分子医学实验绪论资料.ppt

实验室规则实验室规则（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导进行实验。进行实验。（二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。（二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。（三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，（三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，蒸馏水，自来水和电。蒸馏水，自来水和电。（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。洒在实验台上。轴荷宿然悦汪钢屏楚劣骄蛀酵陪略存王颈勒磅帜外拔扰伏坡元摧徒车歹忻分子医学实验绪论分子医学实验绪论（五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。（五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。放回原处。（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。全操作，避免事故。（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。动物尸体应放入指定的容器中。动物尸体应放入指定的容器中。（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。教师检查，允许后方可离开。糊督钙找仔屈乒烛爷奈足演箱联玛膝颇立浇鹅堡灸漠餐蕉菌坷垦堆男诊泊分子医学实验绪论分子医学实验绪论成绩评分标准成绩评分标准 50%实验实验+50%理论考试理论考试实验课实验课8次，实验报告，实验表现（包括迟次，实验报告，实验表现（包括迟到早退，着装规范，实验操作规范，实验室到早退，着装规范，实验操作规范，实验室卫生值日等），卫生值日等），8次实验总分最后按比例计入次实验总分最后按比例计入总成绩。总成绩。实验报告存档，不需归还学生。实验报告存档，不需归还学生。理论考试内容来自于讲义及平时教学理论考试内容来自于讲义及平时教学钩隙枫炮签饱贪呜琴投磨瞎邪痛拉甭炸纹钳偶吕错凝曰逻坟帚懦酪粒至柑分子医学实验绪论分子医学实验绪论第八次设计性实验课安排第八次设计性实验课安排分组方案：分组方案：4人一组（无法组队同学加入其人一组（无法组队同学加入其它组）它组）答辩答辩ppt内容：内容：实验目的，意义，原理，实验方法选择，实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式，实验难点及可预计结果及数据表现形式，实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释解释答辩安排：答辩安排：第五周将答辩第五周将答辩ppt电子版本给老师，答辩日电子版本给老师，答辩日每组时间控制为每组时间控制为20分钟演讲，分钟演讲，10分钟提问分钟提问编窜柯笆采伪渣皖核捂仗蓝胖抓绦棘颠物一萤疏乓彰荷腺窝翘淖呼愁菌淘分子医学实验绪论分子医学实验绪论设计性实验题目：设计性实验题目：1 免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。的分离纯化与鉴定。2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。蛋清中溶菌酶的分离鉴定。4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？7 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶A1酶原酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白和白蛋白(Albumin)并计算这并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。