过表达miR-664a-5p激活Wnt_β-catenin信号通路促进骨质疏松大鼠骨重建.pdf

1298Published doi:10.3969/j.issn.1006-7108.2023.09.009ChinJOsteoptember2023.Vol29.No.92023年9 月第2 9 卷第9 期中国骨质疏松杂志过表达miR-664a-5p激活Wnt/-catenin信号通路促进骨质疏松大鼠骨重建赵敏*孙红刚寒洁贺前松八一骨科医院检验科，四川成都610000中图分类号：R580文献标识码：A文章编号：10 0 6-7 10 8（2 0 2 3)0 9-12 98-0 7摘要：目的探究过表达miR-664a-5p的脂肪间充质干细胞（miR-664a-5p-ADSCs）通过激活Wnt/-catenin信号通路对骨质疏松（OP）大鼠骨重建的促进作用。方法将大鼠分为Sham组、OVX组、ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组。切除卵巢建立OP大鼠模型,Sham组仅切除脂肪组织。3个月后，ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组分别尾静脉注射miR-664a-5p-ADSCs及其阴性对照ADSCs;Sham组和OVX组注射等量生理盐水。1个月后进行指标检测。micro-CT、H E染色、TRAP染色检测OP大鼠骨重建情况；免疫组化染色、RT-qPCR、W e s t e r n b l o t 检测Runx2、A LP、O CN、W n t、-cateninmRNA和蛋白的表达。结果Sham组骨小梁完整，破骨细胞较少；与Sham组相比，OVX组骨小梁稀疏且变薄，破骨细胞较多；Runx2、A LP、O CN、W n t、-cateninmRNA和蛋白水平明显降低（P0.05）；与OVX组相比，ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨小梁增加且增厚，破骨细胞较少；Runx2、A LP、O CN、W n t、-cateninmRNA和蛋白水平明显升高，且miR-664a-5p-ADSCs组上述效果强于ADSCs组（P0.05）。结论过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。关键词：miR-664a-5p；脂肪间充质干细胞；Wnt/-catenin信号通路；骨质疏松；骨重建Overexpression of miR-664a-5pactivates Wnt/-Catenin signaling pathway promotes boneremodeling in osteoporosis ratsZHAO Min*,SUN Honggang,JIAN Jie,HE QiansongDepartment of Laboratory,Bayi Orthopedic Hospital,Chengdu 610000,China*Corresponding author:ZHAO Min,Email:zhaomin349167 Abstract:Objective To explore the promoting effect of overexpression of miR-664a-5p in ADSCs(miR-664a-5p-ADSCs)onbone remodeling in osteoporosis(OP)rats via activating Wnt/-catenin signal pathway.Methods Rats were divided into Shamgroup,OVX group,ADSCs group,and miR-664a-5p-ADSCs group.OP rat model was established by ovariectomy.Adipose tissuewas removed only in Sham group.After 3 months,rats in the ADSCs group and the miR-664a-5p-ADSCs group were injected withADSCs or miR-664a-5p-ADSCs through tail vein,respectively.Rats in Sham group and OVX group were injected with the sameamount of normal saline.Index detection was performed after 1 month.Micro-CT,HE staining,and TRAP staining were used todetect bone remodeling in OP rats.Immunohistochemical staining,RT-qPCR,and Western blotting were used to detect theexpressions of Runx2,ALP,OCN,Wnt,and-Catenin mRNA