牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺.ppt

中国医药生物技术学会质量控制专业委员会第三届动物血清生产与管理学术研讨会牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺Viral Safety Detection and Viral Removal/Inactivation of Bovine Serum 章金刚军事医学科学院输血医学研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室北京 1008502007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所在人用和动物用疫苗的制备过程中，牛血清是最为重要的细胞培养添加物。鉴于世界卫生组织（WHO）提倡疫苗生产的细胞基质从动物的使用转换为细胞培养，牛血清的应用会得到进一步的扩大。可以认为，如果没有充足牛血清的供应，许多医药产品的生产和供应均将受到极大的影响。牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性2007年09月军事医学科学院输血医学研究所WHO和各国管理当局、行业协会等高度关注医药产品生产使用细胞基质的安全问题，尤其是潜在病毒污染的问题。疫苗病毒安全性的可能污染途径：活疫苗种毒的污染，制备工艺中原、敷料的污染和其他需要考虑的问题。其中，牛血清的质量控制与病毒安全检测最受关注。牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所细菌性疾病：结核杆菌病、布鲁氏杆菌病、沙门氏菌病、炭疽病毒性疾病：口蹄疫、传染性海绵样脑病、白血病、蓝舌病.寄生虫性疾病：日本分体吸虫病、弓形体病牛的感染性疾病2007年09月军事医学科学院输血医学研究所消除牛源病原体技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛乳头状瘤病毒（bovine papillomaviruses,BPV）牛多型瘤病毒（bovine polyomaviruses,BPyV）腺病毒（Adenoviruses）疱疹病毒（Herpesviruses）牛痘病毒（Poxviruses）细小病毒（Parvovirus）等牛可以感染的病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒口蹄疫病毒（FMDV）牛病毒性腹泻病毒（BVDV）轮状病毒（Rotavirus）呼肠孤病毒（Reovirus）牛白血病病毒（BLV）牛免疫缺陷病病毒（BIV）蓝舌病病毒（BTV）牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）狂犬病病毒（RV）等倍受关注的朊病毒牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalpopathy,BSE)因子。牛可以感染的病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所值得关注的对象潜在性感染的病毒：（1）隐性感染而不引起任何疾病的病毒；（2）某些持续性感染的病毒；（3）处于潜伏状态的病毒。由于机体生理状态（如怀孕）、外界环境的变化，机体抵抗力下降等因素，这类病毒可能大量增殖或引起疾病的发生。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所关注的对象内源性病毒：内源性反转录病毒（ERV）是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。朊病毒：朊病毒是亚病毒中的重要感染因子，侵害动物与人类。因其主要由蛋白质构成，迄今尚无含有核酸的确切证据，故暂定名为朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。由于对各种朊病毒的本质的了解不够，采用“因子”命名，例如痒疫因子和牛海绵状脑病因子等，似乎较为恰当。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所重点关注两大类病毒应该考虑生物安全性的病毒集中在两个方面：人兽共患病病毒与致癌、免疫抑制或严重退行疾病有关的病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所三 牛源制品的病毒安全性脊椎动物病毒的形态DNA病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所脊椎动物病毒的形态RNA病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛乳头状瘤病毒牛乳头状瘤病毒（bovine papillomaviruses,BPV）分类地位：乳多空病毒科，乳头状瘤病毒属形态特征：无囊膜，55nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗A model of the papillomavirus capsid 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛乳头状瘤病毒根据交叉杂交试验，可以感染牛的乳瘤病毒分为6个主要亚群，每一种病毒在牛的皮肤产生特定的病变。某些亚群可以转化人细胞，这些病毒与牛的消化道、生殖道和眼部肿瘤等的发展有关。不能用细胞感染检测，可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛多型瘤病毒牛多型瘤病毒（bovine polyomaviruses,BPyV）分类地位：乳多空病毒科，多型瘤病毒属形态特征：无囊膜，45nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗PCR检测，BPyV在胎牛血清中的污染批次达70，可从某些批次的血清中分离到病毒。