SN∕T 5451-2022 商品化试剂盒检测方法 乳酸菌总数 方法一.pdf

I C S6 7. 0 5 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 5 12 0 2 2 商品化试剂盒检测方法乳酸菌总数 方法一C o mm e r c i a l k i t m e t h o dL a c t i c a c i d b a c t e r i a c o u n tT e s t m e t h o d 2 0 2 2 - 0 3 - 1 4发布2 0 2 2 - 1 0 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准商品化试剂盒检测方法乳酸菌总数 方法一S N/T 5 4 5 12 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 0网址 w ww. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0. 7 5 字数2 1千字2 0 2 2年9月第一版 2 0 2 2年9月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1 7 58 4 4 定价1 6. 0 0元前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国福州海关、 中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人: 郑晶、 林杰、 郭菁、 肖颖、 徐珊、 陈彬、 柯璐、 张温玲、 戴晓丽、 黄嫦娇、 曾维扬、刘阳、 丁旭、 王玮琳。S N/T5 4 5 12 0 2 2商品化试剂盒检测方法乳酸菌总数 方法一1 范围本文件规定了食品中3 MTM P e t r i f i l mTM L a c t i c A c i d B a c t e r i a C o u n t P l a t e( 简称“3 M乳酸菌测试片” ) 的检测方法。本文件适用于食品中乳酸菌总数的测定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求G B/T 2 7 4 0 5 实验室质量控制规范 食品微生物检测S N/T 2 7 7 5 商品化食品检测试剂盒评价方法S N/T 3 2 6 6 食品微生物检验方法确认技术规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染, 应由具备资格的人员进行操作。所有培养物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9和G B/T 2 7 4 0 5中的有关规定执行。5 方法提要3 M乳酸菌测试片是一种预先制备好的培养基系统, 包含培养基、 选择剂、 冷水可溶性凝胶剂和可增强菌落计数效果的四唑指示剂, 菌落在测试片上呈红色。测试片含有氧清除化合物, 可形成一种利于同型发酵与异型发酵乳酸菌再生恢复的厌氧环境。3 6 1 需氧培养 4 8 h3 h进行菌落计数。6 仪器和设备除微生物实验室常规灭菌和培养设备外, 其他设备和材料如6. 16. 1 1所列。6. 1 恒温培养箱:3 6 1 。6. 2 冰箱:2 5 。6. 3 天平: 感量为0. 1 g。1S N/T5 4 5 12 0 2 26. 4 均质器。6. 5 振荡器。6. 6 无菌吸管:1 m L( 具0. 0 1 m L刻度) ,1 0 m L( 具0. 1 m L刻度) 或微量移液器及吸头。6. 7 无菌锥形瓶: 容量2 5 0 m L、5 0 0 m L。6. 8 无菌培养皿: 直径9 0 mm。6. 9 p H计或p H比色管或精密p H试纸。6. 1 0 放大镜或/和菌落计数器。6. 1 1 3 M压板。7 试剂和材料7. 1 3 M乳酸菌测试片(3 MTM P e t r i f i l mTM L a c t i c A c i d B a c t e r i a C o u n t P l a t e) : 参考S N/T 2 7 7 5和S N/T 3 2 6 6按商品化食品检测试剂盒评价程序进行了评价, 评价结果参见附录A。7. 2 磷酸盐缓冲液(P B S) : 按附录B. 1。7. 3 无菌生理盐水: 按附录B. 2。7. 