and protein.Results In Sham group,the bone trabeculae werecomplete and osteoclasts were few.Compared with that in Sham group,the bone trabeculae in OvX group were sparse and thin,andthere were more osteoclasts.The levels of Runx2,ALP,OCN,Wnt,and-Catenin mRNA and protein decreased significantly(P0.05).Compared with those in OVX group,bone trabeculae in ADSCs group and miR-664a-5p-ADSCs group increased andthickened,and osteoclasts were less.The levels of Runx2,ALP,OCN,Wnt,and-Catenin mRNA and protein increasedsignificantly(P0.05).The above effects in miR-664a-5p-ADSCs group were stronger than those in ADSCs group(P0.05).Conclusion Overexpression of miR-664a-5p in ADSCs promotes bone remodeling in OP rats via activating Wnt/-catenin signalpathway.Key words:miR-664a-5p;adipose-derived stem cells;Wnt/-catenin signal pathway;osteoporosis;bone remodeling基金项目：成都市医学科研课题（2 0 2 2 10 0）*通信作者：赵敏，Email：z h a o m i n 34916 7 16 3.c o m骨质疏松（OP)是一种慢性系统性骨病,以老年人和绝经后妇女居多，主要表现为骨微细结构破坏中国骨质疏松杂志2023年9 月第2 9 卷第9 期Chin JOsteoporos,September2023,Vol29,No.91299和骨量下降 。当骨重建失衡时，骨形成少于骨吸收,进而引发Op2。脂肪间充质干细胞(ADSCs)可分化为脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞,同时具有较低的免疫排斥性3。研究表明ADSCs在OP中扮演重要角色4，如ADSCs能够促进OP裸鼠骨再生5,修复OP大鼠胫骨缺损6 、颅骨缺损等7 。然而其成骨机制尚不清楚。miRNA是一种约为2 0 nt的非编码RNA,能够参与细胞增殖、迁移及成骨细胞分化等过程。一些研究表明miR-664的异常表达与细胞分化有关。如miR-664-5p通过靶向血清应答因子和Wnt1促进成肌细胞增殖并抑制成肌细胞分化。miR-664a-5p 促进SH-SY5Y细胞的神经元分化)。miR-664a-5p促进骨髓间充质干细胞（BM SCs)成骨分化10)。绝经后妇女骨组织miRNA表达谱显示，miR-664a-5p表达显著下调1,这表明miR-664a-5p可能参与ADSCs对OP的成骨分化。Wnt/-catenin信号通路在调控细胞成骨分化、OP发病和进展中起重要作用12 。研究发现柚皮苷通过激活Wnt/-catenin通路，促进ADSCs成骨分化13。胎盘间充质干细胞通过激活Wnt/-catenin通路，促进OP骨折大鼠成骨4。然而ADSCs是否通过调控Wnt/-catenin通路促进OP骨重建研究较少。本研究通过观察过表达miR-664a-5p的ADSCs对OP大鼠骨重建的作用及对Wnt/-catenin通路的影响，以期为OP骨重建提供实验依据。1材料和方法1.1材料40只8 周龄体质量为2 0 0 2 2 0 g的SPF级雌性SD大鼠，购买于四川大学（实验动物中心）SCXK(川)2 0 18-0 2 6 。于室温2 3 2 5、标准湿度55%6 0%、光照/黑夜各12 h环境中饲养，饮水饮食正常，1周后实验。本研究通过八一骨科医院伦理委员会批准（2 0 2 10 312），实验过程遵循3R原则。1.2主要试剂和仪器胰蛋白酶、DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；CD34、CD 45、CD 90、CD 10 5抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；茜素红、油红0、碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒、Runt相关转录因子2（Ru n x 2）、A LP、骨钙素（OCN）抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。