广泛。c)离子通道型受体：受体的几个组成亚单位竖插离子通道型受体：受体的几个组成亚单位竖插入膜，中央形成空隙即为离子通道，如入膜，中央形成空隙即为离子通道，如N-胆碱能胆碱能受体、甘氨酸受体等。受体、甘氨酸受体等。2 2、核受体：、核受体：为一条氨基酸链，可分为四个功能区：为一条氨基酸链，可分为四个功能区：A/BA/B区区:在不同受体中差异最大，主要功能是在不同受体中差异最大，主要功能是选择和激活基因转录。选择和激活基因转录。C C区区:与染色体与染色体DNADNA结合的区域，上面有一定的结合的区域，上面有一定的氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序列列 (称作反应原件称作反应原件,response element),response element)相相结合。结合。D D区区:主要作用是受体在核内的定位。主要作用是受体在核内的定位。E E区区:与配基结合的区，并有转录激活作用。与配基结合的区，并有转录激活作用。受体的亚型受体的亚型受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在一定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，一定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，在生物学上具有不同的效应。在生物学上具有不同的效应。在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同亚型。亚型。例如表皮生长因子受体家族就包括表皮生长因子、例如表皮生长因子受体家族就包括表皮生长因子、HER2、HER3、HER4等四个成员。等四个成员。受体数量：受体数量：占细胞蛋白总量十万之一到百占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分子），一般方法难以分离和测定受体分子。子），一般方法难以分离和测定受体分子。配体：配体：是指能和受体结合并引起相关效应的是指能和受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体结合外本身并无其他功化合物。除了与受体结合外本身并无其他功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是一的功能就是通知细胞在环境中存在一种特通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素殊信号或刺激因素。三、受体与配体的结合三、受体与配体的结合配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠氢键、氢键、离子键与范德华力离子键与范德华力的作用，随着两种分子空间结构互的作用，随着两种分子空间结构互补程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用补程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此力就会大大增加，因此分子空间结构的互补性是特异分子空间结构的互补性是特异结合的主要因素结合的主要因素。同同一一配配体体可可能能有有两两种种或或两两种种以以上上的的不不同同受受体体，例例如如乙乙酰酰胆胆碱碱有有烟烟碱碱型型和和毒毒蕈蕈型型两两种种受受体体。同同一一配配体体与与不不同同类类型型受受体体结结合合会会产产生生不不同同的的细细胞胞反反应应，如如AchAch可可以以使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。配体可以是神经递质、激素、某些药物等。配体可以是神经递质、激素、某些药物等。四、受体与配基结合的特性1 1、可饱和性、可饱和性(saturabilitysaturability)：每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋饱和。的配基将渐趋饱和。