4 1 m o l/L 氢氧化钠(N a OH) : 称取 4 0 g N a OH 溶于1 0 0 0 m L 蒸馏水中。7. 5 1 m o l/L 盐酸(HC l) : 移取9 0 m L浓盐酸 , 用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m L。8 检测程序3 M乳酸菌测试片检测方法程序见图1。图1 3 M乳酸菌测试片检测方法程序2S N/T5 4 5 12 0 2 29 操作步骤9. 1 样品制备和稀释9. 1. 1 冷冻样品可先使其在2 5 条件下解冻, 时间不超过1 8 h, 也可在温度不超过4 5 的条件解冻, 时间不超过1 5 m i n。9. 1. 2 固体和半固体食品: 以无菌操作称取2 5 g样品, 置于装有2 2 5 m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 于8 0 0 0 r/m i n1 0 0 0 0 r/m i n均质1 m i n2 m i n, 制成11 0样品匀液; 或置于2 2 5 m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打1 m i n2 m i n, 制成11 0的样品匀液。9. 1. 3 液体样品: 液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品2 5 m L, 放入装有2 2 5 m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的样品稀释瓶( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中, 充分振摇, 制成11 0的样品匀液。9. 1. 4 用1 m L无菌吸管或微量移液器吸取11 0样品匀液1 m L, 沿管壁缓慢注于装有9 m L稀释液的无菌试管中( 注意吸管尖端不要触及稀释液) , 振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成11 0 0的样品匀液。9. 1. 5 另取1 m L无菌吸管或微量移液器吸头, 按上述操作顺序, 做1 0倍递增样品匀液, 每递增稀释一次, 即换用1次1 m L灭菌吸管或吸头。9. 2 接种和培养9. 2. 1 根据对待检样品乳酸菌含量的估计, 选择2个3个适宜稀释度样品匀液进行检验。9. 2. 2 将3 M乳酸菌测试片置于平坦表面处, 揭开上层膜, 吸取某一稀释度的1 m L样品匀液, 垂直滴加在测试片的中央处, 然后将上层膜轻轻放下, 将压板放置在上层膜中央处, 压下压板使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上, 切勿扭转压板。拿起压板, 静置至少1 m i n以使培养基凝固。9. 2. 3 每个稀释度接种两张测试片。同时, 分别吸取1 m L空白稀释液加入两张测试片内作空白对照。9. 2. 4 将测试片的透明面朝上, 水平置于培养箱内, 可堆叠至2 0片。在3 6 1 条件下需氧培养 4 8 h 3 h。9. 3 乳酸菌总数检验9. 3. 1 如果样品仅包括乳杆菌属: 取合适浓度的稀释液1 m L, 滴加至乳酸菌测试片中央, 置于3 6 1 下需氧培养4 83 h。则测试片上的菌落数即为乳酸菌总数。9. 3. 2 如果样品同时包括乳杆菌属和双歧杆菌属: 取合适浓度的稀释液1 m L, 滴加至乳酸菌测试片中央, 置于3 6 1 下需氧培养4 83 h。则测试片上的菌落数即为乳酸菌总数。9. 3. 3 如果样品中同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌: 取合适浓度的稀释液1 m L, 滴加至3 M乳酸菌测试片中央, 置于3 6 1 下需氧培养4 83 h。同时按照G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6进行嗜热链球菌计数,二者结果之和即为乳酸菌总数。9. 3. 4 如果样品同时包括乳杆菌属、 双歧杆菌属和嗜热链球菌: 取合适浓度的稀释液1 m L, 滴加至3 M乳酸菌测试片中央, 置于3 6 1 下需氧培养4 83 h。同时按照G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6进行嗜热链球菌计数, 二者结果之和即为乳酸菌总数。