蛋白电泳仪、荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）；荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；Micro-CT显微扫描仪（德国Siemens公司）。1.3实验方法1.3.1ADSCs的培养与鉴定：ADSCs的分离和培养：取大鼠腹部脂肪组织，经胰酶消化、10 0 目滤网过滤后收集细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养，每隔48 h换液一次，取第3代ADSCs进行实验。ADSCs成骨分化：取第3代ADSCs，用成骨诱导液诱导分化，3周后进行ALP染色和茜素红染色，显微镜下观察成骨染色效果。ADSCs成脂分化：取第3代ADSCs，用成脂诱导液诱导分化，待脂滴变得足够大、圆时进行油红O染色，显微镜下观察成脂染色效果。ADSCs表面标志物的鉴定：取第3代ADSCs，分别加人FITC标记的CD34、CD 45、CD 90 及CD105,流式细胞仪检测细胞相应抗原的表达。1.3.2快慢病毒感染ADSCs:将过表达miR-664a-5p及阴性对照的慢病毒加人8 g/mLpolybrene感染ADSCs（记作miR-664a-5p-ADSCs组和ADSCs组）。感染2 4h后更换无病毒培养基。用嘌呤霉素筛选阳性细胞。1.3.3CCK-8法检测ADSCs增殖：将ADSCs接种于96 孔板，常规培养2 4、48、7 2 h。将原培养基更换成含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基。并置于37下孵育1h。检测样品在450 nm处的吸光度。1.3.4Transwell法检测ADSCs迁移：Transwell小室上室加人无血清培养基培养的各组ADSCs，下室加人含有10%胎牛血清的培养基，并置于37 下孵育2 4h。经甲醛固定，结晶紫染色后，显微镜下对穿膜细胞进行观察和统计。1.3.5ALP染色和茜素红染色法检测ADSCs成骨能力：取各组ADSCs，利用ALP染色和茜素红染色检测ADSCs成骨能力，方法同1.3.1。1.3.60P大鼠模型制作与分组：40 只大鼠随机分为假手术组（Sham）、卵巢摘除组（OVX）、A D SCs 组和miR-664a-5p-ADSCs组，每组各10 只。腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠、备皮消毒。自耻骨2 3cm纵向切开皮肤，分离筋膜，切除卵巢（桑葚状红色组织），缝合筋膜和皮肤组织。Sham组仅切除卵巢周围脂肪组织。3个月后，ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组分别尾静脉注射感染pHRi-miR-NC的ADSCs和感染pHRi-miR-664a-5p的ADSCs;Sham组和OVX组注射等量生理盐水。注射1个月后进行指标检测。实验过程中未有大鼠死亡。用1300ChinJOsteoporos,September2023,Vol29,No.9中国骨质疏松杂志2023年9 月第2 9 卷第9 期1.3.7micro-CT扫描和重建：造模4个月后处死大鼠，取股骨置于4%多聚甲醛中固定，避光保存。micro-CT对股骨进行扫描和重建，比较骨小梁厚度（T b.T h）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁间距（Tb.Sp）和骨体积分数（BV/TV）等指标。1.3.8HE染色观察新骨形成：将股骨置于EDTA脱钙液中脱钙，每隔2 d更换一次脱钙液，当探针能轻易刺破骨骼时表示脱钙完成。流水冲洗、脱水包埋，制作石蜡切片。切片经脱蜡、乙醇梯度脱水、HE染色、透明封片，显微镜下观察骨组织结构。1.3.9TRAP染色观察破骨细胞形成：石蜡切片经脱蜡、乙醇梯度脱水、TRAP染色、苏木精染细胞核、乙醇梯度脱水，透明封片，显微镜下观察破骨细胞染色情况并计数。1.3.10免疫组化染色检测Runx2、A LP、O C N水平：石蜡切片经脱蜡、脱水、高温抗原修复、血清封闭、加人Runx2、A LP、O CN一抗（1：40 0）4孵育过夜，二抗37 孵育1h，滴加DAB显色液、苏木精复染、脱水、透明封片，显微镜下观察染色情况并计算阳性面积百分比。1.3.11RT-qPCR检测miR-664a-5p、Ru n x 2、A LP、OCN、W n t、-cateninmRNA水平：采用Trizol试剂从股骨组织中提取总RNA并反转录为cDNA，使用SYBRGreen法进行扩增，GAPDH作内参。反应条件：95预变性6 0 s,9510 s，6 0 50 s，共40 个循环。使用2-ACT公式计算miR-664a-5p、Ru n x 2、ALP、O CNm RNA 相对表达水平。1.3.12Western blot检测 Runx2、A LP、O CN、W n t、-catenin水平：取各组股骨组织，提取并测定蛋白浓度，经电泳、转PVDF膜后，脱脂奶粉中封闭2 h，分别加人Runx2、A LP、O CN、W n t、-catenin一抗（1：2 0 0 0）4过夜，加入二抗（1：50 0 0）4孵育2h,ECL显色剂显色，凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白相对GAPDH的表达量。