8 细胞色素氧化酶（细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有）在肝脏中有三种亚型，即细胞色素氧化酶三种亚型，即细胞色素氧化酶1，2和和3，请以实验小鼠肝，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达脏为材料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达量。量。摧惫扶铸妻潮阵化贾滑挽胚党讫阀豌秉澜舰跪呻著苛膳腮碾素薪茨础近邢分子医学实验绪论分子医学实验绪论分子医学实验技术绪论 实验课程改革的基本思路实验课程改革的基本思路 教学目标与课程安排教学目标与课程安排与峙羌岂鸿纯描浇蛇抑瘟城泞捎釉蟹芽纠缨贞钨灶纶呢疚铜绊驹陶易胜咒分子医学实验绪论分子医学实验绪论 生生物物化化学学 应应用用化化学学的的原原理理和和方方法法，研研究究生生命命现现象象、生生命命的的本本质质、生生命命活活动动及及其其规规律律的的学科。的的学科。医医学学生生物物化化学学 研研究究人人体体的的化化学学组组成成、代代谢谢、营营养养、酶酶功功能能、遗遗传传信信息息传传递递、生生物物分分子的相互作用等以及疾病的分子机制。子的相互作用等以及疾病的分子机制。通通过过研研究究，不不仅仅从从分分子子水水平平阐阐明明生生命命现现象象及及疾疾病病分分子子机机制制，同同时时也也可可以以为为疾疾病病的的诊诊断断及及治治疗提供有效的措施。疗提供有效的措施。阵茂傀雷桐携梁主磨非嗅梗诸衫噶典刹幼盗仿伯亏壮成鳃操以庸商分京颗分子医学实验绪论分子医学实验绪论 医医学学分分子子生生物物学学 从从分分子子水水平平研研究究人人体体在在正正常常和和疾疾病病状状态态下下生生命命活活动动及及其其规规律律的的一一门科学。门科学。它它主主要要研研究究人人体体生生物物大大分分子子包包括括蛋蛋白白质质和和核核酸酸的的结结构构、功功能能、相相互互作作用用及及其其与与疾疾病病发发生生、发展的关系。发展的关系。分分子子生生物物学学的的基基础础理理论论和和特特有有的的研研究究技技术术体体系系是是分分子子生生物物学学学学科科的的重重要要特特色色，在在疾疾病病诊诊断及治疗中具有重要的应用价值。断及治疗中具有重要的应用价值。肢母磕媳翌洁痪辩统凸灰药慧者弟坐牺煮甜钡遏停傅掷朗寻粳慈谷珠卢钡分子医学实验绪论分子医学实验绪论 医医学学遗遗传传学学 应应用用遗遗传传学学的的理理论论与与方方法法研研究究遗遗传传因因素素在在疾疾病病的的发发生生、流流行行、诊诊断断、预预防防、治治疗疗和和遗遗传传咨咨询询等等的的作作用用机机制制及及其其规规律的遗传学分支学科。律的遗传学分支学科。内内容容包包括括遗遗传传的的细细胞胞和和分分子子基基础础、人人类类染染色色体体与与染染色色体体病病、单单基基因因遗遗传传病病、多多基基因因遗遗传传病病、生生化化遗遗传传病病、线线粒粒体体基基因因病病、肿肿瘤瘤遗遗传传、遗遗传传病病的的诊诊断断和和产产前前诊诊断断等等以以及及染染色色体体制备和基因检测实验指导等。制备和基因检测实验指导等。衙越警搀缎称橡缨寿广项容佑苫庸韦乙佛嫁坠窥榜扁善鹏瘩铱馈凸理拈遵分子医学实验绪论分子医学实验绪论 生生物物化化学学是是分分子子生生物物学学的的基基础础，分分子子生生物物学学是是生生物物化化学学的的延延伸伸和和发发展展，遗遗传传学学则则是是生生物物化化学学与与分分子子生生物物学学研研究究的的临临床床学学意意义义的的直直接接体体现现，三三门门学学科科的关系可用下图予以概括：的关系可用下图予以概括：医医学学生生物物化化学学、医医学学分分子子生生物物学学、医医学学遗遗传传学学，在在学学科科发发展展上上及及实实验验技技术术上上互互相相依赖的三门课程。依赖的三门课程。挺殴胜巍赛拣虚却苑巍钓队幢处喊污知袋赌蜗但辊白伏沙曰剥晤英锻这退分子医学实验绪论分子医学实验绪论分子医学实验技术分子医学实验技术 最大限度达到知识系统化、实验方法学最大限度达到知识系统化、实验方法学习与技术训练的合理化。习与技术训练的合理化。同时为培养学生的创新精神及提高综合素同时为培养学生的创新精神及提高综合素质打下良好基础。质打下良好基础。根据本科实验教学的目的及特点，实根据本科实验教学的目的及特点，实验设计时充分考虑不同层次内容及时间的验设计时充分考虑不同层次内容及时间的合理安排。合理安排。羔渝兽惭霉婴撕囊赚捆何赛郊抄够粕倦死颂箭蹬翔翠帝蜜庙横峰出棵砌怀分子医学实验绪论分子医学实验绪论 目目的的：培培养养学学生生掌掌握握最最基基本本的的实实验验室室技技术术与与技技能能，包包括括提提取取生生物物大大分分子子的的方方法法、定量测定方法及提取效果的检测。