2 2、可逆性：、可逆性：如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余的放射配基移去的放射配基移去(例如淋洗或透析例如淋洗或透析)，则放射配基，则放射配基与受体的复合物会逐步解离，亦即这种结合是可与受体的复合物会逐步解离，亦即这种结合是可逆反应。逆反应。如果向反应系统中加入大量非标记配基，使其如果向反应系统中加入大量非标记配基，使其浓度远高于放射配基，则将取代大部分原已结合浓度远高于放射配基，则将取代大部分原已结合的放射配基，使放射性复合物减少的放射配基，使放射性复合物减少,也说明配基也说明配基与受体的结合是可逆的。与受体的结合是可逆的。解离后的配基是原形，不起代谢变化。解离后的配基是原形，不起代谢变化。3 3、特异性和亲和性：、特异性和亲和性：受受体体的的特特异异性性：受受体体具具有有特特异异识识别别配配基基的的性性能能，因因此此只只有有严严格格构构型型和和构构象象的的配配基基分分子子才才能能选选择择性性地地与受体结合。与受体结合。受受体体的的特特异异性性还还表表现现在在器器官官或或组组织织（靶靶器器官官）的的专专一一性性上上，如如雌雌激激素素对对子子宫宫等等器器官官有有兴兴奋奋作作用用，这这是是因因为为这这些些器器官官上上雌雌激激素素受受体体的的数数量量明明显显高高于于其其它它器官。器官。受受体体的的亲亲和和性性是是指指受受体体和和配配基基的的结结合合能能力力，受受体体亲和性高就说明受体和配基结合牢固，不容易解离。亲和性高就说明受体和配基结合牢固，不容易解离。4 4、与效应的一致性：、与效应的一致性：受受体体的的主主要要功功能能是是介介导导配配体体的的生生物物效效应应，如如果果一一种种蛋蛋白白能能与与某某种种物物质质结结合合而而不不介介导导特特定定的的生生物物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。效应，那么这种蛋白不能称之为受体。配配体体与与受受体体结结合合后后，引引起起阳阳性性生生理理效效应应，称称为为激动剂激动剂。配配体体与与受受体体结结合合后后，阻阻断断内内源源性性配配基基的的阳阳性性生生理作用，称为理作用，称为拮抗剂或阻断剂拮抗剂或阻断剂。五、受体的生理调节 正正常常生生理理状状态态下下的的受受体体处处在在一一个个不不断断合合成成与与降降解解的的动动态态平平衡衡中中，但但其其数数量量和和亲亲和和性性也也会会因因疾疾病病、药物作用而发生变化。药物作用而发生变化。1、向下调节、向下调节(down-regulation)细细胞胞所所处处环环境境中中某某种种激激动动剂剂浓浓度度增增高高或或长长期期作作用用，结结果果使使其其相相应应受受体体的的数数量量减减少少，并并出出现现受受体体对此物质的敏感性下降或耐受性增高等现象。对此物质的敏感性下降或耐受性增高等现象。如如哮哮喘喘病病人人长长期期服服用用-激激动动剂剂产产生生耐耐受受性性增增高高，即药效减弱。即药效减弱。2、向上调节、向上调节(up-regulation)细细胞胞所所处处环环境境中中某某种种拮拮抗抗剂剂的的浓浓度度过过高高或或长长期期作作用用，结结果果会会使使受受体体数数量量增增高高，出出现现受受体体敏敏感感性性增高，表现为增敏或撤药后反跳现象。增高，表现为增敏或撤药后反跳现象。如如高高血血压压病病人人长长期期服服用用心心得得安安，若若突突然然停停药药，可出现血压升高的反跳现象。可出现血压升高的反跳现象。由由于于受受体体在在整整体体条条件件下下，随随机机体体状状态态变变化化，会会出出现现生生理理调调节节，因因此此对对受受体体数数量量和和亲亲和和性性测测定定就就成为研究病理变化和评价药效的重要内容。成为研究病理变化和评价药效的重要内容。六、受体与疾病 遗传缺陷与免疫异常遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因为受体性疾病的常见原因 1 1、基基因因突突变变致致使使受受体体异异常常，引引发发功功能能障障碍碍，绝绝大大多多数数是是功功能能降降低低或或完完全全丧丧失失，有有家家族族史史，病病情情严严重重。如如睾睾酮酮受受体体基基因因突突变变致致该该受受体体缺缺陷引起睾丸完全雌性化病。陷引起睾丸完全雌性化病。