检验科微生物室.ppt

临床微生物质量控制内 容二、临床微生物的质量控制二、临床微生物的质量控制二、临床微生物的质量控制二、临床微生物的质量控制三、实验前质量控制三、实验前质量控制三、实验前质量控制三、实验前质量控制四、实验中质量控制四、实验中质量控制四、实验中质量控制四、实验中质量控制五、实验后质量控制五、实验后质量控制五、实验后质量控制五、实验后质量控制六、工作中常见的问题和解决方法六、工作中常见的问题和解决方法六、工作中常见的问题和解决方法六、工作中常见的问题和解决方法七、目标七、目标七、目标七、目标一、临床微生物实验室的重要性一、临床微生物实验室的重要性一、临床微生物实验室的重要性一、临床微生物实验室的重要性一、临床微生物实验室的重要性l人类面临着微生物的挑战，要打赢这场战争不仅需要有经验的医生，还需要一支优秀的临床微生物检验队伍。l与过去的10年或20年相比，临床微生物实验室的规模和发展速度已经发生了巨大的变化。目前，我们离CLSI(临床实验室标准化协会)标准化文件要求还相差很远，我们应进行规范操作，才可能应对微生物向人类的挑战，才能适应临床的需要。l临床微生物检验，在感染性疾病及相关病患的诊断治疗预防及研究工作中起着越来越重要的作用，为了保障检验结果的准确性和可靠性，日常工作中要注意开展质量控制。临床微生物检验的目的和意义临床微生物检验的目的和意义l提供感染性疾病诊断的病原学依据l为医院感染流行病学调查提供依据l为感染性疾病治疗提供用药依据l细菌耐药性监测需要l为合理使用抗菌药物提供依据l为生物安全、医院感染管理和监控预防提供科学依据为了保证检验结果准确无误，应对室间质评和室内质控实行全面质量管理。临床微生物检验临床微生物检验是对人体的各种物质进行微生物学检验，整个检验过程包括病人样品的采集、运送、处理，样品中致病微生物的分离、培养、鉴定，药物敏感试验，出具检验报告。其质量控制环节多、涉及的知识面广、复杂性高、需要超强的责任心。二、临床微生物的质量控制 临床微生物检验质量控制的有关概念临床微生物检验质量控制的有关概念为了保证质量控制，首先应了解以下有关概念：为了保证质量控制，首先应了解以下有关概念：为了保证质量控制，首先应了解以下有关概念：为了保证质量控制，首先应了解以下有关概念：1.1.1.1.细菌检验的质量：细菌检验的质量：细菌检验的质量：细菌检验的质量：结果真实显示标本中存在的病原菌及其生化特征和抗药性结果真实显示标本中存在的病原菌及其生化特征和抗药性2.2.2.2.细细细细菌菌菌菌检检检检验验验验的的的的质质质质量量量量控控控控制制制制：制制定定细细菌菌检检验验的的质质量量水水平平，并并采采取取监监测测手手段段，这这一一过过程程称为细菌检验的质量控制。称为细菌检验的质量控制。3.3.3.3.质量保证：质量保证：质量保证：质量保证：为达到应有的质量水平而采取的措施。为达到应有的质量水平而采取的措施。4.4.4.4.质质质质量量量量评评评评价价价价：用用一一个个客客观观的的公公认认的的标标准准来来评评定定一一个个实实验验室室或或实实验验室室中中某某项项试试验验是是否达到标准的过程。否达到标准的过程。5.5.5.5.室室室室间间间间质质质质量量量量控控控控制制制制：是是各各地地实实验验室室之之间间进进行行质质量量控控制制的的一一种种方方式式，也也是是上上一一级级实实验验室室对对各各实实验验室室进进行行质质量量管管理理的的手手段段。参参加加由由省省临临床床检检验验中中心心或或卫卫生生部部临临床床检检验验中中心心组组织织的的室室间间质质控控，会会遇遇见见一一些些平平时时罕罕见见或或未未见见过过的的菌菌株株，通通过过质质控控检检验验对对它它们们的的生生长长条条件件、菌菌落落形形态态、染染色色、镜镜下下形形态态等等有有了了较较深深的的感感性性认认识识。日后工作中倘若再遇见这些菌将不再会漏检。日后工作中倘若再遇见这些菌将不再会漏检。6.6.6.6.