1.4统计学处理用SPSS16.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据用平均数土标准差表示，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两两比较用LSD-t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1ADSCs的形态观察和鉴定P3代ADSCs呈长梭形，形态趋于一致。ALP染色可见蓝紫色染色结节；茜素红染色可见橙红色钙化结节；油红O染色可见红色融合变大的脂滴。ADSCs表面标志物CD90和CD105呈阳性表达，造血干细胞标记物CD34和CD45呈阴性表达。见图1。ABCDE100100-100-10080808080601CD3460CD4560CD9060CD10540-40-4040-20202020000100-10。102010-10。1010-10101010-10。101010注：A:P3代ADSCs形态；B：A LP染色；C：茜素红染色；D：油红O染色；E：流式细胞仪检测。图1ADSCs的形态观察和鉴定（10 0）Fig.1Morphological observation and identification of ADSCs(100)2.2miR-664a-5p促进ADSCs增殖、迁移和成骨能力pHRi-miR-664a-5p感染ADSCs后，ADSCs中miR-664a-5p表达升高（P0.05）。CCK-8 实验、Transwell实验、ALP染色和茜素红染色结果显示，与ADSCs组相比,miR-664a-5p-ADSCs组ADSCs增殖、迁移和成骨能力明显提高（P0.05）。见图2。2.3miR-664a-5p-ADSCs对OP大鼠骨重建的作RT-qPCR结果显示，与Sham组相比，OVX组miR-664a-5p水平明显降低（P0.05）；与0 VX组相比,ADSCs 组、miR-664a-5p-ADSCs 组 miR-664a-5p水平明显升高（P0.05）；与ADSCs组相比，miR-2023年9 月第2 9 卷第9 期ChinJOsteoporos,September2023,Vol29,No.9中国骨质疏松杂志1301A20BADSCS1.57miR-664a-Sp-ADSCs15(uuost)anjevao1.0100.5-50.0ADSCsmiR-664a-Sp-ADSCs0244872Cultivationtime(h)ADSCsmiR-664a-5p-ADSCs400300200100ADSCSmiR-6640-Sp-ADSCsDADSCmiR-664a-5p-ADSCsEADSCsmiR-664a-5p-ADSCs注：A：RT-q PCR法检测miR-664a-5p表达；B：CCK-8 法；C：T r a n s w e l l 法；D：A LP染色E：茜素红染色；与ADSCs组比较，*P0.05。图2miR-664a-5p促进ADSCs增殖、迁移和成骨能力（10 0）Fig.2MiR-664a-5p promotes the proliferation,migration,and osteogenesis of ADSCs(100)664a-5p-ADSCs组miR-664a-5p水平明显升高（P0.05）。m i c r o-CT 结果和骨形态学指标显示，与Sham组相比，OVX组骨密度明显降低，横断面可见明显骨髓空腔,Tb.Th、T b.N和BV/TV明显减小,Tb.Sp明显增大（P0.05）与OVX组相比，ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨密度明显升高，骨髓空腔减小,Tb.Th、T b.N和BV/TV明显增大，Tb.Sp明显减小（P0.05）；与ADSCs组相比，miR-664a-5p-ADSCs组骨密度升高，骨髓空腔减小，Tb.Th、T b.N和BV/TV明显增大，Tb.Sp明显减小（P0.05）。HE染色和TRAP染色结果显示，Sham组骨小梁完整，破骨细胞较少;OVX组骨小梁稀疏且变薄，破骨细胞较多,说明OVX组大鼠OP严重。与OVX组相比，ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨小梁增加且增厚，破骨细胞较少。见图3。2.4miR-664a-5p-ADSCs对OP大鼠成骨相关基因Runx2、A LP及OCN表达的影响免疫组化染色、RT-qPCR和Westernblot检测结果显示，与Sham组相比，OVX组Runx2、A LP及OCNmRNA和蛋白水平明显降低（P0.05）；与OVX组相比，ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组Runx2、A LP及OCNmRNA和蛋白水平明显升高（P0.05）；与ADSCs组相比，miR-664a-5p-ADSCs组Runx2、A LP及OCNmRNA和蛋白水平明显升高（P0.05)。