2 2、机机体体对对受受体体产产生生自自身身抗抗体体，激激动动（如如GravesGraves综综合合症症患患者者产产生生TSHTSH受受体体抗抗体体，直直接接持持续续激激动动甲甲状状腺腺TSHTSH受受体体）或或阻阻断断（如如重重症症肌肌无无力力患患者产生者产生N-AchN-Ach受体抗体，占领但不激动受体）受体。受体抗体，占领但不激动受体）受体。3 3、某某些些病病有有受受体体异异常常，非非原原始始发发病病环环节节，为为发发病病重重要要环环节节，采采取取针针对对措措施施可可控控制制病病情情。甲甲亢亢用用肾肾上上腺腺素素阻阻断断剂剂，哮哮喘喘用用肾肾上上腺腺素素激动剂。激动剂。4 4、受受体体与与肿肿瘤瘤：某某些些受受体体基基因因可可突突变变成成为为癌癌基基因因，引引发发肿肿瘤瘤；激激素素受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案（乳腺癌，白血病）。受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案（乳腺癌，白血病）。2.受体-配基结合反应的基本原理 RBA(radioligand binding assay)的的基基本本原原理理与与IRMA基基本本相相同同，应应用用放放射射性性标标记记配配体体，在在一一定定条条件件下下与与受受体体（R）结结合合成成配配体体与与受受体体复复合合物物（R*L），分分离离并并测测定定R*L的的放放射射性性，然然后后经经数数据据处处理理，对对受受体体的的性性质质进进行行定定性性和和定定量的分析。量的分析。1.定性定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。2.定量定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。离常数或结合位点数（最大结合容量）。RBA的优点：的优点：1.高灵敏度：高比活度的配基和高亲和力的受体反高灵敏度：高比活度的配基和高亲和力的受体反应必然会产生高灵敏度的分析技术。应必然会产生高灵敏度的分析技术。RBA的灵敏的灵敏度可以达到度可以达到10-15mol/l；2.特异性强：受体和配基的结合特异性和专一性保特异性强：受体和配基的结合特异性和专一性保证了方法的特异性证了方法的特异性;3.受体制剂的多样性：同一组织或细胞上有多种受受体制剂的多样性：同一组织或细胞上有多种受体，因此某种组织或细胞制剂可以用多种配基做体，因此某种组织或细胞制剂可以用多种配基做受体分析；受体分析；4.动物受体和人的受体存在相容性，在动物上获得动物受体和人的受体存在相容性，在动物上获得的知识，多数可以用于人类。的知识，多数可以用于人类。(一一)简单单点系统受体与配基相互结合的简单单点系统受体与配基相互结合的基本规律基本规律 简简单单单单位位点点系系统统：对对某某种种受受体体而而言言，其其所所有有的的受受体体具具有有完完全全相相同同的的结结合合特特异异性性和和生生理理效效应应，且且所所有有受受体体都都只只有有一一个个结结合合位位点点，以以1 1：1 1的的关关系系与与配配基基结合，不表现明显的正负协同效应。结合，不表现明显的正负协同效应。有有时时，一一个个受受体体系系统统中中存存在在两两(多多)种种亚亚型型，但但结结合合的的配配基基无无选选择择性性，尽尽管管亚亚型型的的生生物物效效应应可可能能不不全全相相同同，结结合合反反应应却却表表现现出出完完全全相相同同的的特特征征，这这时时，也可作为单位点系统来看待。也可作为单位点系统来看待。将上式展开重排，得到将上式展开重排，得到可可以以看看出出，RL(RL(复复合合物物浓浓度度)和和LT(LT(配配基基总总浓浓度度)并非线性关系，而是曲线关系。并非线性关系，而是曲线关系。对对一一定定数数量量(RT(RT(受受体体总总浓浓度度)固固定定)和和一一定定亲亲和和力力(KD(KD固固定定)的的受受体体来来说说，配配基基浓浓度度从从零零开开始始上上升升时时，复复合合物物浓浓度度先先是是上上升升很很快快，以以后后逐逐渐渐变变慢慢，最最后后绝绝大大多多数数受受体体都都变变为为复复合合物物，也也就就是是受受体体被被饱饱和和了了。这这就就是饱和曲线。是饱和曲线。