环介导等温扩增技术.ppt

环介导等温扩增（环介导等温扩增（LAMPLAMP）检测金黄色葡萄球菌）检测金黄色葡萄球菌摘要摘要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMPLAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的方法。根据金黄色葡萄球菌的femAfemA基因设计了引物基因设计了引物,然后进行然后进行LAMPLAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。并与实际样品进行检出率的比较。LAMPLAMP方法特异性好方法特异性好,最最佳反应温度为佳反应温度为61,61,只对金黄色葡萄球菌进行扩增只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏灵敏度高度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 89cfu/mL9cfu/mL时仍时仍能检出。能检出。LAMPLAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。球菌的新方法。简介：金黄色葡萄球菌简介：金黄色葡萄球菌(S taphy lococcus aureus)(S taphy lococcus aureus)是引起食是引起食物中毒的主要致病菌之一物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌原菌,在自然界中广泛存在在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin(methicillinresistantStaphylococcus aureus,MRSA)resistantStaphylococcus aureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方金黄色葡萄球菌的检测方法有很多法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR PCR 法等。法等。环介导恒温扩增技术环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amp(loop-mediated isothermal amp lification,LAMP)lification,LAMP)是是NotomiNotomi等等20002000年发明的一种新颖的扩增技术年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的其特点是针对靶基因的6 6个区域设计个区域设计4 4种特异引物种特异引物,在在DNADNA聚合酶聚合酶(B st(B st DNA polymerase)DNA polymerase)的作用下的作用下,恒温条件下进行核酸扩增恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度大大加快了反应的速度 。国外报道国外报道,LAMP,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫如巴西芽生菌、锥虫病病 、沙门氏菌、沙门氏菌 、虾中的白斑综合症病毒、虾中的白斑综合症病毒 、志贺氏菌属和大肠杆菌、志贺氏菌属和大肠杆菌 。本研究针对金黄色葡萄球菌的。本研究针对金黄色葡萄球菌的femAfemA基因设计一套基因设计一套LAMPLAMP引物引物,对金黄对金黄色葡萄球菌进行检测色葡萄球菌进行检测,优化反应条件优化反应条件,确定检测特异性确定检测特异性,对对lamplamp法与法与PCRPCR法的灵敏度进行了对比。法的灵敏度进行了对比。LAMPLAMP的技术原理：的技术原理：LAMP LAMP方法的特点是针对靶基因的方法的特点是针对靶基因的6 6个区域设计个区域设计4 4 种特异引物种特异引物,利用一种链置换利用一种链置换DNA DNA 聚合酶聚合酶(BstDNApolymerase)(BstDNApolymerase)在恒温条件在恒温条件(60(60 65)65)保温几十保温几十分钟分钟,即可完成核酸扩增反应即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到到101099 10101010个拷贝。个拷贝。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。电泳、紫外观察等过程。材料与方法材料与方法1.1.材料与仪器材料与仪器 材料：材料：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)、铜绿假单胞、铜绿假单胞菌菌(Pseudom onas aeruginosa)(Pseudom onas aeruginosa)、沙门氏菌、沙门氏菌(Salm onella enterica)Salm onella enterica)、沙门氏菌、沙门氏菌(Salm(Salm onella sp)onella sp)、荧光假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudom onas f(Pseudom onas f luorescence)luorescence)、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudom onas(Pseudom onas putida)putida)，沙门氏菌，沙门氏菌(Salm onellaHJ-004)(Salm onellaHJ-004)、志贺菌志贺菌(Shigella spp )(Shigella spp )、单增李斯特菌、单增李斯特菌(L(L isteria mmonocytogenes)isteria mmonocytogenes)、大肠杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)ETEC:44247(6:15:16)Escherichia coli)ETEC:44247(6:15:16)、EPEC:44706(111:58)EPEC:44706(111:58)、单增李斯特菌、单增李斯特菌(L(L isteria m onocytogenes)isteria m onocytogenes)，蜡状芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌(B(B acillus cereus)acillus cereus)、瑞士乳杆菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus(Lactobacillus helveticus )helveticus )、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌(Lactococcus(Lactococcus lactis)lactis)、嗜热链球菌、嗜热链球菌(S treptococcus therm(S treptococcus therm ophilus KLDS)ophilus KLDS)、双歧杆菌、双歧杆菌(Lactobacillus bif(Lactobacillus bif idus KLDS)idus KLDS)，B stDNA B stDNA 聚合酶聚合酶(New England B(New England B iolab)iolab)、DNA markerDL2000DNA markerDL2000仪器：仪器：DYY-10C DYY-10C型电泳仪型电泳仪 UVPUVP凝胶成像仪凝胶成像仪2.2.