见图4。2.5miR-664a-5p-ADSCs 对OP大鼠Wnt/-catenin信号通路的影响RT-qPCR和Westernblot检测结果显示，与Sham组相比，OVX组Wnt、-cateninmRNA和蛋白水平明显降低（P0.05）；与OVX组相比，ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs 组Wnt、-catenin mRNA和蛋白水平明显升高（P0.05）；与ADSCs组相比，miR-664a-5p-ADSCs组Wnt、-catenin mRNA和蛋白水平明显升高（P0.05）。见图5。3讨论OP患者全身骨量减少，容易发生骨折。ADSCs具有快速繁殖和成骨分化的潜力，在治疗OP方面比BMSCs更有优势。OVX动物模型中，ADSCs成骨能力不受雌激素缺乏的影响，且成骨能力和健康动物相似，同时能够促进造血干细胞汇集到骨髓，为自体移植提供了可能15。研究表明OP大鼠近端和远端移植自体ADSCs均能增强骨密度，改善骨微细结构,促进骨再生16 17 。尾静脉注射ADSCs 能够抑制破骨细胞活性，增加骨密度，改善骨质病理结构；同时ADSCs还能分泌多种骨细胞激活因子，防止骨量流失18-19。另外研究发现OP患者ADSCs也能进行成骨分化2 0 。有学者分别从年轻和老年绝经后骨质疏松（PMOP）患者体内获取ADSCs，发现ADSCs均可发生增殖和成骨分化，且将PMOP患者ADSCs放人条件培养液后，其成骨潜能显著提1302ChinJOsteoporosSeptember2023,Vol29,No.9中国骨质疏松杂志2023年9 月第2 9 卷第9 期ABShamOVXADSCSmiR-664a-5p-ADSCs1.2L.0.80.60.40.20.0ShamOVXADSCsmiR-664a-5p-ADSCsC0.20-0.470.8#40.15-0.30.6(uau)dsqi(%)AI/A80.10-0.20.40.05-0.20.00ShamOVXADSCsmiR-664a-Sp-ADSCsShamOVXADSCsmiR-664a-Sp-ADSCsShamOVXADSCsmR-664e-Sp-ADSCsShamOVXADSCsmiR-664a-SpADSCsDShamOVXADSCSmiR-664a-5p-ADSCs50元EShamOVXADSCsmiR-664a-5p-ADSCs50注：A：RT-q PCR法检测miR-664a-5p表达；B：mi c r o-CT；C：骨形态学指标检测；D：H E染色（2 0 0）；E：T RA P染色（2 0 0 x）；与Sham组比较，*P0.05；与OVX组比较，P0.05；与ADSCs组比较，P 0.0 5。图3miR-664a-5p-ADSCs对OP大鼠骨重建的作用Fig.3Effect of miR-664a-5p-ADSCs on bone remodeling in OP rats高2 1-2 。另有研究者在临床上也通过自体移植ADSCs来修复患者的颅骨缺损2 3-2 4 和上颌骨缺损2 5。由此可见人源ADSCs具有一定的成骨潜能,可考虑作为移植的细胞来源。研究发现miR-664a-5p能够促进BMSCs的成骨分化2 6 ，且miR-664a-5p在绝经后妇女骨组织中表达显著下调 本研究发现miR-664a-5p能够提高ADSCs的增殖、迁移和成骨分化能力，从而为ADSCs的归巢和成骨分化提供了更大的可能。将miR-664a-5p-ADSCs经尾静脉注人去卵巢OP大鼠体内，发现OP大鼠骨组织miR-664a-5p水平较低，而miR-664a-5p-ADSCs显著促进新骨形成，且成骨情况优于单纯ADSCs组，与Sham组较接近。推测miR-664a-5p可能是影响OP发病的因素，且miR-664a-5p修饰的ADSCs能够增强miR-664a-5p表达，使移植后的ADSCs在宿主中存活更久，并分泌对OP有利的特定蛋白，起到治疗miR-664a-5p的目的。Runx2是骨形成和骨重塑的重要转录因子；ALP、O CN是成骨分化早期标志物，直接反映成骨细胞的活性和功能情况，在骨折患者体内表达异常升高。成骨细胞活性及其成骨分化能力是骨再生的必要条件。研究发现绝经后OP患者中成骨标志物ALP、O CN的表达显著降低，通过上调成骨相关基因和 Runx2的表达能够缓解 OP进展2-2 8 。在OP免右下颌骨牵张成骨过程中，Runx2修饰的ADSCs治疗促进了OP性下颌骨牵张成骨期间的新骨形成，并补偿了OP对新骨形成的不利影响2 9。本研究在基因和蛋白水平发现，miR-664a-5p-ADSCs组相比ADSCs组和OVX组，更能提高OP大鼠体内Runx2、A LP、O CN的表达，同时抑制破骨细胞活性，促进新骨生成。Wnt/-catenin信号通路参与成骨细胞增殖和分化，在OP的发病和进展中起重要作用。研究发现OP小鼠Wnt、-catenin表达下调，褪黑素通过激活Wnt/-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化和延缓OVX小鼠骨量丢失30 。