9. 3. 5 如果仅检测样品中双歧杆菌属, 按照G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6进行双歧杆菌计数。9. 3. 6 如果样品仅包含嗜热链球菌, 按照G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6进行嗜热链球菌计数。3S N/T5 4 5 12 0 2 29. 3. 7 如果样品中同时包括双岐杆菌属和嗜热链球菌, 按照G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6分别进行双歧杆菌和嗜热链球菌计数, 二者结果之和即为乳酸菌总数。9. 4 菌落计数9. 4. 1 到培养时间应立即计数, 选取菌落数在 3 0 C F U3 0 0 C F U之间的测试片计数菌落总数, 记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y - f o r m i n g u n i t s,C F U) 表示。9. 4. 2 计数所有红色菌落, 菌落伴有或无伴有气泡均需计数。9. 4. 3 测试片上菌落浓度过高会导致整个生长区域变为深蓝色至紫色, 并且在测试片边缘带有粉色晕圈, 将结果记录为“ 多不可计” 。9. 4. 4 3 M乳酸菌测试片有3 0个等分格, 当菌落数量过多计数困难时, 可选择几个有代表性菌落的小方格进行计数并计算平均菌落数, 再乘以总方格数, 即可得到整个测试片上的估算菌落数。9. 4. 5 一些微生物会液化凝胶, 造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数, 可以计数未液化的面积来估算菌落数。9. 5 计算方法9. 5. 1 若只有一个稀释度测试片上的菌落数在适宜计数范围内, 计算两个测试片菌落数的平均值, 再将平均值乘以相应稀释倍数, 作为每克或每毫升中菌落总数结果。9. 5. 2 若有两个连续稀释度的测试片菌落数在适宜计数范围内时, 按式(1) 计算:N=C/ (n1+0. 1 n2)d( 1 )式中:N 样品中菌落数;C 测试片( 含适宜范围菌落数的测试片) 菌落数之和;n1 第一稀释度( 低稀释倍数) 测试片个数;n2 第二稀释度( 高稀释倍数) 测试片个数;d 稀释因子( 第一稀释度) 。9. 5. 3 若所有稀释度的测试片上菌落数均大于3 0 0 C F U, 则对稀释度最高的测试片进行计数, 其他测试片可记录为多不可计, 结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。9. 5. 4 若所有稀释度的测试片菌落数均小于3 0 C F U, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9. 5. 5 若所有稀释度( 包括液体样品原液) 测试片均无菌落生长, 则以小于1乘以最低稀释倍数计算。9. 5. 6 若所有稀释度的测试片菌落数均不在3 0 C F U3 0 0 C F U之间, 其中一部分小于3 0 C F U或大于3 0 0 C F U时, 则以最接近3 0 C F U或3 0 0 C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1 0 结果与报告1 0. 1 菌落数小于1 0 0 C F U时, 按“ 四舍五入” 原则修约, 以整数报告。1 0. 2 菌落数大于或等于1 0 0 C F U时, 第3位数字采用“ 四舍五入” 原则修约后, 取前2位数字, 后面用0代替位数; 也可用1 0的指数形式来表示, 按“ 四舍五入” 原则修约后, 采用两位有效数字。1 0. 3 根据乳酸菌菌落计数结果出具报告, 报告单位以C F U/g (m L) 表示。4S N/T5 4 5 12 0 2 2附 录 A ( 资料性)3 M乳酸菌测试片评价结果1) 1) 本评价结果仅适用于3M有限公司的3M乳酸菌测试片(3MTM P e t r i f i l mTM L a c t i c A c i d B a c t e r i a C o u n t P l a t e) 。 A. 1 线性和准确度3 M 乳酸菌测试片方法与G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6的线性关系和显著性分析结果见表A. 