T∕CI 004-2022 高麦黄酮小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标和测定方法.pdf

ICS 67.060CCS B21!#$!#$%&(%()*+,-*./0123*+,45*+,6789:;Content index and determination method of tricin and total wheat flavonoid in highwheat flavonoid variety(%(?(?AB(%(?(?CD0EEFGHIJKAAABBB全国团体标准信息平台!#$%&(%(1L MNNN OOO.2PPP OOO.3Q Q Q RSRSRS.42 TRUPVWXTRUPVWXTRUPVWX.43 YZ4YZ4YZ4;=;=.54.1 籽粒中酮含量的测定法.54.1.1 原理.54.1.2 试剂.54.1.3 溶液配制.54.1.4 标准溶液配制.54.1.5 仪器和设备.54.1.6 试样制备与保存.64.1.7 准备步骤.64.1.8 测定.64.1.9 平试验.84.1.10 空试验.84.1.11 结果计算和表述.84.1.12 精密度.84.1.13 定量限和回收率.94.2 总酮含量的测定法.94.2.1 原理.94.2.2 试剂和材料.94.2.3 溶液配制.94.2.4 标准溶液配制.94.2.5 仪器和设备.94.2.6 标准曲线的制作.104.2.7 试样制备与保存.104.2.8 准备步骤.104.2.9 结果计算和表述.104.2.10 精密度.10全国团体标准信息平台!#$%&(%(2N O本件按照 GB/T1.1-2020标准化作导则第 1部分：标准化件的结构和起草规则起草。某些内容可能涉及专利，本件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本件由中国国际科技促进会标准化作委员会提出。本件由中国国际科技促进会归。本件起草单位：东国仓健物科技有限公司，东华农业科技有限公司，东农业学，泰安市农业科学院，解放军总医院普通外科学部，东天泽泰种业科技有限公司，莱州宏源粉有限公司，泰安市园品有限公司。本件主要起草：胥倩、纪春、刘振、王群、王振、邓志英、于海霞、彭莉、郑铮、由佳辉、磊，杨明、王延训、赵善仓、吕全、谢秀伦。本件为次发布，今后将根据酮的社会需求和游离态酮及总检测技术发展情况适时修订。全国团体标准信息平台!#$%&(%(3PPP OOO随着社会经济发展，全球农业研究热点也聚于探寻农业、营养、健康的关系，农作物品种也有了新需求。2017 年国家主要农作物品种审定标准（国品审【2017】1号）次在产品种、绿优质品种之后提出特殊途品种的新类型，使我国的农作物育种导向发了重变，作为殊途品种类型的功能性迎来了所未有的发展机遇。酮新品种就是种常重要的特殊途功能。酮类物质属多酚类合物，具有扩张管、抗菌消炎和增强体免疫等多重功。常中摄的酮类合物能减少症和脏病等疾病的发病率。近年来，国内外多个研究团队开展了酮的育种、鉴定技术研究。农业学品质育种团队，以赵善仓博（2003 届）论为标志，开始了酮的研究。经近 20 年攻关，于 2020 年育成我国个审定的酮新品种农 101（鲁审20206035），总酮含量 1.013 mg/kg，新华社、科技报等媒体均已“国内个功能性品种通过审定”进了报道。 国内外今仍没有酮品种的定义和酮含量指标，其检测法也统标准。因此，本标准对游离态酮、总酮及酮的术语、定义、围和籽粒中游离态酮及总酮含量指标进科学确定，对籽粒及制品中游离酮和总酮的测定法进统规，有利于培育更好的酮新品种。在满群众对活质量和健康平的新需求，确我国营养导向型农业的健康发展具有重意义。全国团体标准信息平台!#$%&(%(4)*+,-*./0123*+,45*+,6789:;Q RS本件规定了游离态酮、总酮、酮的术语、定义和游离态酮含量、总酮含量指标及其检测法。本件适于籽粒中游离态酮及总酮含量的定量测定。企业在制定企业标准时可参照使，相关机构在选育、审定和应酮及其制品时可参照使。( TRUPVWX下列件中的内容通过中的规范性引构成本件必不可少的条款。其中，注期的引件，仅该期对应的版本适于本件；凡是不注期的引件，其最新版本（包括所有的修改单）适于本件。GB/T6682 分析实验室规格和试验法GB/T603 化学试剂试验法中所制剂及制品的制备GB 1351 GB/T1355 粉GB/T6041 质谱分析法通则GB/T16631 效液相谱法通则GB/Z 35959 液相谱-质谱联分析法通则GB/T20574 蜂胶中总酮含量的测定法 分光光度法 YZ44.1 -*./0*+,67的; )效相_-串a_4.1.1 原理试样80%醇溶液提取，经离浓缩后复溶，液相谱串联质谱仪检测，外标法定量。