2019精选医学第02章核酸.ppt.ppt

第 2 章 核酸的结构和功能核核酸酸是是一一类类重重要要的的生生物物大大分分子子，担担负负着着生命信息的储存与传递。生命信息的储存与传递。核核酸酸是是现现代代生生物物化化学学、分分子子生生物物学学的的重重要要研研究究领领域域，是是基基因因工工程程操操作作的的核核心心分分子。子。第一节第一节 核酸的概念核酸的概念核核 酸酸(nucleic acid)的概念 1、功能、功能-核酸是生物遗传的物质基础，决核酸是生物遗传的物质基础，决定生物的生长、繁殖以及生命的代谢模式。定生物的生长、繁殖以及生命的代谢模式。2、结构结构-是以核苷酸为基本组成单位的生物大分是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。子，携带和传递遗传信息。3、DNA储存信息；储存信息；RNA传递并表达信息传递并表达信息4、DNA-RNA-蛋白质蛋白质一、核酸的发现和研究工作进展一、核酸的发现和研究工作进展 1868年年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取从脓细胞中提取含磷丰富的酸性物质含磷丰富的酸性物质-“核素核素”1944年年 Avery等人等人证实证实DNA是遗传物质是遗传物质20世纪世纪50年代初，年代初，Erwin Chargaff在测定多种生物的在测定多种生物的DNA组成后，发现组成后，发现A=T,G=C,这称为这称为“Chargaff定则定则”1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构1968年年 Nirenberg发现发现遗传密码遗传密码1975年年 Temin和和Baltimore发发现现逆转录酶逆转录酶1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA 测序方法测序方法1985年年 Mullis发明发明PCR 技术技术1990年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划(HGP)1994年年 中国人类基因组计划启动中国人类基因组计划启动1998年，国际水稻基因组计划，年，国际水稻基因组计划，2000年年5月，中国超级杂交水稻基因组计划月，中国超级杂交水稻基因组计划 2001年年 美、英等国美、英等国完成人类基因组计划基本框架，完成人类基因组计划基本框架，2003年完成精细图谱年完成精细图谱二、核酸的分类及分布二、核酸的分类及分布 98%98%以以上上分分布布于于细细胞胞核核，其其余余分分布布于于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。包括包括mRNAmRNA、tRNAtRNA和和rRNArRNA分布分布于于胞核、胞液。胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。第二节第二节 核酸的组成成分核酸的组成成分核酸的化学组成核酸的化学组成 1.元素组成元素组成C、H、O、N、P（910%）2.分子组成分子组成核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸碱基碱基戊糖戊糖A GC U T嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖一、戊一、戊 糖糖（构成（构成RNA）12345核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)嘌呤嘌呤(purine)腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)二、碱二、碱 基基嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。核苷：核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR三、三、核苷核苷(ribonucleoside)的形成的形成碱基戊糖核苷碱基戊糖核苷连接部位：戊糖连接部位：戊糖-1，碱基碱基-9/1 连接方式：连接方式：C-N 糖苷键糖苷键11核苷酸：核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP 四、四、核苷酸核苷酸(ribonucleotide)核苷核苷（脱氧核苷）和磷酸以脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。体内重要的游离核苷酸及其衍生物体内重要的游离核苷酸及其衍生物l辅酶和辅基含核苷酸的生物活性物质：辅酶和辅基含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有等都含有 AMPl能量载体能量载体-ATP、GTPl食品工业上用作添加剂食品工业上用作添加剂l 单体多磷酸核苷酸：单体多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTPl 第二信使环化核苷酸第二信使环化核苷酸:cAMP，cGMPAMPAMPcAMPcAMP5端端3端端3.3.核苷酸的连接核苷酸的连接 上一个核苷酸上一个核苷酸戊糖戊糖，位的羟基与位的羟基与下下一个核苷酸戊糖一个核苷酸戊糖，位的磷酸位的磷酸以以磷酸二酯磷酸二酯键键连接形成多核苷连接形成多核苷酸链，即以酸链，即以，磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接。CGA一、核酸的一级结构一、核酸的一级结构55端端3端端CGA第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构l5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 5-P-P表示）；表示）；3-3-羟基端（常用羟基端（常用3 3-OH-OH表表示）示）l多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是注明它的方向是5353或是或是3535，一般默认为从左到右，一般默认为从左到右为为5 5-3-3。多聚核苷酸的表示方式多聚核苷酸的表示方式DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH DNA一级结构的意义DNADNA虽然只是由于四个碱基的变化形成的四种虽然只是由于四个碱基的变化形成的四种核苷酸按照一定的顺序排列起来，但值得注意核苷酸按照一定的顺序排列起来，但值得注意的是，的是，DNADNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNADNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。中。