曲线的高度曲线的高度主要反映受体的数主要反映受体的数量多少，受体越多，曲线高度量多少，受体越多，曲线高度越高；越高；曲线上升的快慢曲线上升的快慢取决于配基与受取决于配基与受体的亲和力，所以，体的亲和力，所以，KDKD越小越小(亲和亲和力越大力越大)，饱和曲线上升越快，饱和曲线上升越快，KDKD越大越大(亲和力越小亲和力越小)，饱和曲线上，饱和曲线上升越慢。升越慢。(二二)Scatchard作作图图：将将改写成改写成在绘制饱和曲线时，以复合物浓度在绘制饱和曲线时，以复合物浓度RL为横为横坐标，以复合物和游离配基的浓度比值坐标，以复合物和游离配基的浓度比值RL/L 为纵坐标，则对简单单位点系统来为纵坐标，则对简单单位点系统来说，将得到一条逐渐下降的直线。说，将得到一条逐渐下降的直线。Scatchard作图作图目前，目前，Scatchard作图主要用于定性，即判断是否简单单作图主要用于定性，即判断是否简单单位点，还是有其它复杂情况。例如同一系统中同一种受体位点，还是有其它复杂情况。例如同一系统中同一种受体有两种以上亲和力的亚型，或者受体有正协同或负协同作有两种以上亲和力的亚型，或者受体有正协同或负协同作用用(Scatchard作图呈曲线作图呈曲线)（三）正负协同作用（三）正负协同作用 当当一一部部分分受受体体与与配配基基结结合合后后使使相相邻邻的的受受体体的的亲亲和和力力发发生生改改变变，倘倘若若亲亲和和力力逐逐步步下下降降，称称之之为为负负协协同同作作用用如如曲曲线线(2)(2)，亲亲和和力力逐逐步步增增大大，称称之之为为正正协协同同作作用用如如曲线曲线(3)(3)。负协同正协同（四）非特异（四）非特异结结合（合（non-specific binding，NSB）上上述述饱饱和和曲曲线线是是受受体体与与配配基基的的特特异异结结合合形形成成的的。这这种种结结合合的的特特点点是是低低容容量量和和高高亲亲和和力力，所所以以容容易易饱饱和和。但但是是，任任何何受受体体标标本本除除特特异异结结合合外外，还还会会有有一一部部分分非非特特异异结结合合，当当分分离离特特异异结结合合的的复复合合物物测测量量放放射射性性时时，这这部部分分非非特特异异结结合合的的放放射射性性混混在在一一起起，测测到到的的是是总总放放射射性性(total binding,TB)，必必需需先先减减去去非非特特异异结结合合(NSB)，才才能能得得到到特特异异结结合合(specific binding,SB)的放射性。的放射性。NSBNSB主主要要来来自自杂杂蛋蛋白白，反反应应器器壁壁，分分离离材材料料的的吸吸附附，它它的的特特点点是是，容容量量很很大大，而而亲亲和和力力低低，因因此此在在一一般般情情况况下下不不被被饱饱和和，也也就就是是随随着着配配基基浓浓度度的的升升高高，它它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线。不呈饱和曲线，而是一条上升的直线。（五）受体与配基反应的动力学（五）受体与配基反应的动力学（kineticskinetics）受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，这种快速结合和快速解离对保证受体的解离也很快，这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。迅速反应有很重要的意义。大量非标记配基（六）竞争性取代反应（六）竞争性取代反应 在在一一个个受受体体和和放放射射配配基基的的反反应应系系统统中中加加入入另另一一个个化化合合物物，它它若若能能和和受受体体的的结结合合位位点点结结合合，则则会会与与放放射射配配基基竞竞争争与与受受体体结结合合，最最终终将将表表现现为为放放射射配配基基与与受受体体形形成成复复合合物物的的能能力力降降低低，但但受受体体数数量量不不变变,所所以以叫叫竞竞争争性性取取代代反反应应。此此时时，非非标标记记的的起起竞竞争争作作用用的的配配基基称称为为竞竞争争剂剂,它它们们和和受受体体结结合合后后不改变受体分子的结构。不改变受体分子的结构。表示竞争剂抑制作用强弱的指标：表示竞争剂抑制作用强弱的指标：IC50值和值和KI。