同样巴戟天也通过激活Wnt/-catenin信号通路促进体内、体外MSCs的成骨分化能力31。本研究发现OVX组大鼠Wnt、-catenin表达下调，miR-664a-5p-ADSCs组相比ADSCs组明显提高Wnt、-cateninmRNA和蛋白水ChinJOsteoSeptember2023,Vol29,No.92023年9 月第2 9 卷第9 期中国骨质疏松杂志1303AShamOVXADSCsmiR-664a-Sp-ADSCs50m50m5050NOO5050BShamCShamOVXOVXADSCsADSCsmiR-664s-5p-ADSCsmiR-664a-5p-ADSCs601#12T#么#1.0工40-#0.8#0.6200.4-0.2-0.0Ruax2ALPOCNRunx2ALPOCNDShamOVXADSCSmiR-664a-5p-ADSCsShamOVXRunx2ADSCSmiR-664a-Sp-ADSCs1.0#ALP0.80.6OCN0.4GAPDH0.20.0Runx2ALPOCN注：A：免疫组化染色检测Runx2、A LP及OCN表达；B：免疫组化阳性细胞率；C:RT-qPCR法检测Runx2、A LP及OCNmRNA表达；D：W e s t e r n b l o t 检测Runx2、A LP及OCN表达；与Sham组相比，P0.05；与0 VX组比较，P0.05；与ADSCs组比较，P0.05。图4miR-664a-5p-ADSCs对OP大鼠成骨相关基因Runx2、A LP及OCN表达的影响Fig.4 Effect of miR-664a-5p-ADSCs on the expressions of osteogenic related genes Runx2,ALP,and OCNinOP ratsABShamShamOVXoVXADSCsADSCOVXADSCsmiR-664a-Sp-ADSCsmiR-664a-Sp-ADSCsmiR-66-ta-Sp-ADSCsSham1.2712#Wn1.0#1.0-#0.80.8-0.6#祥B-catenin0.6-0.40.40.2GAPDH0.2-Wmt0.0Runx2B-caieninB-caienin注：A：RT-q PCR法检测Wnt、-cateninmRNA表达；B：W e s t e r n b l o t 检测Wnt、-catenin表达；与Sham组相比，*P0.05；与0 VX组比较，P0.05；与ADSCs组比较，P0.05。图5miR-664a-5p-ADSCs对OP大鼠Wnt/-catenin信号通路的影响Fig.5Effect of miR-664a-5p-ADSCs on Wnt/-Catenin signaling pathway in OP rats平。说明过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。综上所述，过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。ADSCs在改善OP方面具有广泛的应用前景。1304ChinJOsteoreptember2023,Vol29,No.92023年9 月第2 9 卷第9 期中国骨质疏松杂志【参考文献】1Fischer V,Haffner-Luntzer M.Interaction between bone andimmune cells:Implications for postmenopausal osteoporosis J.Semin Cell DevBiol,2022,123:14-21.2孙文星，黄万新，刘传慧，等.黄芪多糖通过PI3K/AKT/mTOR促进激素性骨质疏松症大鼠成骨细胞增殖J.中国骨质疏松杂志，2 0 2 3，2 9（1）：35-40.3Park JS,Piao JY,Park G,et al.Osteoporotic conditionsinfluence the activity of adipose-derived stem cells J.TissueEng Regen Med,2020,17(6):875-885.4An Y,Zhao JF,Nie FF,et al.Parathyroid hormone(PTH)promotes ADSC osteogenesis by regulating SIK2 and Wnt4 J.Biochem Biophys Res Commun,2019,516(2):551-557.5Wang FL,Wang Q,Zhao Y,et al.Adipose-derived stem cellswith miR-150-5p inhibition laden in hydroxyapatite/tricalciumphosphate ceramic powders promote osteogenesis via regulatingNotch3 and activating FAK/ERK and RhoAr J.Acta 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