活力测定细胞复苏.pptx

一、实验目的：一、实验目的：1 1掌握测定细胞活力的方法。掌握测定细胞活力的方法。二、实验原理二、实验原理n培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。胞计数相同。n在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。要检查活力，了解冻存和复苏的效果。n用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。对数和相对活力。三、实验材料n仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂n1 1仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、分光光度计。吸管、分光光度计。n2 2材料：细胞悬液。材料：细胞悬液。n3 3试剂：试剂：0.40.4台盼兰，台盼兰，0.50.5四甲基偶氮四甲基偶氮唑盐（唑盐（MTTMTT）、酸化异丙醇）、酸化异丙醇n四、操作步骤四、操作步骤n1 1细胞计数细胞计数将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。使悬液充满盖片和计数板之间。静置静置3 3分钟。分钟。n计数计数 ：在低倍镜下计算计数板的四角大方格：在低倍镜下计算计数板的四角大方格（每个大方格又分（每个大方格又分1616个小方格）内的细胞数。数个小方格）内的细胞数。数出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。n细胞浓度计算：细胞浓度计算：四大格的细胞总数除以四大格的细胞总数除以4 4，得，得出平均每大格的细胞数，每大格的容积为出平均每大格的细胞数，每大格的容积为0.1mm0.1mm3 3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用下式计算：下式计算：n细胞浓度（细胞数细胞浓度（细胞数mlml）（四大格的细胞数）（四大格的细胞数4 4）1000010000稀释倍数稀释倍数n注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占应按单个细胞计算，若细胞团占10%10%以上，说明分以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液散不好，需重新制备细胞悬液2 2细胞活力测定细胞活力测定n台盼蓝活力测定机理：台盼蓝活力测定机理：n正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡胞已经死亡。n将一定浓度的细胞悬液与将一定浓度的细胞悬液与0.4%0.4%台盼兰以台盼兰以9:19:1混合。混合。n染色染色2 2一一3 3分钟。分钟。n吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。n镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。计细胞活力。n死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。3 3MTTMTT法测细胞相对数和相对活力法测细胞相对数和相对活力n活细胞中的脱氢酶能将活细胞中的脱氢酶能将MTTMTT还原成不溶于水的蓝紫还原成不溶于水的蓝紫色产物（甲臜，色产物（甲臜，Formazan)Formazan)，并沉淀在细胞中，其，并沉淀在细胞中，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。而死量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。而死细胞没有这种功能。细胞没有这种功能。n酸化异丙醇能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，酸化异丙醇能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的溶液颜色深浅与所含的FormazanFormazan量成正比，最后量成正比，最后用酶标仪测定用酶标仪测定ODOD值。值。n细胞悬液以细胞悬液以1000rpm1000rpm离心离心1010分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。n沉淀加入沉淀加入0.50.51ml MTT1ml MTT，吹打成悬液。，吹打成悬液。n3737下保温下保温2 2小时。小时。n加入加入4-5 ml4-5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。酸化异丙醇（定容）。打匀。n1000 rpm1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm570nm比色，酸化异丙醇调零点。比色，酸化异丙醇调零点。n注意：注意：MTTMTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。能测定细胞绝对数。细胞的冻存和复苏细胞的冻存和复苏 一、实验目的n掌握细胞冻存的方法。掌握细胞冻存的方法。二、实验原理n在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白变性等，引起细胞死亡。变性等，引起细胞死亡。n如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢缓慢的冻结的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。胞。n细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的损的5 500，细胞仍能生长，活力受损不大。，细胞仍能生长，活力受损不大。n目前常用的保护剂为二甲亚砜（目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSODMSO）和甘油，）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。透细胞。影响冷冻效果的因素n1 1、冷冻速率、冷冻速率n细胞冷至细胞冷至-10-15-10-15之间时，细胞外溶液先之间时，细胞外溶液先出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动。动。n冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高、细胞不发生结冰。溶质浓度增高、细胞不发生结冰。n冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗，冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗，会发生结冰。会发生结冰。n2、冷冻保存温度、冷冻保存温度 液氮（液氮（-196-196）是最佳保存温度。）是最佳保存温度。n3、复温速度、复温速度 越快越好，越快越好，37 水浴中，水浴中，1-2min1-2min完成复温。完成复温。n4、冷冻保护剂、冷冻保护剂 保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚甲亚砜（砜（DMSODMSO）和甘油。）和甘油。三、实验材料n1 1仪器：仪器：44冰箱，冰箱，-70-70冰箱，液氮罐，离心机，冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等水浴锅，微量加样器等n2 2材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管等。、离心管、吸管等。n3 3试剂：试剂：0.250.25胰酶、培养基、含保护剂的培养胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。基（即冻存液）等。n四、操作步骤四、操作步骤n1 1冻存冻存 胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。1000rpm1000rpm离心离心5 5分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。沉淀加含保护液的培养基（培养基：沉淀加含保护液的培养基（培养基：DMSO=1:1DMSO=1:1），计数，调整至），计数，调整至5105106 6/ml/ml左右。左右。将悬液分至冻存管中，每管将悬液分至冻存管中，每管1 ml1 ml。n将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。n贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。外拴一金属重物和一细绳。n按下列顺序降温：室温按下列顺序降温：室温44（2020分钟分钟冰箱冰箱冷冻室（冷冻室（-20 -20 ）（）（1 1小时）小时）气态氮（过夜）气态氮（过夜）液氮。液氮。n注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般3030立立升的液氮能用升的液氮能用1 11.51.5月。月。n2 2复苏复苏n从液氮中取出冻存管、迅速置于从液氮中取出冻存管、迅速置于3737温水中并温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在不断搅动。使冻存管中的冻存物在1 1分钟之内融化。分钟之内融化。n打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。n1000rpm1000rpm离心离心1010分钟，弃去上清液。分钟，弃去上清液。n沉淀加沉淀加10ml10ml培养液，吹打均匀，再离心培养液，吹打均匀，再离心1010分钟，分钟，弃上清液。弃上清液。n加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，3737培养，第二天观察生长情况。培养，第二天观察生长情况。n作业：作业：n1 1细胞冻存与复苏的基本原则是什么？细胞冻存与复苏的基本原则是什么？n2 2冻存液的作用是什么？冻存液的作用是什么？