干扰素α2b生产工艺研究及行业分析.doc

干扰素α2b生产工艺研究及行业分析

姓 名: 郭文文 樊恒达
学 号: 2008114020324
专 业: 生命科学学院生物技术
班 级: 0803班

湖北·黄石
2011年5月
16

干扰素α2b生产工艺研究及行业分析
1 前言
干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。
干扰素是一种细胞因子。它是机体感染病毒时, 宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构相似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素干扰病毒复制, 它是机体抗病毒感染的防御系统干扰素的种类很多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。[1]
目前所知道的人体干扰素按细胞结构和来源分α、β、γ干扰素三个型别, α干扰素又称人白细胞干扰素，它是由B淋巴细胞和单核细胞产生的,它可以分为23种亚型,分别称为干扰素α1、α2a、α2b、α3等，它们相互之间有较高的同源性。[2]人β-干扰素是人纤维母细胞产生的, 只有一个亚型。γ一干扰素又称免疫干扰素,它是由淋巴细胞的辅助诱导细胞产生的,与α、β干扰素之间没有明显的同源性。三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性。
干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2′-5′A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。
近年来在国际上抗病毒和抗癌症的研究领域中,更多地在开发自然的免疫调节和抗病毒物质,干扰素作为一种天然的人体抗病毒蛋白质受到人们的关注。干扰素将要成为21世纪抗病毒、抗癌症最为广泛的药物之一[3]。α干扰素是迄今为止治疗慢性乙肝的首选抗病毒药物, 一般肝炎治疗药物的显效率在20%-30%左右。干扰素代表了慢性肝炎药物发展的方向。它还是治疗丙肝的唯一有效抗病毒药物, 它又是临床上应用最广的治疗肿瘤的细胞因子。它的适应症主要有病毒性皮肤性病、慢性子宫颈炎、呼吸道病毒感染及妇科疾病、疙疹、造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤。β-干扰素用于复发的多发性硬化症，用于静脉注射使用。γ-干扰素主要治疗类风湿性关节炎。γ-干扰素在免疫调节功能方面较α、β-干扰素强1000倍, 不仅可以增强免疫功能, 还可以调整自身免疫性疾病免疫过渡到接近正常水平[3]。干扰素还应用于生殖道衣原体感染、浅表膀胱癌、尖锐湿疣、皮肤病、血液系统疾病、艾滋病相关综合征等的治疗。世界上已有许多国家批准生产使用重组干扰素制剂,用于治疗多种疾病。经过临床应用治疗表明,用干扰素治疗,一般无严重副反应.临床上正在不断开发新的适应症以扩大干扰素的使用[4]。
然而，传统的从动物中提取血源性干扰素由于来源有限及技术资金方面问题而无法大量合成。随着生物技术的发展,通过先进的基因工程技术,可以在人体外大规模生产干扰素。
所谓基因工程技术生产干扰素，是指从人细胞中克隆出干扰素基因, 将此基因与大肠杆菌表达载体连接物构成重组表达质粒, 然后转化到大肠杆菌中, 从而获得高效表达人干扰素蛋白的工程菌, 工程菌经发酵后可收集到大量菌体, 将菌体破裂, 用先进的生物工程手段将干扰素蛋白从菌体分离、纯化，得到高纯度的人基因工程干扰素。基因工程干扰素的出现, 是干扰素研究工作的一项重大突破它使得干扰素能进人大规模产业化生产,人们能获得大量活性高、疗效好的干扰素[1]。
基因工程干扰素具有无污染,安全性高,纯度高,比活性高,成本低,疗效确切等优点。如今临床应用的需求量越来越高，如何使基因工程干扰素大规模产业化生产成为了重要课题。想要推广干扰素的使用,必须建立高效生产干扰素的体系[4]。
重组人干扰素α1b是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物，也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。
分析近十年来干扰素的生产工艺及市场概况，对于未来干扰素的发展前景及市场走向具有重要意义。
2 干扰素的生产工艺
2.1 体外诱生干扰素制备工艺

采用仙台病毒诱导人白细胞，进行一定的分离纯化手段得到干扰素产品。由此生产工艺生产的干扰素IFNα-n3/Alferon1989批准上市，但其产量低，生产1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞。来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，存在潜在的血源性病毒污染的可能性。
2.2 人源转化细胞系培养生产工艺