4.1.2 试剂除另有规定外，应符合GB/T6682中规定的级。4.1.2.1 醇(CH3CH2OH，CAS号：64-17-5)：谱纯。4.1.2.2 甲醇(CH3OH，CAS号：67-56-1)：谱纯。4.1.2.3 甲酸(HCOOH，CAS号：64-18-6)：谱纯。4.1.2.4 标准品(酮，Tricin，520-32-1)：纯度95.0。4.1.3 溶配制4.1.3.180%醇溶液：取800mL醇，加200mL，摇匀备。4.1.3.20.1%甲酸溶液：取1000mL，加1mL甲酸，摇匀备。4.1.4 9准溶配制4.1.4.1 标准储备溶液分别称取5mg标准物质于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容刻度，标准溶液避光-40保存，保存期为年。4.1.4.2 材料微孔过滤膜（尼）：0.22m。4.1.5 仪器:设备4.1.5.1 液相谱-串联质谱仪：配有电喷雾离源(ESI)。4.1.5.2 离管：2mL。全国团体标准信息平台!#$%&(%(64.1.5.3 分析天平：感量0.1mg。4.1.5.4 移液器：1mL。4.1.5.5 震动球磨仪。4.1.5.6 样品瓶：2mL，带聚四氟烯旋盖。4.1.5.7 涡旋混合器。4.1.5.8 氮吹仪。4.1.5.9 速离机：13000r/min。4.1.5.10 超声波清洗仪。4.1.6 试样制备与保存籽粒使震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80冰箱保存。4.1.7 准备步骤称取100mg 试样(精确0.01g)2mL 离管中， 加1mL80%醇溶液， 在涡旋混合器上涡旋2min，超声处理40min，置于旋转混匀仪上混匀8h，13000r/min 离5min，取全部上清液另净离管中，再加1mL 甲醇，超声40min，13000r/min 离5min，合并两次上清液，在氮吹仪上常温吹，加100L 甲醇复溶，0.22m 滤膜过滤后供液相谱串联质谱仪检测。4.1.8 ;4.1.8.1 液相谱-串联质谱参考条件a) 谱柱：Hypersil Gold C18, 3.5m, 100mm 2.1mm（内径）或相当者；b) 流动相及梯度洗脱条件表1；b1 流动相4梯度洗脱条X步骤总时间（min）流速（L/min）流动相A（0.1%甲酸/）流动相B（甲醇/）10300901020.2300901036300109048300109058.130090106103009010c) 柱温：35；全国团体标准信息平台!#$%&(%(7d) 进样量：5L；e) 电离源模式：电喷雾离化；f) 电离源极性：负离模式；g) 雾化：氮；h) 离喷雾电压：2500V；i) 雾化温度：317；j) 离传输管温度：333；k) 监测离对及碰撞能量表2。b2 监;2对4碰撞能7中名称英名称保留时间（min）定量离定性离碰撞能量（V）酮Tricin5.67329.1/299329.1/299；329.1/314.125；194.1.8.2 定性测定在相同实验条件下进样品测定时，如果检出的谱峰的保留时间与标准样品相致，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离均出现，且所选择的离丰度与标准样品的离丰度相致（相对丰度50%， 允许20%偏差； 相对丰度20%50%， 允许25%偏差； 相对丰度10%20%， 允许30%偏差；相对丰度10%，允许50%偏差），则可判断样品中存在酮。4.1.8.3 定量测定本件中液相谱串联质谱采外标-校准曲线法定量测定。 为减少基质对定量测定的影响， 定量标准溶液应采基质混合标准作溶液绘制标准曲线。并且保证所测样品中农药及相关化学品的响应值均在仪器的线性范围内。酮标准品液质联谱图如图1所示。c1 *+,aV_c全国团体标准信息平台!#$%&(%(84.1.9 平试d按以上步骤对同试样进平试验。4.1.10 空试d除不称取试样外，均按上述步骤进。4.1.11 结果计算:b述液相谱-串联质谱测定采标准曲线法定量，标准曲线法定量结果按公式（1）计算式中：（1）Xi试样中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；ci从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(g/mL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的重量，单位为克(g)。