实验方法实验方法 DNA DNA模板的制备模板的制备 煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取取1mL 1mL 于于EPEP管中管中12000 r/min,12000 r/min,离心离心5min 5min 收集菌体收集菌体,加入加入TE-TE-Trinton200LTrinton200L混匀后混匀后,于沸水中于沸水中5min,5min,后后12000 r/min 12000 r/min 离心离心5min,5min,取上面取上面50L50L作为作为LAMPLAMP扩增及扩增及PCRPCR扩增反应的模板。另用试扩增反应的模板。另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNADNA备用。备用。引物的设计与合成引物的设计与合成 根据金黄色葡萄球菌根据金黄色葡萄球菌femAfemA基因基因,应用应用PrimerExp lorer 3 PrimerExp lorer 3 设计特异引物设计特异引物,包括两条外引物包括两条外引物F3F3、B3,B3,内引物内引物F IPF IP、B IPB IP。LAMP LAMP反应及条件的优化反应及条件的优化 LAMP LAMP反应：反应：配置反应体系为配置反应体系为25L,25L,包括包括:018mmol/L:018mmol/L FIP,018mmol/L B IP,012mmol/L F3,012mmol/L B3,FIP,018mmol/L B IP,012mmol/L F3,012mmol/L B3,116mmol/L dNTPs,018mmol/L betaine,4mmol/L MgSO4,116mmol/L dNTPs,018mmol/L betaine,4mmol/L MgSO4,20mmol/L Tris-HCl(pH818),10mmol/L KCl,10mmol 20mmol/L Tris-HCl(pH818),10mmol/L KCl,10mmol/L(NH4)2 SO4,2L DNA/L(NH4)2 SO4,2L DNA 模板模板,混匀。混匀。95,5min,95,5min,然后然后冰浴冰浴5min5min。加入。加入8U BstDNA8U BstDNA聚合酶聚合酶,于于6565扩增扩增1h,801h,80灭活灭活10min,10min,产物于产物于210%210%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测。反应条件的优化：反应条件的优化：分别改变反应温度、分别改变反应温度、Mg2+Mg2+浓度浓度LAMPLAMP扩增扩增,电泳观察扩电泳观察扩增产物增产物,确定最适的反应条件。确定最适的反应条件。特异性实验：特异性实验：用建立的用建立的LAMPLAMP方法扩增大肠杆菌、沙门氏菌等其他方法扩增大肠杆菌、沙门氏菌等其他18 18 株菌株株菌株,电泳观察扩增产物电泳观察扩增产物,验证方法的特异性。验证方法的特异性。灵敏度实验：灵敏度实验：取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液,以以1010倍比进行稀倍比进行稀释至释至10-110-110-9,10-9,取各稀释度菌液取各稀释度菌液1mL1mL进行平板计数。同时进行平板计数。同时,取各稀释度菌液取各稀释度菌液1mL,1mL,用煮沸法提取用煮沸法提取DNA,DNA,取取2L2L上清液作为模板上清液作为模板进行进行LAMPLAMP扩增。扩增。原料乳样品的检测：原料乳样品的检测：采用建立的采用建立的LAMPLAMP方法对从农场采的原料乳进行实际方法对从农场采的原料乳进行实际检测检测,同时采用金黄色葡萄球菌国标同时采用金黄色葡萄球菌国标GB/T 4789110-GB/T 4789110-20032003对样品进行检测对样品进行检测,两种方法进行对比两种方法进行对比,确定确定LAMPLAMP直接检直接检测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度。测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度。结果与分析结果与分析1.LAMP 1.LAMP 方法反应条件的优化方法反应条件的优化 反应温度反应温度 B st DNA B st DNA聚合酶的最适反映温度为聚合酶的最适反映温度为65,65,选择选择5757、5959、6161、6363、6565五个不同的反应温度五个不同的反应温度,结果如图结果如图1,1,在同样的反应体系条件下在同样的反应体系条件下,6161时扩增的效果更好时扩增的效果更好,因此最适因此最适LAMPLAMP反应温度为反应温度为6161。图图1 1反应温度对反应温度对LAMPLAMP反应的影响反应的影响M:DL2000 DNA Marker;M:DL2000 DNA Marker;1:57;2:59;3:61;4:1:57;2:59;3:61;4:63;5:6563;5:65。图图2 2Mg2+Mg2+浓度对浓度对LAMPLAMP反应的影响反应的影响 M:DL2000 DNA Marker;1:1mmol/L;2:M:DL2000 DNA Marker;1:1mmol/L;2:2mmol/L;3:3mmol/L;4:4mmol/L;5:2mmol/L;3:3mmol/L;4:4mmol/L;5:5mmol/L5mmol/L。Mg2+Mg2+浓度的影响浓度的影响 选择以不同浓度的选择以不同浓度的Mg2+Mg2+梯度来优化梯度来优化LAMPLAMP反应体系中的反应体系中的Mg2+Mg2+浓度浓度,结果如图结果如图2,2,同等条件下为同等条件下为6mmol/L6mmol/L时时,扩增最为明显扩增最为明显,因此本实因此本实验验LAMPLAMP反应体系的反应体系的Mg2+Mg2+浓度为浓度为6mmol/L6mmol/L。图图5 5 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌LAMPLAMP特异性的检测结果特异性的检测结果2.2.