该工艺首次实现干扰素的大规模商业化生产。1999年IFN α-n1/Wellferon批准用于临床。但由于其活性低，逐渐退出临床应用。
2.3 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺

此工艺运用发酵过程，通过先变性后复性的纯化手段大规模生产干扰素。 表达产物无糖基化，N-met，无活性包涵体。
重组人干扰素rhuIFN上市产品一览表
1986 rhuIFNα-2a rhuIFNα-2b
1990 rhuIFNγ-1b
1993 rhuIFNβ-1b
2001－2002 PEG化IFN PEG-Intron Pegasys

2.4 动物无限细胞系培养生产工艺

工艺采用分泌表达，产量低，成本高，过程严格。上市产品有rhuIFN β-1a。如Avonex(Biogen)（1996），Rebif(Serono)（2002）。表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku。
2.5 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
该工艺采用腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）作为宿主，发酵周期短，只有几个小时，无需变性、复性过程，获得有活性产品。其纯化过程淘汰抗体亲和层析。表达产物无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性，上市产品有IFN α-2b/安福隆。是目前较为成熟的生产工艺。下面介绍其工艺详细步骤：
2.5.1基因工程假单胞杆菌的构建
2.5.1.1干扰素基因的克隆(RT-PCR)
（1）制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR。
（2）基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。
（3）测序。测序结果如图所示。编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。

2.5.1.2 表达载体构建
（1） IFN基因与表达载体连接

（2）转化大肠杆菌
（3）筛选阳性克隆
（4）获得序列正确表达载体
2.5.1.3工程菌构建
（1）转化假单胞杆
（2）筛选高表达、稳定遗传的工程菌
（3）获得原始菌种
2.5.2 .干扰素α-2b的发酵工艺过程
工艺流程图如图所示

2.5.2.1摇瓶培养
（1）取保存工作种子批菌种，室温融化。
（2）摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h。
（3）检测：OD值和发酵液杂菌检查。
2.5.2.2 种子罐培养
（1）接种：接入50L种子罐，接种量10%。
（2）培养：30℃，pH7.0。
（3）控制：级联调节通气量和搅拌转速。DO为30%，3～4h，OD>4.0。
（4）检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
2.5.2.3 发酵罐培养
（1）接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。
（2）控制：级联调节通气量和搅拌转速。
（3）前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。
（4）4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。
（5）终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。
（6）检测：发酵液杂菌检查。
2.5.2.4 菌体收集
（1）连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。
（2）菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。
（3）检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
2.5.3 干扰素的分离纯化工艺过程
2.5.3.1 干扰素α-2b分离工艺过程
2.5.3.1.1菌体裂解
（1）裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）。
（2）使用保护剂：EDTA，PMSF。
（3）破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块
（4）搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr。
（5）冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
2.5.3.1.2 预处理-沉淀
（1）加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
（2）加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。
2.5.3.1.3 离心
（1）连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
（2）收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
（3）杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
2.5.3.1.4 初级分离
（1）盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。
（2）离心：连续流离心机，16000 r/min
（3）保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
2.5.3.2 干扰素纯化工艺过程
2.5.3.2.1 溶解粗干扰素
（1）配制纯化缓冲液：
超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。
（2）检查缓冲液的pH值和电导值。
（3）溶解。 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
2.5.3.2.2 沉淀与疏水层析
（1）等电点沉淀（一）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。
（2）疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中，除去非疏水性蛋白。
（3）洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。
（4）等电点沉淀（二）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜。
（5）超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。
（6）透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。
2.5.3.2.3 阴离子交换层析与浓缩
（1）0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。
（2）盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱，
（3）配合SDS-PAGE收集干扰素峰。
（4）浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。
2.5.3.2.4 阳离子交换层析与浓缩
（1）用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。
（2）上样，相同缓冲液冲洗。
（3）盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱
（4）配合SDS-PAGE收集干扰素峰。
（5）浓缩：10 ku超滤膜进行。
（6）凝胶过滤层析。
（7）洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂。
（8）上样，相同缓冲液进行洗脱。
（9）合并干扰素部分。