室室室室内内内内质质质质量量量量控控控控制制制制：做做好好室室内内质质控控直直接接关关系系到到日日常常检检验验工工作作的的质质量量。室室内内质质控控主主要要包包括括几几个个方方面面：实实验验室室前前的的质质量量控控制制、标标本本接接种种前前的的质质量量控控制制、培培养养基基的的质质量量控控制制、试试剂剂质质量量控控制制、常常用用仪仪器器的的质质量量控控制制、药药敏敏实实验验的的质质量量控控制制、及及发报告前的质量控制。发报告前的质量控制。分析后质量控制范畴质量控制范畴分析前分析中质量保持持续改进 临床微生物质量控制的依据标准临床微生物质量控制的依据标准临床微生物质量控制的依据标准临床微生物质量控制的依据标准卫卫生生部部医医政政司司颁颁布布的的全全国国临临床床检检验验操操作作规规程程，美美国国临临床床实实验验标标准准化化协协会会（CLSICLSI）定期颁布的最新的质量控制和评议方案。）定期颁布的最新的质量控制和评议方案。检检验验方方法法学学、操操作作手手册册应应不不断断更更新新，开开展展循循诊诊医医学学，不不断断淘淘汰汰无无价价值值的的试试验验，增加新的有临床价值的试验。增加新的有临床价值的试验。微生物实验室程序微生物实验室程序微生物实验室程序微生物实验室程序uu临床微生物制度临床微生物制度 生物安全防护制度生物安全防护制度 三级报告制度：三级报告制度：涂片；涂片；初步药敏和确切涂片；初步药敏和确切涂片；正式鉴定和药敏正式鉴定和药敏 传染病原报告制度传染病原报告制度 菌毒株保存制度菌毒株保存制度 废弃物处理制度废弃物处理制度 质量控制制度质量控制制度uu制定程序性文件（可参考制定程序性文件（可参考ISO 15189ISO 15189认可准则中应用说明要求）认可准则中应用说明要求）uuSOPSOP操作手册操作手册uu仪器的性能验证等仪器的性能验证等为了保证质量控制，我们需注意：为了保证质量控制，我们需注意：为了保证质量控制，我们需注意：为了保证质量控制，我们需注意：1.1.标本的质量（数量、体积、可接受的合格标本、运送方式等）标本的质量（数量、体积、可接受的合格标本、运送方式等）2.2.试验方法的有效性（根据临床症状、诊断和其他临床资料，采用适当检测方法）试验方法的有效性（根据临床症状、诊断和其他临床资料，采用适当检测方法）3.3.试验的操作方法和步骤、试剂、培养基、仪器、环境、人员等。试验的操作方法和步骤、试剂、培养基、仪器、环境、人员等。4.4.有临床意义的结果报告（报告的及时、准确、完整）有临床意义的结果报告（报告的及时、准确、完整）临床微生物临床微生物实验室的基实验室的基本装备本装备孵育箱、CO2培养箱、高压灭菌器生物安全柜试剂、染液、质控菌株、培养基冰箱、酒精灯、接种环、游标卡尺、温度计等光学显微镜uu室内质控室内质控室内质控室内质控 室内质控内容包括对各种实验条件及实验过程进行监督室内质控内容包括对各种实验条件及实验过程进行监督 监督的对象有仪器设备、培养基、鉴定系统等操作全过程监督的对象有仪器设备、培养基、鉴定系统等操作全过程uu室间质评室间质评室间质评室间质评临床微生物室需建立室内质控 11234常规试验室内质控培养基质控药敏试验的质控自动化设备质控：鉴定和药敏、血培养系统ATCC：美国典型菌株保存中心：美国典型菌株保存中心-主要来主要来源源NCTC：英国国家典型菌株保存中：英国国家典型菌株保存中实验中用标准方法鉴定，鉴定值实验中用标准方法鉴定，鉴定值95典型菌株，并经多次传代，典型菌株，并经多次传代，特征衡定的菌株特征衡定的菌株质控质控菌株菌株 参考参考菌株菌株临床分临床分离菌离菌质控必备菌株质控必备菌株 细菌名称细菌名称 菌号菌号 用途用途 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 ATCC 25923 纸片扩散质控纸片扩散质控 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 MICATCC 