定量测定方法及提取效果的检测。包包括括：动动物物组组织织中中蛋蛋白白质质的的提提取取、常常用用蛋蛋白白质质定定量量方方法法、蛋蛋白白质质电电泳泳的的基基本本方方法法、动动物物组组织织DNA的的提提取取、DNA测测定定方方法法、DNA电电泳泳的的基基本本方方法法、染染色色体体标标本本制制备备技技术、各种层析技术的原理及基本操作方法。术、各种层析技术的原理及基本操作方法。基本技能性实验及设置原则基本技能性实验及设置原则趟唆遣延惺则损臆堤少墟多曲宏锄蓝迟边惫本嚣纂暇倍茬躬横葵弧慧榨买分子医学实验绪论分子医学实验绪论 目目的的：除除了了应应用用基基本本技技能能训训练练部部分分的的实实验验技技术术，本本类类别别实实验验还还将将学学习习PCR技技术术、蛋蛋白白印印迹迹技技术术、人人类类外外周周血血染染色色体体标标本本制制备备及核型分析等。及核型分析等。同同时时密密切切结结合合临临床床问问题题，有有针针对对性性训训练练学学生生从从事事临临床床研研究究的的思思路路及及掌掌握握自自行行设设计计实实验验的基本知识。的基本知识。综合性实验及设置原则综合性实验及设置原则 包括：人类外周血染色体标本的制备包括：人类外周血染色体标本的制备及核型分析；及核型分析；DMD基因突变检测；综合实基因突变检测；综合实验设计。验设计。编熄胁囚量序涂踊预汤叹智辅荆智跨铆歇披莉独竖右更储挑棘点堂愉兄裕分子医学实验绪论分子医学实验绪论 现代医学研究新技术介绍现代医学研究新技术介绍 目目的的：现现代代医医学学的的发发展展与与多多种种新新技技术术的的发发展展与与建建立立是是密密切切相相关关的的，由由于于本本科科实实验验教教学学能能掌掌握握的的技技术术有有限限，因因此此设设置置了了通通过过理理论论教教学学与与视视频频观观摩摩相相结结合合的的课课程程来来了了解解蛋蛋白白质质组组学学技技术术、基基因因芯芯片片技技术术、基基于于序序列列捕捕获获技技术的二代测序技术及它们的临床应用。术的二代测序技术及它们的临床应用。咋沮撵往锐放伞尼遗怔讼烂砖勘炽必垒邦囤陆魂煌砧层殉疑牲绞伞扇琳姻分子医学实验绪论分子医学实验绪论 第一层次：掌握基本实验技能第一层次：掌握基本实验技能第一层次：掌握基本实验技能第一层次：掌握基本实验技能 蛋白质、蛋白质、DNADNA提取方法及定量测定提取方法及定量测定方法方法 电泳技术电泳技术 层析技术层析技术 PCR PCR技术技术 染色体标本制备技术染色体标本制备技术 蛋白印迹技术蛋白印迹技术 第二层次：了解现代医学研究新技术第二层次：了解现代医学研究新技术第二层次：了解现代医学研究新技术第二层次：了解现代医学研究新技术 蛋白质组学技术蛋白质组学技术 基因芯片技术基因芯片技术 基于序列捕获技术的二代测序技术基于序列捕获技术的二代测序技术 第三层次：学习科研设计的基本思路第三层次：学习科研设计的基本思路第三层次：学习科研设计的基本思路第三层次：学习科研设计的基本思路通过本实验课程教学达到目的：通过本实验课程教学达到目的：实实验验操操作作、新新技技术术介介绍绍、视视频频观观摩摩合合理理穿穿插插安安排排，便便于于有效利用时间。有效利用时间。胸帧走鸥折述跟炼边减掩帐贾矾驻愉漳事夕摊授蘑簧羔魄胯国渤梢巳哪呼分子医学实验绪论分子医学实验绪论p 生物样本中蛋白质的提取和含量测定生物样本中蛋白质的提取和含量测定p SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量测定蛋白质相对分子质量p 基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术p 层析技术（凝胶过滤，离子交换，薄层层析，层析技术（凝胶过滤，离子交换，薄层层析，HPLC）p 真核生物基因组真核生物基因组DNA提取、含量和纯度测定提取、含量和纯度测定p 人外周血染色体标本制备、人外周血染色体标本制备、DMD基因突变检测基因突变检测p 染色体染色体G分带和核型分析及遗传病基因突变分析分带和核型分析及遗传病基因突变分析p 设计性实验项目设计性实验项目八周实验课的内容安排八周实验课的内容安排总体实验安排（总体实验安排（8个个 实验各有长短，个别实验可能会实验各有长短，个别实验可能会超时，但总时间大致不变）超时，但总时间大致不变）漳蝶慢鸭角满屹浑疟慷迄彼丢氟拥泥资剥羔咱炊鹿瘩卵晨掳侵正距厦象楷分子医学实验绪论分子医学实验绪论实验报告实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：按照下列顺序写出实验报告：实验报告首页：实验名称（实验报告首页：实验名称（The title of experiment）；姓名；学号；班级；组别；同组）；姓名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期等。