IC50值值：指指抑抑制制50受受体体与与放放射射配配基基结结合合所所需需竞竞争剂的浓度，争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。值大，表明竞争剂抑制作用小。KI：竞竞争争剂剂的的平平衡衡解解离离常常数数，KI越越小小，表表明明竞竞争争剂抑制作用越大。剂抑制作用越大。二、双（多）位点系统二、双（多）位点系统一一种种配配基基可可以以和和两两种种以以上上的的受受体体亚亚型型结结合合，每每种亚型都有相应的种亚型都有相应的KDKD值（自学）。值（自学）。3.受体放射分析的基本方法RBA的方法学：的方法学：一般一般RBA分析都是以求得样品中的受体数量分析都是以求得样品中的受体数量RT为为目的。目的。用定量的受体制剂与大量的标记配基反应，使受体用定量的受体制剂与大量的标记配基反应，使受体得以饱和。分离受体得以饱和。分离受体-标记配基复合物，测量其放射标记配基复合物，测量其放射性。根据复合物的放射性计算受体的结合容量或结性。根据复合物的放射性计算受体的结合容量或结合位点数。合位点数。离体离体RBARBA基本方法的流程为基本方法的流程为：一、受体标本的制备一、受体标本的制备 在在受受体体结结合合实实验验的的研研究究中中，所所用用的的受受体体材材料料可可以以是是组组织织切切片片，也也可可以以是是完完整整的的单单层层培培养养细细胞胞或或游游离离活活细细胞胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。（一）组织切片（一）组织切片冷冷冻冻组组织织切切片片常常用用明明胶胶粘粘贴贴于于玻玻片片上上，在在温温育育缓缓冲冲液液中中与与标标记记配配基基进进行行反反应应。反反应应后后用用缓缓冲冲液液洗洗几几次次即即可可，切切片片厚厚度度一一般般为为5-50m。用用组组织织切切片片的的目目的的更更多多是是研研究究受受体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。（二）游离的完整细胞悬液（二）游离的完整细胞悬液完完整整的的活活细细胞胞可可以以是是血血细细胞胞，培培养养的的单单层层细细胞胞，肿肿瘤瘤的的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。使用完整细胞的优点：使用完整细胞的优点：1、受受体体处处于于原原有有的的正正常常环环境境中中。膜膜未未受受扰扰乱乱，膜膜内内pH、离离子子梯梯度度也也保保存存着着。受受体体与与其其相相连连的的效效应应系系统统（如如G蛋蛋白）也保存完好。白）也保存完好。2、在在受受体体功功能能反反应应完完全全的的情情况况下下研研究究受受体体，可可以以同同时时观观察察配配基基与与受受体体结结合合的的情情况况和和细细胞胞的的生生物物效效应应。所所得得的的结果更能反映受体的生理特点。结果更能反映受体的生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞的受体数、能直接给出平均每一个细胞的受体数。注意点：注意点：1.完完整整细细胞胞的的受受体体分分析析必必须须尽尽可可能能选选用用不不易易穿穿透透细细胞胞膜膜双双层层磷磷脂脂的的标标记记物物，否否则则由由于于游游离离配基进入细胞内可引起较大误差。配基进入细胞内可引起较大误差。2.此此外外，还还必必须须注注意意防防止止操操作作过过程程中中可可能能导导致致细细胞胞表表面面生生理理活活性性的的改改变变。如如，完完整整细细胞胞的的膜膜受受体体在在37时时会会发发生生受受体体入入内内化化现现象象，这这会会破破坏坏结结合合反反应应的的平平衡衡状状态态，导导致致测测定定的的KD值值不不正正确确，如如80%EGF受受体体入入内内化化，而而在在4则可阻止入内化。则可阻止入内化。（三）亚细胞组分（三）亚细胞组分 大大多多数数受受体体的的RBA需需经经差差速速离离心心法法分分成成胞胞膜膜、胞胞浆、胞核，取所需组分进行分析。浆、胞核，取所需组分进行分析。其优点是：其优点是：1.除除去去大大部部分分杂杂蛋蛋白白和和内内源源性性配配基基，减减少少NSB或或其其它干扰因素；它干扰因素；2.受受体体蛋蛋白白得得到到初初步步浓浓缩缩，使使富富集集的的受受体体制制剂剂获获得得可靠的分析结果。