29213 MIC测定质控测定质控 大肠杆菌大肠杆菌 ATCC 25922 ATCC 25922 纸片和纸片和MICMIC 绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌 ATCC 27853 ATCC 27853 纸片和纸片和MICMIC 粪肠球菌粪肠球菌 ATCC 29212 ATCC 29212 胸腺嘧啶含量测定胸腺嘧啶含量测定 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌 ATCC 49226 ATCC 49226 淋球菌药敏淋球菌药敏 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 ATCC 49247 ATCC 49247 嗜血杆菌药敏嗜血杆菌药敏 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 ESBLATCC 700603 ESBL阳性菌阳性菌低温速冻低温速冻 苛养细菌苛养细菌冷冻干燥冷冻干燥 长期保留菌株长期保留菌株参考菌株参考菌株保存方法保存方法高层琼脂高层琼脂 非苛养菌非苛养菌琼脂斜面琼脂斜面 现用菌株现用菌株参考菌株保存方法参考菌株保存方法室间质评室间质评室间质评室间质评样本的检测操作程序样本的检测操作程序样本的检测操作程序样本的检测操作程序1.1.测试环境、仪器、试剂的要求测试环境、仪器、试剂的要求室温：室温：20202525湿度：湿度：80%1010个上皮细胞个上皮细胞/LP/LP、255WBC5个个/HP/HP，未未经经抗抗菌菌药药物物治治疗疗的的持持续续性性腹腹泻泻患者粪便患者粪便伤伤口口标标本本：如如出出现现上上皮皮细细胞胞，提提示示标标本本已已受受皮皮肤肤菌菌群群的的污污染染，高高倍倍视视野野中中超超过过5 5个鳞状上皮细胞的伤口标本不适合做厌氧培养个鳞状上皮细胞的伤口标本不适合做厌氧培养血液细菌培养血液细菌培养血液细菌培养血液细菌培养 临临床床上上疑疑为为败败血血症症、脓脓毒毒血血症症或或其其他他血血流流感感染染的的患患者者，需需做做血血液液细细菌菌培培养养以以明明确确病病原原。及及时时、准准确确地地从从患患者者血血液液中中分分离离出出病病原原菌菌，才才能能正正确确实实施施有有效效地地抗抗菌菌治治疗疗，从而有助于提高治愈率和降低医疗费用。从而有助于提高治愈率和降低医疗费用。1.1.1.1.采血时机采血时机采血时机采血时机应在用抗菌素治疗前应在用抗菌素治疗前,最好在患者发冷发热前半小时采血为宜。最好在患者发冷发热前半小时采血为宜。2.2.2.2.采血次数与间隔采血次数与间隔采血次数与间隔采血次数与间隔uu急性感染患者：急性感染患者：急性感染患者：急性感染患者：从两臂分别采从两臂分别采2 2份血样（两套）。份血样（两套）。uu感染性心内膜炎患者：感染性心内膜炎患者：感染性心内膜炎患者：感染性心内膜炎患者：24h24h内采血内采血3 3次次,每次间隔不少于每次间隔不少于3030分钟。分钟。uu发热原因不明患者：发热原因不明患者：发热原因不明患者：发热原因不明患者：242448h48h后可再采血后可再采血2 2次次,间隔不少于间隔不少于6060分钟。分钟。血液细菌培养血液细菌培养血液细菌培养血液细菌培养3.3.3.3.血培养采血方法、量、消毒与送检血培养采血方法、量、消毒与送检血培养采血方法、量、消毒与送检血培养采血方法、量、消毒与送检 采采血血方方法法：不不要要与与血血气气和和血血沉沉标标本本一一起起采采血血；不不推推荐荐血血入入瓶瓶前前换换针针头头；不不推推荐荐静静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。采血量采血量-最重要最重要 血液和瓶中液体的比例应为血液和瓶中液体的比例应为1:101:10，成人，成人8 810ml10ml、小儿、小儿2 25ml5ml；血量不足血量不足-先需氧瓶，剩余血接种厌氧瓶。