同学；带教教师；实验日期等。正文：正文：原理（原理（Principle）；）；操作步骤操作步骤（Operational procedure）；）；实验结果实验结果（Results）：包括照片、原始数据、计算过程及）：包括照片、原始数据、计算过程及图表等；图表等；讨论（讨论（Discussion）：对实验方法，）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。实验设计的认识、体会和建议。陀莱轩旁奏龙刻递牲畏里实左翌线业庄牲万是隧粥由碘眶引稠霄页铬炽慰分子医学实验绪论分子医学实验绪论动物细胞蛋白质的提取和含量测定动物细胞蛋白质的提取和含量测定 蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能研究，是生命科学的核心问的结构与功能研究，是生命科学的核心问题。题。要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质相关研究中的必备技术。定则是蛋白质相关研究中的必备技术。叶值询躁剂炮隐颊媳刘序蛋句从疏烬陛朽脉叶支叔罕搀逸傣候宁稠勋泵丛分子医学实验绪论分子医学实验绪论基本原理基本原理 动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。析。计标少靠誉洁策轨踞抱包浸下甫疑楞仟盏魁抛肌诲沧晴摔杠键防播缀坷撂分子医学实验绪论分子医学实验绪论蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。白质发生变性和被蛋白酶降解。基本的防范措施是尽可能缩短提取时基本的防范措施是尽可能缩短提取时间和在尽可能低的温度下进行提取。间和在尽可能低的温度下进行提取。芹滁廷烂低巍僳源翁攫搁抠再读追俘祁邓蜜搬神灭赴缮惦坯仲诡刮爆薛爵分子医学实验绪论分子医学实验绪论为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。入蛋白酶抑制剂。例如加入苯甲磺酰氟（例如加入苯甲磺酰氟（PMSFPMSF）可以抑制丝）可以抑制丝氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）可抑制金属蛋白酶。）可抑制金属蛋白酶。望逐花笼毡苟带刁拘侵诗曼继毯炯杉桔豪履肯啄效惋充款病镶杠摸蓬警赊分子医学实验绪论分子医学实验绪论为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度的合物，可在溶液中加入一定浓度的EDTAEDTA。砒酉薯傈穿呛计固傀佑杠幂枯烟颜淀委烹仲仓开鱼代僵围旅憨留练尝蛀嫡分子医学实验绪论分子医学实验绪论目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法（法、双缩尿法（Biuret法）、法）、Folin酚试酚试剂法（剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、法）、BCA法和紫外吸收法。法和紫外吸收法。其中其中Bradford法和法和Lowry法灵敏度较高，法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏比紫外吸收法灵敏1020倍，比倍，比Biuret法法灵敏灵敏100倍。倍。罢拼忿大即枣钙映识盛嗜瘫殿禽茬焚脂蹄瑞说诺铅臻厢赞另霜迂哑猜蔡姓分子医学实验绪论分子医学实验绪论上述这些方法并不能在任何条件下适用于上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。都有其优缺点。在选择方法时应考虑：在选择方法时应考虑：实验对测定所要实验对测定所要求的灵敏度和精确度；求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花测定所要花费的时间。费的时间。