2.5.3.2.5 无菌过滤分装
（1）0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液。
（2）分装。
（3）－20℃以下的冰箱中保存。
2.5.3.2.6 检测项目
（1）干扰素鉴别试验。
（2）干扰素效价测定。
（3）蛋白质含量，纯度测定，分子量。
（4）宿主残余蛋白、残余DNA。
（5）干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列。
（6）其他：热原，内毒素，残留抗生素。
3 我国基因工程制药产业发展状况
我国基因工程制药产业起步于80年代末，虽然起步较晚，但发展速度很快。目前我国基因工程制药产业已进入快速发展时期。
1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素α1b，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。1998年我国基因工程制药产业销售额已达到了7.2亿元。 截止1998年底，我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种。近年来我国基因工程制药产业发展迅猛，年销售额已从1996年的2.2亿元增长到1998年的7.2亿元，年均增长率高达80％。预计2000年我国基因工程药物销售将达到22.8亿元。
我国生物技术产业，特别是生物制药产业规模与美国相比差距很大。基因工程药物上市时间较美国同品种上市时间晚5～10年。
然而，我国目前生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。主要表现在以下几个方面：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。后我国开始跟踪研制的。我国新药研究开发缺乏创新和低水平重复是导致医药产业重复生产的源头。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。成为基因工程制药产业发展的巨大障碍因素。
（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。这种恶性竞争非但未能使消费者受益，反而使得国家、制药企业和广大消费者的利益受到极大的损害。
（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。企业的所有权与经营权不分的状况，既不利于企业的长远发展，也不利于企业经营阶层即企业家阶层的形成。
为此，要制定产业发展战略规划，强化财政税收优惠政策，大力加强基因工程创新药物的研制和生产。为从根本上改变我国基因工程制药业重复生产和缺乏国际竞争力的局面，我国的新药研制开发思路必须做出战略调整，从以仿制为主向创新与仿制相结合转变。可以有选择地合法仿制一些专利即将过期、疗效明确、应用前景广阔的基因工程药物。对仿制药物有关的专利要进行认真的研究，采取有效的专利回避策略，避免简单的、盲目的仿制。要在仿制的基础上创新。创造出与专利方法不同的生产工艺和方法，以避免引起专利纠纷。[5]
4 干扰素制品国内市场的现状与发展分析
4.1 需求量及其增长分析
自1957年发现干扰素以来，40年来的研究使人们对干扰素的认识已有了根本改观，干扰素不仅是病毒间干扰现象的介质，而且是调节细胞功能的重要系统，现在已发展成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学以及肿瘤学有关的一个新兴的研究领域，随着生物工程技术的兴起，目前已广泛进入临床应用时代。
2006年-2009年我国干扰素需求量统计
单位：千克

数据来源：中国市场调查研究中心
4.2 需求地域结构分析
我国干扰素区域市场需求分析

数据来源：中国市场调查研究中心
4.3 产品结构分析
干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组α-干扰素和人自然干扰素两大类。从我国市场研发情况来看，目前重组α-干扰素占据的市场比重较大，约为67.4%。
我国干扰素产品结构分析

数据来源：中国市场调查研究中心
4.4 产量及其增长分析
干扰素是目前临床上应用非常广泛的药物，也是人类对抗病毒尤其是病毒性肝炎（包括乙型肝炎和丙型肝炎）的重要武器，致使我国干扰素市场将进入快速增长阶段。
从2006-2009我国干扰素市场产量统计图中可以看出，2009年产量比2006年增加了3.84千克，2009年涨幅达到了11.38%。
2006年-2009年我国干扰素产量统计
单位：千克

数据来源：中国市场调查研究中心
4.5 供需平衡分析
迄今为止，我国干扰素生产商已多达20多家。在2003年以后，我国干扰素产业开始进入稳定增长期。
我国干扰素市场远未达到西方发达国家那样的成熟程度，虽然从表面上看我国有几十家公司在生产干扰素，但我国所有公司生产的干扰素产品销售额加起来也不如美国安进生物公司一家的干扰素销售额大，可见我国干扰素市场之小，而且干扰素制剂尚未真正成为医院常用药物。
因此，近几年我国干扰素市场一直处于供不应求的局面
随着人们对干扰素研究的不断深入,尤其是现代分子生物学飞速发展,人们对干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理的不断阐明,使得人们在干扰素领域取得了空前的进步。特别是干扰素的聚乙二醇化(pegylated interferon) 和干扰素与载体脂质体(liposome2IFN) 的结合,很好的延长了干扰素在体内的代谢半衰期,增加了其稳定性,降低了其免疫原性,从而,扩大了干扰素的应用范围,同时也减少了刺激和毒副反应的发生[6]。在未来的生活中,价格低廉而疗效好的基因工程干扰素将会在临床上得到广泛的应用。