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛多型瘤病毒BPyV倍受关注，它可能是一种人兽共患病，饲养人员、兽医的体内有较高水平的抗体，而对大多数人群则缺乏抵抗力。可以感染灵长类细胞，包括人的细胞。影响细胞培养的结果。检测：能用细胞感染检测，在猴肾细胞可以产生特异性的病变，即胞浆、胞核空泡化。PCR检测，使用特异性的引物扩增、杂交或测序。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛腺病毒牛腺病毒（Adenoviruses）分类地位：腺病毒科，哺乳动物腺病毒属形态特征：无囊膜，90nm理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗分2个主要亚群，10个血清型。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛腺病毒尚不清楚是否人兽共患，但可以转化人细胞。能用细胞感染检测，1群感染牛胚肾细胞并迅速产生细胞病变，2群感染牛睾丸细胞，有时需要盲传。也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛疱疹病毒牛疱疹病毒（Herpesviruses）：有囊膜，150nm，有4个种。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛疱疹病毒BHV-1:引起牛鼻气管炎，牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。BHV-2:引起牛溃疡性乳头炎，奶制品的污染。BHV-3:引起牛恶性卡他热，具有异源宿主感染性。BHV-5:引起牛脑炎。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛痘病毒牛痘病毒（Poxviruses）：有囊膜，300nm，有2个种病毒必须考虑。假牛痘病毒牛丘疹性口炎病毒Orf virus2007年09月军事医学科学院输血医学研究所DNA病毒牛痘病毒假牛痘病毒:引起牛乳房和乳头增生性病变、挤奶工皮肤丘疹。牛丘疹性口炎病毒引起牛口腔粘膜、鼻镜、鼻孔上皮溃疡，人的手、臂丘疹。牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒（FMDV）：无囊膜，20nm，人兽共患，最重要。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛病毒性腹泻病毒牛腹泻病毒（BVDV）：有囊膜，70nm，牛群中普遍存在，倍受关注。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛轮状病毒牛轮状病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛的危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛呼肠孤病毒呼肠孤病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛的危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛反转录病毒与生物安全性相关的牛反转录病毒有两种牛白血病病毒（BLV）牛免疫缺陷病病毒（BIV）2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛白血病病毒牛白血病病毒（BLV）：有囊膜，100nm，牛群中普遍存在。未发现对人的感染性，可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所RNA病毒牛免疫缺陷病病毒牛免疫缺陷病病毒（BIV）：有囊膜，120nm，国内牛群阳性率2.32，对人和牛的危害不大。用蛋白印迹法检测，也可用PCR检测。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒朊病毒引起的人和动物的疾病多种动物和人的亚急性海绵样脑病与羊痒疫因子有关人的库鲁病(Kuru)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、阿耳茨海默病(Alzheimerdisease)、格-史氏综合征(Gerstmann-Strausslersyndrome)羊的痒疫(Scrapie)，水貂传染性脑病(Transmissibleminkencephalopathy)，黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病(Chronicwastingdiseaseofmuledeerandelk)，牛海绵状脑病(Bovinespongiformencephalpopathy)以及某些公园动物的相关感染症。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒 PrusinerPrusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagent1982:theplaqueproteinistheinfectiousagent(prionprion)Thenormal,Thenormal,non-infectiousProteinnon-infectiousProtein(PrPPrPC C)isencodedbythe)isencodedbythehostandismainlyexpressedonlymphocytesandneuronshostandismainlyexpressedonlymphocytesandneurons