可靠的分析结果。亚亚细细胞胞组组分分的的分分离离一一般般都都采采用用差差速速离离心心法法。一一般般先先制制成成匀匀浆浆，再再在在含含0.250.250.3mol/L0.3mol/L蔗蔗糖糖缓缓冲冲液液中中先先后后以以不不同同离心力进行离心，分离不同的亚细胞组分。离心力进行离心，分离不同的亚细胞组分。实验过程应注意：实验过程应注意：1.全部过程在全部过程在4下进行操作，以保证受体标本的结下进行操作，以保证受体标本的结合活性；合活性；2.制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它值及其它物质（如物质（如 EDTA，Mg2）应严格控制。）应严格控制。3.为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。剂。二、放射性配基的选择二、放射性配基的选择 制制备备优优良良的的放放射射性性配配基基是是受受体体结结合合试试验验的的首首要要条条件件。对对任任何何一一种种受受体体系系统统，通通常常都都有有好好几几种种标标记记配配基基可可供供选选择择。选选择择应应从从两两方方面面考考虑虑：配基的特性；配基的特性；实验目的。实验目的。（一）对放射性配基的基本要求（一）对放射性配基的基本要求1、高高比比活活度度：组组织织细细胞胞内内的的受受体体浓浓度度一一般般都都很很低低，约约104-105个个/细细胞胞，或或0.01-1.0 pmol/mg蛋蛋白白的的水水平平，低低比比活活度度的的配配基基难难于于达达到到分分析析灵灵敏敏度度的的要要求求。一般要求比活度在一般要求比活度在3.71011 Bq/mmol以上。以上。2、高亲和力、高亲和力:a)可以减少标记配基用量可以减少标记配基用量b)放放射射性性配配基基与与受受体体的的结结合合物物解解离离较较慢慢，有有利利于于结合和游离配基的分离。结合和游离配基的分离。3 3、高高特特异异性性:即即该该配配基基与与所所研研究究受受体体有有选选择择性性结结合合，理理想想的的是是该该配配基基只只与与一一种种受受体体或或受受体体亚亚型型结结合合。但但没没有有一一种种配配基基是是完完全全选选择择性性的的，所所以以要要结结合合实实验验研研究究的的目目的的，选择对某一受体或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。选择对某一受体或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。4 4、高的稳定性及放化纯度、高的稳定性及放化纯度:包括标记的稳定性、贮包括标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性。具有藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性。具有95%95%以上以上的放化纯度。的放化纯度。总的来说总的来说,配基的选择要根据实验目来定。配基的选择要根据实验目来定。目目前前，用用作作受受体体放放射射分分析析的的放放射射性性配配基基多多用用3 3H H、125125I I标记。标记。3 3H H标标记记配配基基与与原原型型配配基基为为同同型型式式，生生物物学学活活性性好好，多多数数情情况况下下比比活活度度也也能能达达到到要要求求，且且半半衰衰期期长长，使使用用方方便便，主主要要缺缺点点是是需需用用液液闪闪测测量量，操操作作较较麻麻烦烦，一一般般实验室不能进行标记。实验室不能进行标记。多多肽肽及及蛋蛋白白质质配配基基多多用用125125I I标标记记，其其优优点点是是可可以以达达到到较较高高的的比比活活度度。只只要要很很好好掌掌握握标标记记条条件件，仍仍能能保保持持较较好好的的生生物物活活性性。另另外外，碘碘标标记记法法快快速速、方方便便、经经济济，一般实验室可进行。一般实验室可进行。（二）放射性配基的质量鉴定（二）放射性配基的质量鉴定 1 1、放射化学纯度、放射化学纯度:除新鲜产品外除新鲜产品外,存放一定时间存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在的准确性。一般要求放化纯度应在9595以上。以上。