笨熄瞬穷潘檬羞该滨颓济择宫业卫胆坤佰奏板曹环仁伪垛奖颓哼励阎济辈分子医学实验绪论分子医学实验绪论Lowry法：法：该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与碱性条件下进而与Folin酚试剂形成蓝色酚试剂形成蓝色复合物。复合物。上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。品的蛋白质含量。婚买猛汰拎该辉胯宙赋毯苞蔷浮酋颜觅扑涕洲称眉矿裴醇东驯丁涡话恒朴分子医学实验绪论分子医学实验绪论考马斯亮兰法：考马斯亮兰法：考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复蛋白质复合物在合物在595 nm下，吸光度与蛋白质含量呈下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。艳俞佐辈险纯箱柒弦踊湾探琳说秒烂样骆嘴瘫裹郊拆弗肇垮泻蝎肇荷诡烃分子医学实验绪论分子医学实验绪论紫外吸收法测定蛋白质浓度：紫外吸收法测定蛋白质浓度：蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大这两种芳香族氨基酸分子中含有大键，它键，它们在们在280 nm紫外光附近有光吸收。紫外光附近有光吸收。因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。其进行含量测定。剁民侯跳唁辫咳棺捷霍类胖德掀呛杖豪到韭汐铀营工萄洁迟祁峭个条苯皆分子医学实验绪论分子医学实验绪论操作步骤操作步骤 1用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，小心去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的小心去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。烧杯中漂洗干净。2取小鼠肝组织取小鼠肝组织0.5 g，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。浆管中。3按按1：15的比例往玻璃匀浆管中加入匀浆缓冲液的比例往玻璃匀浆管中加入匀浆缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液7.3mL，蛋白，蛋白酶抑制剂酶抑制剂0.2 mL），手动匀浆。注意用力均匀，以），手动匀浆。注意用力均匀，以免损坏匀浆管。免损坏匀浆管。4匀浆完成后，取两只匀浆完成后，取两只1.5 mL eppendorf管，各加管，各加入入1.2 mL匀浆液后，置入冷冻离心机中。匀浆液后，置入冷冻离心机中。5于于4，13000 rpm离心离心20分钟后，小心取出上清分钟后，小心取出上清液至液至1.5 mL eppendorf管中，上清液需低温保存，管中，上清液需低温保存，作为待测样品备用。作为待测样品备用。馅摩基更野胞纤僵珊谗房疑芜乘婶仓戳架呸蛊芦闻雄髓擒鸿谷就艇假议禁分子医学实验绪论分子医学实验绪论Lowry法法 1取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，支，标明号码，放置在试管架，在放置在试管架，在16号试管内分别加入号试管内分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至水稀释至0.5 mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用双蒸水补足至每管总体积，用双蒸水补足至每管总体积0.5 mL，在，在7、8号试管内分别加入待测样号试管内分别加入待测样品品25、50 L，并用双蒸水补足至，并用双蒸水补足至0.5 mL（即将待测样品稀释（即将待测样品稀释20或或10倍）。倍）。916号号重复重复18号。号。成焉碘琵编篓莆拳掷摇染解纂油捷培坞慌瞎若郴椭只怨卤裳粤疥串辆楔膳分子医学实验绪论分子医学实验绪论2各管加入各管加入2.5 mL新配制的碱性铜溶液，新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置立即摇匀，在室温下放置10min。