DNA的二级结构的二级结构-双螺旋结构双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义双螺旋结构的研究背景和历史意义DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装的超螺旋结构及其在染色质中的组装DNA的超螺旋结构的超螺旋结构原核生物原核生物DNA的高级结构的高级结构DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装DNA的功能的功能二、核酸的二级结构二、核酸的二级结构（一）（一）DNA的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构（一）（一）DNA双螺旋结构的研究背景双螺旋结构的研究背景 碱基组成分析碱基组成分析Chargaff 规则：规则：A=TG C 碱基的理化数据分析碱基的理化数据分析A-T、G-C以以氢键氢键配对较合理配对较合理 DNA纤维的纤维的X-线衍射图谱分析线衍射图谱分析 （二）（二）DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）u两两条条DNADNA单单链链分分子子反反向向平平行行环环绕绕，右右手手螺螺旋旋走走向向，表表面面大大沟与小沟相间。沟与小沟相间。u螺旋直径为螺旋直径为2nm，主链：戊糖主链：戊糖 磷酸骨架位于外侧磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧侧链：碱基对位于内侧u碱基平面垂直于螺旋轴碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：碱基距：0.34nm；螺距螺距：3.4nm；周长：周长：10对碱基。对碱基。（二）（二）DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点 （Watson,Crick,1953）u碱碱基基形形成成氢氢键键配配对对，配配对对形形式为：式为：A=T;G C）。碱基互补配对碱基互补配对 TACG（二）（二）DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点 （Watson,Crick,1953）稳定因素：稳定因素：u氢键氢键维持维持横向稳定性横向稳定性u 碱碱基基堆堆积积力力维维持持纵纵向向稳稳定性定性u其他作用因素其他作用因素4.DNA双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性三种类型三种类型DNADNA的结构参数的结构参数类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）碱基对与水平面倾角ADNABDNAZDNA右右左2.32.01.82.83.44.51110120.2550.340.2719075.与DNA碱基序列相关的特殊结构回文结构发卡结构镜像重复二、二、DNA的超螺旋结构及其在染色质的超螺旋结构及其在染色质中的组装中的组装（一）（一）DNA的超螺旋结构的超螺旋结构超螺旋结构超螺旋结构(superhelix 或或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 意义意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其变化及其调控调控对于对于DNA复制和复制和RNA转录过转录过程程具有关键作用。具有关键作用。（二）原核生物（二）原核生物DNA的高级结构的高级结构（三）（三）DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装真真核核生生物物染染色色体体由由DNA和和蛋蛋白白质质构构成成，其基本单位是其基本单位是 核小体核小体(nucleosome)。核小体的化学组成核小体的化学组成DNA：约约200bp 组蛋白：组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4染色体的组装过程：染色体的组装过程：核小体核小体 串珠状染色质细丝串珠状染色质细丝 中空线圈螺中空线圈螺线管线管 染色单体染色单体 压缩了1000-2000倍 多级螺旋模型多级螺旋模型压缩倍数压缩倍数 7 6 40 5 （8400）DNA 核小体核小体 螺线管螺线管 超螺线管超螺线管 染色单体染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装一级包装 二级包装二级包装 三级包装三级包装 四级包装四级包装 三、三、DNA的功能的功能以以基因基因的形式储存、传递、表达信息的形式储存、传递、表达信息 DNA-RNA-蛋白质蛋白质基因从结构上定义，基因从结构上定义，是指是指DNA分子中的分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。了基因的功能。第三节第三节 RNA的结构与功能的结构与功能Structure and Function of RNARNA的种类、分布、功能的种类、分布、功能一一、信使、信使RNA的结构与功能的结构与功能hnRNA mRNA *真核生物真核生物mRNA成熟过程成熟过程内含子（intron）外显子（exon）*真核生物真核生物mRNA结构特点结构特点1.5末端有甲基化鸟苷帽子结构：末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm-2.3末端有多聚腺苷酸尾巴：末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子结构帽子结构促进促进mRNA由胞核向胞质的转位由胞核向胞质的转位维持维持mRNA的稳定性的稳定性翻译起始的调控翻译起始的调控 帽子结构和帽子结构和多聚多聚A尾的功能尾的功能*mRNA的功能的功能 把把DNA的的碱碱基基序序列列翻翻译译成成蛋蛋白白质质的的氨氨基酸顺序。基酸顺序。DNAmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译原核细胞原核细胞 细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核细胞真核细胞 *tRNA的一级结构特点的一级结构特点 含含 1020%稀有碱基稀有碱基 3末端为末端为 CCA-OH 5末端大多数为末端大多数为G 具有具有 T C环环 二、转运二、转运RNA的结构与功能的结构与功能N,N二甲基鸟嘌呤二甲基鸟嘌呤N6-异戊烯腺嘌呤异戊烯腺嘌呤双氢尿嘧啶双氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶巯尿嘧啶 稀有碱基稀有碱基 *tRNA的二级结构的二级结构三叶草形三叶草形 氨基酸臂氨基酸臂 DHU环环 反密码子环反密码子环 额外环额外环 TC环环氨基酸氨基酸臂臂额外环额外环*tRNA的三级结构的三级结构 倒倒L形形*tRNA的功能的功能活活化化、搬搬运运氨氨基基酸酸到到核核糖糖体体，参参与与蛋蛋白质的翻译。白质的翻译。*rRNA的结构的结构三、核蛋白体三、核蛋白体RNA的结构与功能的结构与功能*rRNA的功能的功能参参与与组组成成核核蛋蛋白白体体，作作为为蛋蛋白白质质生生物物合成的场所。合成的场所。