2 2、结合活性鉴定、结合活性鉴定 3 3、比活度：、比活度：受体结合分析的结果计算离不开准确受体结合分析的结果计算离不开准确的比活度数据。的比活度数据。三、受体放射分析的类型三、受体放射分析的类型 （一）标记配基饱和法（一）标记配基饱和法1 1、单单点点饱饱和和法法：定定量量受受体体制制剂剂加加大大量量的的标标记记配配基基使使受受体体得得以以饱饱和和结结合合。根根据据受受体体-配配基基复复合合物物的的放放射射性性计计算算受受体体结结合合容容量量（或或结结合合位位点点数数）。这这种种方方法法操操作作简简便便、标标本本用用量量少少。但但只只凭凭单单点点实实验验数数据据计计算算受受体体结结合合容容量量，比比多多点点法法的的结结果果略略低低，不不能给出能给出KDKD，误差也相对大些。，误差也相对大些。2 2、多多点点饱饱和和法法：一一定定量量的的受受体体制制剂剂，逐逐步步增增加加标标记记配配基基的的量量（一一般般7-87-8个个实实验验点点），使使受受体体的的结结合合趋趋于于饱饱和和。用用曲曲线线拟拟合合法法或或直直线线拟拟合合法法计计算算受受体体结结合合容容量量和和亲亲和和力力（RTRT、KDKD），结结果果可可靠靠性性高高。但但受受体体标标本本、标标记记配配基基用用量量大，工作量大。大，工作量大。（二）非标记配基饱和法（二）非标记配基饱和法 一一定定量量的的受受体体和和标标记记配配基基，逐逐渐渐增增加加非非标标记记配配基基（一一般般7 78 8个个实实验验点点），使使受受体体饱饱和和结结合合，曲曲线线拟拟合合法法或或直直线线拟拟合合法法计计算算受受体体结结合合容容量和亲和力。量和亲和力。这这种种方方法法克克服服了了多多点点饱饱和和法法标标记记配配基基用用量量大大的的缺缺点点，但但由由于于非非标标记记配配基基的的用用量量逐逐渐渐加加大大，放放射射性性逐逐步步减减少少，必必需需标标记记配配基基比比活活度度较较高高才才能得到满意结果。能得到满意结果。四、分析条件的选择四、分析条件的选择（一）标记配基浓度（一）标记配基浓度 试试验验类类型型不不同同，选选用用的的标标记记配配基基浓浓度度也也有有不不同同。单单点点饱饱和和试试验验要要求求饱饱和和量量的的标标记记配配基基。对对于于多多点点饱饱和和试试验验，应应尽尽可可能能覆覆盖盖饱饱和和区区及及非非饱饱和和区区，还还应应考考虑虑最最低低一一点点有有足足够够的的放放射射性性满满足足放放射射性性测测量量统统计计上上的的要要求求，最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源及价格。最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源及价格。（二二）受受体体浓浓度度 一一般般说说在在一一定定范范围围内内受受体体结结合合位位点点随随组组织织量量的的增增加加而而增增加加，特特异异性性结结合合量量与与组组织织浓浓度度成成线线性性关关系系。在在线线性性范范围围内内，较较高高受受体体浓浓度度，有有时时可可增增加加特特异异性性结结合合与与非非特特异异性性结结合合的的比比值值，有有人人提提出出，受受体体浓浓度度应应选选为为约约相相当当于于KDKD值值。在在实实践践中中，往往往往需需要要通过实验来确定受体浓度。通过实验来确定受体浓度。（三）温育温度与时间（三）温育温度与时间 温温度度是是影影响响反反应应速速率率的的重重要要因因素素。温温度度高高，结结合合快快，达达到到反反应应平平衡衡时时间间短短，温温度度低低，反反应应终终止止时时容容易易降降温温，减减少少分分离离过过程程中中复复合合物物的的解解离离。另另外外，温温度度低低对对配配基基及及受受体体的的稳稳定定性性有有利利。不不同同受受体体结结合合系统的最佳温度和时间要经过试验选定。系统的最佳温度和时间要经过试验选定。对对于于饱饱和和或或竞竞争争取取代代试试验验，应应要要求求反反应应达达到到平平衡衡，故故温温育育时时间间应应足足够够长长以以达达到到平平衡衡状状态态。温温育育温温度度与与平平衡衡时时间间是是紧紧密密相相关关的的，不不同同的的受受体体结结合合系系统统的的反反应应平平衡衡时时间间因因亲亲和和力力、温温育育温温度度、配配基基及及受受体体浓浓度度的的不不同同而而不不同同。