特异性特异性 本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌、大肠本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等其他菌株进行杆菌、沙门氏菌等其他菌株进行LAMPLAMP扩增反应扩增反应,结果如图结果如图5 5所示所示,金黄色葡萄球菌有条带出现金黄色葡萄球菌有条带出现,其他菌株未出现条带其他菌株未出现条带,表明表明LAMPLAMP扩增反应特异性强。扩增反应特异性强。图图3 3与图与图4 4金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌LAMPLAMP与与PCRPCR检测的灵敏性实验检测的灵敏性实验与与PCRPCR检测的灵敏性实验检测的灵敏性实验1:10-1;2:10-2;1:10-1;2:10-2;3:10-3;4:10-4;5:10-5;6:10-6;7:10-7;3:10-3;4:10-4;5:10-5;6:10-6;7:10-7;8:10-8;9:10-98:10-8;9:10-9。3.LAMP 3.LAMP 灵敏度实验及灵敏度实验及PCRPCR检测检测 当菌液稀释当菌液稀释101088时时,LAMP,LAMP扩增产物扩增产物,而当稀释而当稀释104104到到PCR PCR 已无扩增条带已无扩增条带,说明说明LAMPLAMP扩增灵敏度高于扩增灵敏度高于PCRPCR扩增。由平扩增。由平板计数计算表明板计数计算表明,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 89cfu/mL9cfu/mL时仍能检出。时仍能检出。4.4.对样品的检测结果对样品的检测结果 采自奶场的采自奶场的125125份样品进行了检测。结果表明份样品进行了检测。结果表明,LAMP,LAMP检测出阳性样品检测出阳性样品8181份份,GB/T 4789.10-2003,GB/T 4789.10-2003检测出阳性样品检测出阳性样品8484份份,LAMP,LAMP阳性检出率为阳性检出率为96.43%96.43%。图图5 5金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌LAMPLAMP特异性的检测结果特异性的检测结果M:DL2000 DNA Marker;1:M:DL2000 DNA Marker;1:金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:ATCC25923;2:沙门氏菌沙门氏菌CGMCC 111552;3:CGMCC 111552;3:沙门氏菌沙门氏菌ATCC13067;4:ATCC13067;4:沙门氏菌沙门氏菌HJ-004;5:HJ-004;5:ETEC:44247(61516);6:EPEC:44706(11158-);ETEC:44247(61516);6:EPEC:44706(11158-);7:7:荧光假单胞菌荧光假单胞菌CGMCC 111802;8:CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌恶臭假单胞菌CGMCC111819;CGMCC111819;9:9:铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853;ATCC27853;10:10:志贺菌志贺菌HJ-14;11:HJ-14;11:单增李斯特菌单增李斯特菌CMCC54002;12:CMCC54002;12:单增李斯特菌单增李斯特菌HJ-35;13:HJ-35;13:大肠杆菌大肠杆菌ATCC25922;14:ATCC25922;14:大肠杆菌大肠杆菌O157:H7;15:O157:H7;15:蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌KLDS71;KLDS71;16:16:瑞士乳酸杆菌瑞士乳酸杆菌KLDS-8;17:KLDS-8;17:乳酸乳球菌乳酸乳球菌KLDS-36;18:KLDS-36;18:嗜热链球嗜热链球菌菌KLDS;19:KLDS;19:双岐乳杆菌双岐乳杆菌KLDS;N:KLDS;N:阴性对照。阴性对照。结论结论 金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一菌之一,给奶业生产带来严重的影响。给奶业生产带来严重的影响。LAMPLAMP技术根据靶序技术根据靶序列上的列上的6 6 个特定区域设计引物个特定区域设计引物,在具有链置换活性的在具有链置换活性的DNA DNA 聚合酶作用下聚合酶作用下,恒温进行扩增恒温进行扩增,环引物的设计大大提高了反环引物的设计大大提高了反应的速度。由于反应过程中应的速度。由于反应过程中,核算合成时核算合成时,从从dNTPsdNTPs析出的析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结核焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结核,产生大量的焦产生大量的焦磷酸酶使反应呈现混浊磷酸酶使反应呈现混浊,可通过肉眼观察反应是否进行。可通过肉眼观察反应是否进行。本研究针对金黄色葡萄球菌的本研究针对金黄色葡萄球菌的femA femA 基因设计合成了基因设计合成了LAMPLAMP引物进行扩增引物进行扩增,并对各反应条件进行优化并对各反应条件进行优化,对大肠杆菌等实对大肠杆菌等实验结果显示特异性强。本研究对金黄色葡萄球菌的检测限验结果显示特异性强。本研究对金黄色葡萄球菌的检测限8 89cfu/mL,9cfu/mL,比比PCRPCR的检测灵敏度高。另外的检测灵敏度高。另外,由于本文采用由于本文采用煮沸法提取模板煮沸法提取模板DNA,DNA,使使PCRPCR灵敏度有些降低。灵敏度有些降低。总之总之,LAMP,LAMP方法是一种特异性强、灵敏度高、方法是一种特异性强、灵敏度高、方便快捷的检测方法方便快捷的检测方法,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的方法的方法,具有很高的使用价值。具有很高的使用价值。谢谢欣赏！谢谢欣赏！后面内容直接删除就行后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用主要经营：网络软件设计、图文设计制作、主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPTPPT设计、计划书、策划案、学习课件、各设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a and make it into a film to be used in a wider fieldwider field