参考文献
[1]郑永霞、凌善峰,我国基因工程干扰素的研究概况,聊城大学学报自然科学版,2003 -3.
[2]楼士林、杨胜昌、龙敏男、章军等,基因工程,科学出版社,401页.
[3]侯云德,干扰素研究的意义,中华实验和临床病毒学杂志,2005年9月第19卷第3期.
[4]刘运龙、程远国、刘学龙,干扰素研究进展动物医学进展,2008 ,29 (2) :85289
[5]李德山,《基因工程制药》，，化学工业出版社，2010.2.1.
[6]戚楠、马清钧,长效重组蛋白药物的研究进展,中国生物工程杂志,2006 ,26 (2) :79282.
3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。
B比率分析法和比较分析法不能测算出各因素的影响程度。√
C采用约当产量比例法，分配原材料费用与分配加工费用所用的完工率都是一致的。Ｘ
C采用直接分配法分配辅助生产费用时，应考虑各辅助生产车间之间相互提供产品或劳务的情况。错
C产品的实际生产成本包括废品损失和停工损失。√
C成本报表是对外报告的会计报表。×
C成本分析的首要程序是发现问题、分析原因。×
C成本会计的对象是指成本核算。×
C成本计算的辅助方法一般应与基本方法结合使用而不单独使用。√
C成本计算方法中的最基本的方法是分步法。X
D当车间生产多种产品时，“废品损失”、“停工损失”的借方余额，月末均直接记入该产品的产品成本
中。×
D定额法是为了简化成本计算而采用的一种成本计算方法。×
F“废品损失”账户月末没有余额。√
F废品损失是指在生产过程中发现和入库后发现的不可修复废品的生产成本和可修复废品的修复费用。Ｘ
F分步法的一个重要特点是各步骤之间要进行成本结转。(√)
G各月末在产品数量变化不大的产品，可不计算月末在产品成本。错
G工资费用就是成本项目。(×)
G归集在基本生产车间的制造费用最后均应分配计入产品成本中。对
J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。(√)
J简化的分批法就是不计算在产品成本的分批法。(×)
J简化分批法是不分批计算在产品成本的方法。对
J加班加点工资既可能是直接计人费用，又可能是间接计人费用。√
J接生产工艺过程的特点，工业企业的生产可分为大量生产、成批生产和单件生产三种，X
K可修复废品是指技术上可以修复使用的废品。错
K可修复废品是指经过修理可以使用，而不管修复费用在经济上是否合算的废品。Ｘ
P品种法只适用于大量大批的单步骤生产的企业。×
Q企业的制造费用一定要通过“制造费用”科目核算。Ｘ
Q企业职工的医药费、医务部门、职工浴室等部门职工的工资，均应通过“应付工资”科目核算。Ｘ
S生产车间耗用的材料，全部计入“直接材料”成本项目。Ｘ
S适应生产特点和管理要求，采用适当的成本计算方法，是成本核算的基础工作。(×)
W完工产品费用等于月初在产品费用加本月生产费用减月末在产品费用。对
Y“预提费用”可能出现借方余额，其性质属于资产，实际上是待摊费用。对
Y引起资产和负债同时减少的支出是费用性支出。X
Y以应付票据去偿付购买材料的费用，是成本性支出。X
Y原材料分工序一次投入与原材料在每道工序陆续投入，其完工率的计算方法是完全一致的。Ｘ
Y运用连环替代法进行分析，即使随意改变各构成因素的替换顺序，各因素的影响结果加总后仍等于指标的总差异，因此更换各因索替换顺序，不会影响分析的结果。(×)
Z在产品品种规格繁多的情况下，应该采用分类法计算产品成本。对
Z直接生产费用就是直接计人费用。X
Z逐步结转分步法也称为计列半成品分步法。√

A按年度计划分配率分配制造费用，“制造费用”账户月末(可能有月末余额/可能有借方余额/可能有贷方余额/可能无月末余额)。
A按年度计划分配率分配制造费用的方法适用于(季节性生产企业)