rRNA的种类（根据沉降系数）的种类（根据沉降系数）沉降系数沉降系数：单位时间内的：单位时间内的沉降沉降速度速度真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA核蛋白体的组成核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%核核 酸酸 的的 理理 化化 性性 质质The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid第第 四四 节节l核酸的核酸的酸碱及溶解度性质酸碱及溶解度性质核酸为多元酸，具有较强的酸性，其中的碱基又具有碱性，所以核酸为多元酸，具有较强的酸性，其中的碱基又具有碱性，所以为两性电解质为两性电解质。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。l核酸核酸的高分子性质的高分子性质粘度：粘度：DNARNA dsDNA ssDNA沉降行为沉降行为l核酸核酸的紫外吸收的紫外吸收(OD260)单核苷酸单核苷酸 ssDNA(或或RNA)dsDNAl核酸的分离方法：电泳核酸的分离方法：电泳-依据分子量大小依据分子量大小 离子交换法离子交换法-依据电荷依据电荷一、核酸的一般理化性质一、核酸的一般理化性质1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用的应用二、二、DNA的变性的变性(denaturation)定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解开双链解开成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD260增高增高粘度下降粘度下降比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代代表表溶溶液液在在260nm260nm处处的的吸吸光光率率）值值作作图图，所所得得的的曲曲线线称称为为解解链曲线链曲线。Tm：DNA变变性性时时紫紫外外光光吸吸收收值值达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度，又又称称融融解解温度温度(melting temperature,Tm)。影响影响Tm的因素：大小、的因素：大小、G+C含量含量三、三、DNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。减色效应减色效应 DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低的现象。降低的现象。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。不不同同来来源源的的核核酸酸链链分分子子复复性性时时形形成成杂杂化化双双链链过过程叫分子杂交。程叫分子杂交。这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNA与与DNA之之间间形形成成，也也可可以以在在DNA和和RNA分分子子间间或或者者RNA与与RNA分分子子间间形形成成。这这种种现现象象称称为为核核酸酸分子杂交。分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用l研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置l确定两种核酸分子间的序列相似性确定两种核酸分子间的序列相似性l检测某些专一序列在待检样品中存在与检测某些专一序列在待检样品中存在与 否否l是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 核核 酸酸 酶酶 核酸酶核酸酶是指所有可以是指所有可以水解核酸的酶水解核酸的酶核酸酶的分类核酸酶的分类依据底物不同分类依据底物不同分类DNA酶酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解专一降解DNA。RNA酶酶(ribonuclease,RNase)：专一降解专一降解RNA。依据切割部位不同依据切割部位不同核酸内切酶：核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：核酸外切酶：53或或35核酸外切酶。核酸外切酶。u参参与与DNA的的合合成成与与修修复复、RNA合合成成后后的的剪剪接接等重要基因复制和基因表达过程等重要基因复制和基因表达过程 u负负责责清清除除多多余余的的、结结构构和和功功能能异异常常的的核核酸酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 核酸酶的功能核酸酶的功能 核核 酶酶-有催化活性的RNA1982年，美国Thomas Cech 在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，同时加拿大的Sidney Altman 发现RNase P分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble 化学奖。不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：RNA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。u催化性催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。u催化性催化性RNA(ribozyme)作为序列特异性的核作为序列特异性的核酸内切酶降解酸内切酶降解mRNA。核酶的二级结构对于催化活性很重要。Symons提出“锤头”（hammerhead）状二级结构。三个螺旋区；13（或11）个保守核苷酸序列。核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。标准程序：酚酚-氯仿氯仿。核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水真核细胞RNA的提取纯化一个典型的哺乳动物细胞约含10-5g RNA，其中8085%为rRNA，mRNA为细胞总RNA的15%。制备高质量真核细胞RNA的关键是在抽提的最初步骤就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所用玻璃器皿及液体污染微量核糖核酸酸酶。创造一个无RNA酶的环境洁净实验室环境 一次性手套，勤换 环境洁净（避免飞尘中细菌真菌产生外源性RNA酶污染）玻璃和塑料器皿处理 玻璃：常规洗净后，200干烤4小时 塑料：一次性。溶液配制：加0.1%DEPC371216Hr，高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的溶液，用DEPC处理过的无RNA酶的三蒸水配制，用滤膜过滤除菌。DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5抑制内源性RNA酶酶活 异硫氰酸胍：强烈变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使RNA从细胞中释放，又称解偶剂。-巯基乙醇和异硫氰酸胍能使细胞内各种RNA酶失活。十二烷基肌酸钠：可使核糖体蛋白质与RNA分子分离。Rnasin：核糖核酸酶素,是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。