3各管加入各管加入0.5 mL Folin酚试剂应用液，酚试剂应用液，边加入边立即充分混合（用震荡混合器），边加入边立即充分混合（用震荡混合器），然后在室温下放置然后在室温下放置3060min（不要超过（不要超过60min）。）。4将标准样品及待测样品在可见光光度计将标准样品及待测样品在可见光光度计上在上在550 nm波长下比色。波长下比色。5根据已知含量的标准样品测得的吸光度根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。量。店缄范姐厅粤氰豌折氨阿紊列卉薪病闪帘脂驳痒嚣窿妨梨砍餐揩棒结珍尤分子医学实验绪论分子医学实验绪论考马斯亮兰法测定蛋白质浓度考马斯亮兰法测定蛋白质浓度 1取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，支，标明号码，放置在试管架，在放置在试管架，在16号试管内分别加入号试管内分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至水稀释至0.5 mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用双蒸水补足至每，用双蒸水补足至每管总体积管总体积0.1 mL，在，在7、8号试管内分别加号试管内分别加入稀释入稀释20、10倍的待测样品倍的待测样品0.1 mL。916号重复号重复18号。号。增谭贾挽齐建割咨鉴恭则毡掷定夏韩蹦毖机憋白珊到硬芋竣妙膜钟积肋安分子医学实验绪论分子医学实验绪论2每管加入考马斯亮兰每管加入考马斯亮兰G250染料试剂染料试剂3 mL,摇匀，室温静置摇匀，室温静置3分钟。分钟。3分光光度计于波长分光光度计于波长595nm比色。比色。4根据已知含量的标准样品测得的吸光度根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。量。亩拆贤堵耘怖灌鞭咙扶赘却印畦圣亮铺熙攻壳踏椽伟屑密攀陋饭瑞蛛云笋分子医学实验绪论分子医学实验绪论紫外吸收法测定蛋白质浓度紫外吸收法测定蛋白质浓度 1取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，支，标明号码，放置在试管架，在放置在试管架，在16号试管内分别加入号试管内分别加入标准牛血清白蛋白（标准牛血清白蛋白（2 mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.7 5、0.9 mL，用双蒸水补足，用双蒸水补足至每管总体积至每管总体积3 mL，在，在7、8号试管内分别号试管内分别加入稀释加入稀释100、50倍的待测样品倍的待测样品3 mL。916号重复号重复18号。号。咒伍援榔崎符兑零饭氦凝姨合黄迟镁竟丹郡苛府意远川栏寝递烬丫萌尧见分子医学实验绪论分子医学实验绪论2以以1号管为参比，用紫外分光光度计于号管为参比，用紫外分光光度计于波长波长280 nm处比色。处比色。3根据已知含量的标准样品测得的吸光度根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量。释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量。惑弱壳及喻涯幢皮看钻帮枫辕法批贸氧坤傻她丈蔚宣亦翁陛拔质缩侄狗腮分子医学实验绪论分子医学实验绪论饭盒里的离心管和加样枪盒里的饭盒里的离心管和加样枪盒里的tip头均为无菌，头均为无菌，不要用手取用，离心管需用镊子拿取。用完即刻不要用手取用，离心管需用镊子拿取。用完即刻盖上盖子，保持无菌。盖上盖子，保持无菌。不同规格的移液器，使用不同的移液枪头。装上不同规格的移液器，使用不同的移液枪头。装上和取下时动作要轻。避免损坏。不同的量程范围和取下时动作要轻。避免损坏。不同的量程范围的移液器有不同的最大和最小刻度，调节时不得的移液器有不同的最大和最小刻度，调节时不得超过其最大和最小刻度，否则，会造成移液器损超过其最大和最小刻度，否则，会造成移液器损坏。不同规格的移液器，吸取的量要在其可调范坏。不同规格的移液器，吸取的量要在其可调范围内，否则会引起吸样量不准确。围内，否则会引起吸样量不准确。取液量都极为微小，吸样量要准确。每把移液器取液量都极为微小，吸样量要准确。每把移液器都有二档，吸取时，压至一档，打出时，压至二都有二档，吸取时，压至一档，打出时，压至二档。档。鳞糯窝辣摹迂阐欲谎建燥妨贮藉固吴酗尾肋苑彬耽敲垮阿咒栽壁链宏丰咋分子医学实验绪论分子医学实验绪论