1和表A. 2。表A. 1 人工添加样品测试片法和参考方法(G B 4 7 8 9. 3 52 0 1 6) 的线性关系食品基质线性方程相关系数(R2)T检验值鱼露y =1. 0 0 1 2 x -0. 0 0 1 70. 9 9 7 20. 0 1 3熏鲅鱼y =1. 0 3 9 1 x -0. 1 6 70. 9 5 7 90. 0 9 3泡凤爪y =0. 9 9 4 4 x -0. 0 4 4 90. 9 8 4 40. 2 0 3沙拉酱y =0. 9 9 2 1 x +0. 0 4 0 30. 9 9 40. 0 2 0奶油y =1. 0 0 8 6 x -0. 0 3 1 60. 9 9 6 10. 0 0 2奶酪y =0. 9 9 4 8 x +0. 0 2 7 70. 9 9 7 60. 0 1 5乌冬面y =0. 9 4 9 2 x +0. 1 8 5 90. 9 9 0 60. 0 1 5火腿y =1. 0 0 7 5 x -0. 0 5 0 50. 9 9 7 30. 0 5 8腌制鲐鱼y =1. 0 0 5 8 x -0. 0 5 9 10. 9 8 3 60. 1 2 2 T0. 0 5(1 5)=2. 1 3 1表A. 2 自然样品显著性分析结果基体实验次数M e a nS rR S Dl g( 参考法)l g( 测试片)参考法测试片参考法测试片T值雅培小安素17. 3 67. 4 20. 0 8 1 70. 0 8 1 91. 1 1%1. 1 0%27. 8 27. 8 10. 0 6 5 70. 0 8 0 80. 8 4%1. 0 3%37. 7 87. 8 10. 0 6 8 90. 0 4 5 90. 8 9%0. 5 9%0. 0 5 7乳酸菌颗粒11 0. 2 01 0. 2 00. 0 4 3 00. 0 1 9 20. 4 2%0. 1 9%28. 5 48. 5 50. 0 7 0 40. 0 5 4 80. 8 2%0. 6 4%39. 6 59. 6 70. 0 6 2 00. 0 5 6 70. 6 4%0. 5 9%0. 0 3 1光明酸奶13. 4 83. 5 60. 0 7 1 80. 0 4 3 52. 0 6%1. 2 2%23. 4 73. 5 10. 0 5 0 00. 0 9 0 41. 4 4%2. 5 8%33. 5 33. 5 60. 0 9 0 70. 0 9 4 32. 5 7%2. 6 5%0. 1 6 45S N/T5 4 5 12 0 2 2表A. 2 自然样品显著性分析结果 ( 续)基体实验次数M e a nS rR S Dl g( 参考法)l g( 测试片)参考法测试片参考法测试片T值酸奶冰淇淋18. 7 08. 7 10. 0 5 4 20. 0 5 8 90. 6 2%0. 6 8%28. 7 18. 6 90. 0 7 1 30. 0 5 8 40. 8 2%0. 6 7%38. 4 58. 4 30. 0 6 0 10. 0 9 0 00. 7 1%1. 0 7%0. 2 1 8蒙牛优益C11 1. 4 61 1. 4 90. 0 7 0 40. 0 9 0 30. 6 1%0. 7 9%21 2. 0 81 2. 1 30. 0 5 1 30. 0 4 8 50. 4 2%0. 4 0%31 1. 8 21 1. 8 50. 0 4 9 90. 0 9 5 00. 4 2%0. 8 0%0. 2 1 0泡菜14. 8 54. 9 20. 0 6 9 00. 0 5 6 61. 4 2%1. 1 5%24. 7 24. 8 70. 0 5 3 90. 0 8 5 31. 1 4%1. 7 5%34. 8 14. 9 10. 0 4 5 70. 0 4 8 00. 9 5%0. 9 8%1. 1 1 7腌制牛排14. 0 64. 1 70. 0 4 3 50. 0 3 0 01. 0 7%0. 7 2%23. 8 03. 9 30. 0 4 2 10. 0 5 0 11. 1 1%1. 2 7%34. 1 54. 2 60. 0 3 5 80. 0 2 0 50. 8 6%0. 4 8%1. 2 0 8 T0. 0 5(1 5)=2. 1 3 1A. 2 耐变性选用两个添加水平样品对培养温度和培养时间两个变量进行耐变性试验。经验证, 培养温度选择3 5 和3 7 , 培养时间选择4 5 h和5 1 h时, 检测结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别, 表明说明书中对培养温度3 6 1 和培养时间4 8 h3 h的耐变性范围不影响检测结果。