先需氧瓶，剩余血接种厌氧瓶。为防止污染正确的皮肤消毒特别重要！按照规范执行。为防止污染正确的皮肤消毒特别重要！按照规范执行。亚急性感染性心内膜炎、人工瓣膜：主要病原菌是皮肤正常菌群，应自静脉，而亚急性感染性心内膜炎、人工瓣膜：主要病原菌是皮肤正常菌群，应自静脉，而不是留置导管内采血。不是留置导管内采血。标本立即送检，否则室温放置。标本立即送检，否则室温放置。呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养-痰痰痰痰采集方法采集方法采集方法采集方法 自自然然咳咳痰痰：必必须须用用清清水水漱漱口口3 3次次，应应包包括括咽咽喉喉部部，立立即即用用力力咳咳出出痰痰，于于灭灭菌菌容容器器中中或或输输送送培培养养基基中中；支支气气管管镜镜或或支支气气管管毛毛刷刷:由由医医生生采采集集，建建议议直直接接种种入入输输送送培培养基养基处处处处 理理理理 痰痰首首先先用用灭灭菌菌生生理理盐盐水水将将痰痰液液洗洗3 3次次，然然后后将将痰痰块块打打碎碎，或或加加入入等等量量10g/L10g/L的的胰胰蛋白酶将痰块消化后再接种。蛋白酶将痰块消化后再接种。合格标本合格标本合格标本合格标本 外外观观为为脓脓痰痰、粘粘液液、血血，涂涂片片镜镜检检102525个个WBC/LP WBC/LP 为为合合格格标本。标本。呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养呼吸道标本细菌培养uu标本留取质量的好坏直接影响到对呼吸道病原学的诊断标本留取质量的好坏直接影响到对呼吸道病原学的诊断uu标本的采集要尽量减少上呼吸道正常菌群干扰标本的采集要尽量减少上呼吸道正常菌群干扰 uu应在用药前或停药应在用药前或停药1 1天后留取标本。天后留取标本。泌尿道标本细菌培养泌尿道标本细菌培养泌尿道标本细菌培养泌尿道标本细菌培养uu应在用药前或停药应在用药前或停药5 5天后留取标本天后留取标本,并使尿液在膀胱内停留并使尿液在膀胱内停留6 68h8h以上。以上。uu尽量避免或减少尿道口正常菌群干扰。尽量避免或减少尿道口正常菌群干扰。uu清清洁洁中中段段尿尿、导导尿尿导导管管尿尿、经经耻耻骨骨上上皮皮肤肤穿穿刺刺采采集集膀膀胱胱内内尿尿液液，送送检检标标本本以以晨晨起起第一次尿液为佳第一次尿液为佳uu尿量不宜太多，试管塞子与尿液不应直接接触尿量不宜太多，试管塞子与尿液不应直接接触 uu留取导尿管尿要排空导尿管内陈旧尿液，倘留置尿管超过三天应避免采用。留取导尿管尿要排空导尿管内陈旧尿液，倘留置尿管超过三天应避免采用。uu标本采集后立即送检，不能立即送检者，可暂存标本采集后立即送检，不能立即送检者，可暂存4 4冰箱，但保存不超过冰箱，但保存不超过8h8h粪便标本的培养粪便标本的培养粪便标本的培养粪便标本的培养uu应应在在发发病病早早期期并并且且尽尽量量在在用用抗抗生生素素治治疗疗前前采采集集，稀稀便便不不少少于于1ml1ml，固固体体便便不不少少于于1 1克克，无便患者可用直肠拭子采集标本。无便患者可用直肠拭子采集标本。uu要要挑挑取取含含脓脓、黏黏液液、血血等等病病理理改改变变或或水水样样粪粪便便送送检检。直直肠肠拭拭子子采采样样量量要要足足够够，拭拭子子上上肉眼应可见粪便。肉眼应可见粪便。uu注意事项：注意事项：虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。注意挑取脓血便或粘液便做培养注意挑取脓血便或粘液便做培养要进行分区划线。如图所示。要进行分区划线。如图所示。分泌物的培养分泌物的培养分泌物的培养分泌物的培养1 1.对对开开放放性性病病灶灶的的采采集集：如如眼眼结结膜膜脓脓性性分分泌泌物物、扁扁桃桃体体、外外耳耳道道、手手术术后后切切口口、导导管管治治疗疗感感染染、瘘瘘管管内内脓脓液液、生生殖殖道道分分泌泌物物等等均均属属于于开开放放性性病病灶灶。