一一般般室室温温（2222）操操作作比比较较方方便便。00温温育育平平衡衡时时间间虽虽然然长长一一些些，但但其其结结果果之之重重复复性更好。性更好。（四）缓冲液（四）缓冲液 结结合合分分析析使使用用过过多多种种缓缓冲冲液液，如如磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，TrisTris-HCI-HCI缓缓冲冲液液等等，所所选选缓缓冲冲液液应应不不干干扰扰结结合合，并并在在较较大大范范围围内内可可稳稳定定pHpH。一一般般说说，结结合合分分析析的的pHpH应应处于生理范围，即处于生理范围，即pH=7-8pH=7-8。钠钠、镁镁等等离离子子在在不不同同的的受受体体系系统统中中会会有有不不同同的的影影响响。因因此此要要根根据据具具体体目目的的决决定定选选用用与与否否。如如果果加加入入的的受受体体蛋蛋白白量量较较少少时时，宜宜在在缓缓冲冲液液加加入入适适量量蛋蛋白白，使反应液内蛋白浓度为使反应液内蛋白浓度为0.1mg-1mg/ml0.1mg-1mg/ml为好。为好。为为了了阻阻止止肽肽类类的的降降解解，常常在在分分析析时时加加入入各各种种肽肽酶酶抑抑制制剂剂。但但要要视视具具体体是是哪哪种种肽肽而而定定，以以确确保保实实际际有有效效。因因为为有有些些蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂有有抑抑制制特特异异性性结结合合的的作用。作用。五、结合体与游离配基的分离五、结合体与游离配基的分离 受受体体-配配基基结结合合分分析析主主要要是是测测定定反反应应平平衡衡时时结结合合配配基基的的量量，求求解解受受体体的的密密度度与与平平衡衡解解离离常常数数。反反应应一一般般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。理理论论上上，一一经经分分离离，反反应应的的平平衡衡就就会会被被破破坏坏，所所以以选选择择适适当当的的分分离离方方法法和和环环境境，使使受受体体-配配基基复复合合物物在在分分离离过过程程中中的的解解离离减减少少到到最最低低限限度度。低低温温是是降降低低解解离离的的最有效手段，分离快慢也是重要因素。最有效手段，分离快慢也是重要因素。常常用用的的分分离离方方法法有有离离心心法法、滤滤膜膜法法、吸吸附附法法、透透析析法法、电电泳泳法法等等。若若复复合合物物解解离离快快，则则只只能能选选择择快快速速的的分分离离方方法法。同同时时一一定定要要在在分分离离时时间间，分分离离温温度度等等方方面面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。保持各样品管之间的一致性，以减少误差。（一）抽滤法（滤膜法）（一）抽滤法（滤膜法）1 1、选用的滤膜材料：、选用的滤膜材料：既能阻挡复合物又不要过多产生对既能阻挡复合物又不要过多产生对 游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维 滤膜。滤膜。2 2、影响因素、影响因素 （1 1）复合物的解离：一般说，低温时解离较慢，故滤膜）复合物的解离：一般说，低温时解离较慢，故滤膜 及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。（2 2）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性 （3 3）标记配基对滤膜的吸附：标记配基吸附于滤膜是抽）标记配基对滤膜的吸附：标记配基吸附于滤膜是抽 滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要 缺点，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：缺点，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：滤膜预先滤膜预先 用非标记配基浸泡；用非标记配基浸泡；如果是多肽或蛋白标记配基，用如果是多肽或蛋白标记配基，用 1 1白蛋白浸泡；白蛋白浸泡；用一定量的淋洗液或保证一