见表A. 3。表A. 3 耐变性试验结果实验条件菌株添加水平测试结果(l g值)12345平均值S rR S D3 7 ,5 1 h高水平3. 5 23. 5 73. 6 23. 5 43. 4 13. 5 30. 0 7 6 9 2. 1 8%低水平2. 4 32. 4 62. 5 82. 6 92. 6 12. 5 60. 1 0 7 3 4. 2 0%3 7 ,4 5 h高水平3. 3 63. 4 83. 5 63. 6 53. 6 13. 5 30. 1 1 6 0 3. 2 8%低水平2. 4 92. 5 72. 6 12. 6 22. 4 12. 5 40. 0 8 8 0 3. 4 6%3 5 ,5 1 h高水平3. 6 66. 5 33. 4 53. 4 33. 5 23. 5 20. 0 9 1 7 2. 6 1%低水平2. 3 82. 4 52. 5 72. 5 92. 5 42. 5 10. 0 8 9 2 3. 5 6%3 5 ,4 5 h高水平3. 3 63. 4 63. 6 13. 5 83. 5 63. 5 10. 1 0 2 1 2. 9 1%低水平2. 6 52. 6 22. 4 82. 5 12. 5 62. 5 60. 0 7 5 1 2. 9 3%6S N/T5 4 5 12 0 2 2A. 3 批间变异取3个不同批号测试片对两个添加水平奶粉样品进行批间变异试验, 试验结果表明, 测试片的批间无明显差异。见表A. 4。表A. 4 批间变异试验结果菌株浓度批号测试结果(l g值)12345M e a nS rR S D高水平3 3 9 A 9 T3. 5 63. 5 43. 6 13. 6 83. 6 33. 6 10. 0 5 6 51. 5 7%3 3 9 A L 93. 6 23. 6 63. 5 23. 5 63. 5 83. 5 90. 0 5 6 41. 5 7%3 3 7 Y J E3. 5 83. 5 73. 6 13. 6 33. 5 63. 5 90. 0 3 2 10. 8 9%总平均值3. 5 9总S r0. 1 4 5 0低水平3 3 9 A 9 T2. 5 22. 6 32. 6 12. 6 52. 6 32. 6 10. 0 5 3 32. 0 4%3 3 9 A L 92. 5 72. 5 92. 5 12. 6 62. 6 72. 6 00. 0 6 9 32. 6 7%3 3 7 Y J E2. 6 82. 6 62. 5 42. 6 12. 5 82. 6 20. 0 5 6 92. 1 7%总平均值2. 6 1总S r0. 1 7 9 5A. 4 实验室间验证试验8家实验室高、 中、 低三个添加水平样品5个平行测试结果的室间重复性和再现性见表A. 5。表A. 5 实验室间验证试验结果添加水平实验室数测试片法参考方法rRrR高80. 1 2 90. 2 6 60. 1 1 10. 1 8 4中80. 1 8 70. 2 8 50. 1 6 40. 2 3 3低80. 2 6 80. 3 7 30. 2 1 50. 3 1 4S N/T5 4 5 12 0 2 2S N/T5 4 5 12 0 2 2附 录 B( 规范性)培养基和试剂B. 1 磷酸盐缓冲液(P B S)B. 1. 1 成分磷酸二氢钾(KH2P O4) 3 4. 0 g蒸馏水5 0 0 m Lp H 7. 2B. 1. 2 制法贮存液: 称取3 4. 0 g的磷酸二氢钾溶于5 0 0 m L蒸馏水中, 用大约1 7 5 m L的1 m o l/L氢氧化钠溶液调节p H, 用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m L后贮存于冰箱。 稀释液: 取贮存液1. 2 5 m L, 用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m L, 分装于适宜容器中,1 2 1 高压灭菌1 5 m i n。B. 2 无菌生理盐水B. 2. 1 成分氯化钠 8. 5 g蒸馏水1 0 0 0 m LB. 2. 2 制法称取 8. 5 g氯化钠溶于1 0 0 0 m L蒸馏水中,1 2 1 高压灭菌1 5 m i n。22021545 T/NS书号:1 5 5 1 7 58 4 4定价:1 6. 0 0元