TheTheinfectiousinfectiousprionprionproteinprotein(PrPPrPScSc)hasthesameaminoacid)hasthesameaminoacidcomposition,butisresistanttoproteasesandtendstocomposition,butisresistanttoproteasesandtendstopolymerizepolymerize2007年09月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所veryveryslowslowrapidrapidrapidrapidPrPCPrPScPrPCPrPScSeedingmodel(nucleatedcrystallization)Refoldingmodel(templatedirected)朊病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所细胞培养抗体检测抗原检测核酸检测牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所细胞培养主要检测血清中是否存在可致敏感细胞病变的病毒，一般要求至少使用2种细胞，其中1种细胞为牛源细胞。牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所抗体检测主要检测血清中某些病毒的抗体，预示牛群曾经感染病毒或接种过疫苗，普遍要求BVDV抗体为必检项目牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所抗原检测主要检测血清中某些病毒蛋白的存在，预示血清来源的牛群近期感染或潜在感染了某种病毒，如BVDV、BTV、腺病毒、狂犬病病毒等，常用的方法是ELISA、免疫荧光技术等牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所核酸检测主要检测血清中某些病毒核酸的存在，预示血清来源的牛群近期感染或潜在感染了某种病毒，如BVDV、FMDV、BTV、细小病毒等，常用的方法是PCR、RT-PCR、荧光定量PCR等。牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所朊病毒的构象依赖性免疫测定构象依赖性免疫测定方法（conformation-dependent immunoassay,CDI）能检出微量的prion蛋白，5 h即可出结果。可检测出8株prion，其中包括分别导致绵羊痒病、鹿的慢性消耗性疾病和疯牛病的各株prion。可用于检测活动物。对西班牙、德国和英国的11000头屠宰牛检测结果完全与现在应用的方法相符，而且在实验室和田间试验中，还没有发现假阴性或假阳性结果。该方法的另一突出优点是自动化，因此可以用于大量动物的筛选。牛血清的病毒安全检测技术2007年09月军事医学科学院输血医学研究所Positive Control Dilution to End-PointPositive Control Dilution to End-Point朊病毒2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所血清的病毒清除/灭活工艺鉴于牛血清中病毒污染的危险性，在进行病毒直接检测的同时，对血清进行病毒清除与灭活很有必要。医药管理当局也强烈推荐对牛血清进行病毒灭活和验证。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所血清的病毒清除/灭活工艺生物技术产品病毒清除与灭活的技术方法巴斯德消毒法（巴氏消毒法）干热法（冻干制品）有机溶剂/去污剂（S/D）处理法膜过滤法低pH孵放法-射线法2007年09月军事医学科学院输血医学研究所血清的病毒清除/灭活工艺适于牛血清病毒清除与灭活的技术方法对于牛血清，病毒灭活多选用-射线法。选取原则均需验证病毒去除/灭活工艺的有效性，不影响血清的质量。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所常用的射线放射源有两种:60钴和137铯射线的产生 射线来自核的转变,由光子组成。在放射性衰变过程中所形成的子核处于激发和不稳定状态,当由高激发态跃迁回到低激发态时即释放出 射线。射线灭活病原体的种类与产生2007年09月军事医学科学院输血医学研究所射线灭活病原体的机理直接作用：指射线直接破坏病原体的核酸、蛋白质和酶等生命有关的物质。当病原体受到射线照射时，接受光子能量的电子由低能级壳层跃到高能级壳层，使原子呈激发状态，而当激发能高于分子电离电位时，则分子发生电离，破坏了共价键，从而破坏了病原体的分子结构。间接作用：指射线作用于病原体时，其中的水分子等辐解产生自由基，自由基再作用于生命物质而使病原体死亡。自由基攻击DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键,造成碱基与核糖氧化、链断裂、与蛋白质交联等多种类型的损伤。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所射线消毒杀菌的优缺点优点：不使物品升温；穿透力强；被照物品不会产生放射性，辐照后无残留毒性；方法简便；节省人力、节约能源。缺点：安全性（人的吸收剂量达12Gy即可引起轻度急性放射病，若靠近放射源，则数秒钟即可致死；30cm铅板、150cm混凝土或5cm深的水可以阻挡放射源对人的危害）；对物品的影响（可使血液溶血，有些药品如蛋白酶水溶液、胰岛素溶液等，照射后几乎90以上被破坏；可使普通玻璃变黄，也可使棉纤维解聚而降低其抗张强度；亦可使食物变色变味，有的蔬菜、水果香味丧失，某些营养成分丧失）。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所纤维蛋白原病毒灭活前后效果比较病毒灭活前的纤维蛋白原 病毒灭活后的纤维蛋白原2007年09月军事医学科学院输血医学研究所射线辐照在血浆病毒灭活中的应用马平,周锡鹏,张艳宇,等.60Co-射线对冻干血浆中病毒灭活效果的研究J.