4.1.12 精密度4.1.12.1 在重复性条件下获得的两次独测定结果的绝对差值与其算术平均值的值（百分率） ， 应符合表3的要求。b3 Cde内重复Ufg被测组分含量（mg/kg）精密度（%）0.001360.001，0.01320.01，0.1220.1，1181144.1.12.2 在再现性条件下获得的两次独测定结果的绝对差值与其算术平均值的值（百分率） ， 应符合表4的要求。b4 CdehijUfg被测组分含量（mg/kg）精密度（%）0.001540.001，0.0146全国团体标准信息平台!#$%&(%(90.01，0.1340.1，1251194.1.13 7限:回收率4.1.13.1 定量限本法的定量限LOQ(Limit of Quantity，LOQ)为4g/g。4.1.13.2 回收率当添加平为LOQ、4LOQ 时，添加回收率分别为84%和79%。4.2 5+,67的; 分光光度4.2.1 原理试样醇溶液提取后，溶于醇的酮类物质与铝离显剂结合，形成有物质，在510nm 波附近产最吸收， 定浓度范围内， 吸光度与总酮含量成正， 通过与标准曲线对获得总酮含量。4.2.2 试剂:材料除另有规定外，应符合GB/T6682中规定的级。4.2.2.1 硝酸铝(Al(NO3)39H2O)：分析纯。4.2.2.2 亚硝酸钠(NaNO )：分析纯。4.2.2.3 氢氧化钠(NaOH)：分析纯。4.2.2.4 芦丁(C27H30O16，CAS号：153-18-4)，纯度99.0。4.2.3 溶配制4.2.3.160%醇溶液：取600mL醇，加400mL，摇匀备。4.2.3.210%硝酸铝溶液：称取10g硝酸铝，加定容到100mL。4.2.3.35%亚硝酸钠溶液：称取5g亚硝酸钠，加定容到100mL。4.2.3.44%氢氧化钠试液：称取4g氢氧化钠，加定容到100mL。4.2.4 9准溶配制称量13.2mg芦丁，60%醇定容到25mL容量瓶作为标准溶液储备液。4.2.5 仪器:设备4.2.5.1 可分光光度计。4.2.5.2 分析天平：感量0.1mg。全国团体标准信息平台!#$%&(%(104.2.5.3 震动球磨仪。4.2.5.4 涡旋混合器。4.2.5.5 速离机：9500r/min。4.2.5.6 超声波清洗仪。4.2.6 9准曲线的制作准确吸取0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL 芦丁标准溶液，放10mL 容量瓶内（写明标记），分别加2.0mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0mL 的60%醇溶液；再加5%亚硝酸钠溶液0.5mL 摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液0.5mL，放置6min 后；加4%氢氧化钠溶液4.0mL，加60%醇定容，摇匀后，放置15min；以不加芦丁对照品溶液为空，采分光光度法在510nm 波处测定吸光度，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。4.2.7 试样制备与保存籽粒使震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80冰箱保存。4.2.8 准备步骤称取1g 试样（精确0.01g）于15mL 离管中，加10mL60%醇溶液，混匀，超声处理60min，期间每20min 摇匀溶液次，9500r/min 离10min，将上清液转移25mL 容量瓶，加5%亚硝酸钠溶液0.5mL，加10%硝酸铝溶液0.5mL，加4%氢氧化钠溶液4mL，60%醇定容刻度，摇匀后放置15min，以不加样品液为空，摇匀后5cm 的，在510nm处测定吸光度。4.2.9 结果计算:b述总酮含量（基）按芦丁质量分数计，按公式（2）进计算：（2）总酮含量；m由标准曲线上查得样品溶液中芦丁质量，单位为毫克(mg)；W样品的质量，单位为克(g)；d稀释例。计算结果表示到数点后两位。4.2.10 精密度在重复性条件下获得的两次独测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。全国团体标准信息平台!#$%&(%(11全国团体标准信息平台