中国消毒学杂志,2005,22(4):424-426冻干血浆中病毒灭活效果60Co-射线辐照处理结果显示,60Co-射线灭活冻干血浆中病毒的效果随辐照剂量增加而增强。30kGy以上的辐照剂量能完全灭活血浆中滴度在5.5lgTCID50以上的各指示病毒。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作血液生物制品与病毒安全检测研究室：应用发展研究为主，应用基础研究为辅；以血液制品及病毒安全性为主线，适当拓展研究领域；积极寻求合作，发挥集成优势。下设课题组/方向：血浆蛋白的分离纯化工艺、特性鉴定、药理药效等重组蛋白的研究：原核、酵母、哺乳细胞、转基因动物等抗体制备与应用：单抗、基因重组单抗等配套研究病毒安全检测：国家生物医学分析中心分支血型抗原的相关研究2007年09月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作病毒安全检测实验室挂靠在国家生物医学分析中心。主要工作包括以下几个方面：病毒灭活工艺与检测技术：血浆衍生物、生化制品、相关原材料等异种移植的病毒安全性研究：国家项目为主抗病毒药物的筛选：自选与合作项目为主单克隆抗体的制备与应用：自选与合作项目为主2007年09月军事医学科学院输血医学研究所病毒安全检测的有关工作生物活性材料的病毒安全性检测：牛血清、血浆衍生物、生化制品、相关原材料等符合规范的二级上午安全实验室2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作细胞基质与指示病毒细胞基质体系完善：拥有30种以上动物的传代细胞系；自行制备的牛、人原代与继代细胞指示病毒体系完善：DNA病毒与RNA病毒；有囊膜病毒与无囊膜病毒完全可以满足牛血清病毒安全检测与病毒清除/灭活工艺研究与验证的要求。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BVDV方面抗体检测：目前直接使用IDEXX的ELISA试剂盒，正在组建全病毒抗原和基因重组抗原的ELISA试剂盒。1 阳性对照平均值22 阴性对照平均值2-21 样品1-20 s/p值按试剂盒要求，阴性平均值应小于0.20，本次测定阴性平均值小于0.05，测定结果有效。样品S/P值大于0.5判为阳性，本次实验20份原料血样品的抗体检测S/P值均小于此值，故全部判为阴性。原料血浆BVDV抗体检测结果 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BVDV方面核酸检测：自行建立了RT-PCR检测技术。抗原检测：正在制备BVDV的单克隆抗体和表达了相关基因2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BTV方面抗体检测：自行建立了c-ELISA试剂盒。抗原检测：正在进行中，主要是标记的荧光抗体。纯化纯化VP7VP7蛋白和蛋白和3E2-HRP3E2-HRP单抗的竞争单抗的竞争ELISAELISA反应特异性柱状图反应特异性柱状图 与VMRD公司c-ELISA试剂盒比较样品1:2和1:4倍稀释时，组装试剂盒检测与美国c-ELISA试剂盒符合率为100%；样品1:8倍稀释，BTV-18和BTV-22组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性；1:16倍稀释时，BTV-6组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性，其余相同；1:32和1:64倍稀释时；BTV-19组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性；1:64倍稀释时，两试剂盒检测结果一致。2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BTV方面核酸检测：自行建立了通用RT-PCR和Q-PCR试剂盒，正在报批中。M：DL2000；A：50l BTV5+150l小牛血清；B：100l BTV5+100l小牛血清C：150l BTV5+50l小牛血清；D：200l BTV5 BTV的RT-PCR检测2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BTV方面核酸检测：自行建立了通用RT-PCR和Q-PCR试剂盒，正在报批中。BTV1、3、5、8、10、11、21、22 RT-QPCR扩增曲线 BTV RT-QPCR检测方法特异性试验(a)P121灵敏性试验扩增曲线(b)P121扩增的标准曲线 检测BTV1的灵敏性试验 AE：51 CCID50 BTV1 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作P121重复性试验扩增曲线 模拟血清样品的荧光PCR检测 BTV1的重复性检测扩增曲线 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BLV方面抗体检测：目前直接使用IDEXX的ELISA试剂盒，正在组建全病毒抗原和基因重组抗原的ELISA试剂盒。BLV抗体检测结果 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清病毒安全检测的相关工作BLV方面核酸检测：自行建立了Nest-PCR扩增技术。样品及BTV5阳性对照品cDNA扩增后结果 Nest-PCR扩增后结果 2007年09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性牛的病原与病毒安全性关注的重点欧盟对牛血清病毒检测的要求病毒分类与牛的某些病毒牛血清的病毒安全检测技术血清的病毒清除/灭活工艺病毒安全实验室的部分研究工作2007年09月军事医学科学院输血医学研究所2007年09月军事医学科学院输血医学研究所