应应先先用用灭灭菌菌生生理理盐盐水水冲冲洗洗表表面面污污染染菌菌，去去除除旧旧的的分分泌泌物物，用用灭灭菌菌拭拭子子采采集集病病灶灶深深部部的的分分泌泌物物，也也可取感染部位下的组织送检。可取感染部位下的组织送检。2.2.闭闭锁锁性性脓脓肿肿：如如淋淋巴巴脓脓肿肿、肺肺脓脓肿肿、肝肝脓脓肿肿、腹腹腔腔脓脓肿肿、盆盆腔腔脓脓肿肿等等，对对封封闭闭的的脓脓肿肿常常采采用用穿穿刺刺或或引引流流的的的的方方法法采采样样，应应在在用用药药前前采采集集，应应注注意意脓脓液液的的气气味味、性性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。脓液标本脓液标本脓液标本脓液标本 要要尽尽量量避避免免病病灶灶表表面面细细菌菌污污染染。开开放放性性脓脓肿肿，采采样样前前无无菌菌盐盐水水冲冲洗洗伤伤口口，拭拭去去表表面面污污染染脓脓液液，挑挑取取病病灶灶深深部部脓脓液液；封封闭闭性性脓脓液液，严严格格病病灶灶皮皮肤肤或或黏黏膜膜表表面面的的消消毒毒后后用用无无菌菌干干燥燥注注射射器器穿穿刺刺抽抽取取，置置无无菌菌试试管管内内送送检检，或或切切开开排排脓脓时时用用无无菌菌拭拭子采集深部脓液。子采集深部脓液。厌氧菌和伤口标本厌氧菌和伤口标本厌氧菌和伤口标本厌氧菌和伤口标本 厌氧菌标本厌氧菌标本 隔绝空气隔绝空气-氧对厌氧菌有毒性作用氧对厌氧菌有毒性作用液状标本应用注射器抽取密封送检液状标本应用注射器抽取密封送检分泌物标本最好床边采集床边接种；另置厌氧环境送检（输送培养基）分泌物标本最好床边采集床边接种；另置厌氧环境送检（输送培养基）伤口标本伤口标本在伤口切开排脓时留取标本在伤口切开排脓时留取标本不能在伤口消毒清洗后留取标本不能在伤口消毒清洗后留取标本尽量采集伤口深部的脓汁送检尽量采集伤口深部的脓汁送检脑脊液标本脑脊液标本 直接涂片：革兰染色、抗酸染色、印度墨汁染色直接涂片：革兰染色、抗酸染色、印度墨汁染色 无菌采集技术：避免标本污染及患者被感染无菌采集技术：避免标本污染及患者被感染 病毒培养标本：置病毒培养标本：置4 4 保存保存 分枝杆菌培养标本：分枝杆菌培养标本：2mL2mL以上，置以上，置4 4 保存保存 细菌培养标本置细菌培养标本置35 35 保存保存种类和环节多（细菌鉴定、药敏、培养基、生化管、仪器、稀释液）种类和环节多（细菌鉴定、药敏、培养基、生化管、仪器、稀释液）涉及知识面广涉及知识面广复杂性高复杂性高需要强烈的责任感需要强烈的责任感四、微生物试验分析中质量控制常规试验的质量控制常规试验的质量控制常规试验的质量控制常规试验的质量控制-天天做（质控菌株）天天做（质控菌株）天天做（质控菌株）天天做（质控菌株）触酶试验：触酶试验：3 3H H2 2O O2 2每三天更换一次每三天更换一次 血浆凝固酶试验：人血浆或商品乳胶试剂血浆凝固酶试验：人血浆或商品乳胶试剂 氧化酶试验：氧化酶试验：1 1盐酸四甲基对苯胺水溶液浸泡厚滤纸，室温吹干压成小纸片，盐酸四甲基对苯胺水溶液浸泡厚滤纸，室温吹干压成小纸片，置含干燥剂容器置含干燥剂容器2020保存，或买商品制剂保存，或买商品制剂 内酰胺酶：头孢硝噻吩内酰胺酶：头孢硝噻吩(Nitrocefin)(Nitrocefin)为底物，适于测试嗜血杆菌、淋球为底物，适于测试嗜血杆菌、淋球菌、卡他莫拉菌、肠球菌菌、卡他莫拉菌、肠球菌 革兰染色：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色；另涂片厚度、染色革兰染色：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色；另涂片厚度、染色和脱色时间、染料沉渣等也影响染色质量和脱色时间、染料沉渣等也影响染色质量培养基的质量控制培养基的质量控制培养基的质量控制培养基的质量控制uu一般性状：一般性状：一般性状：一般性状：外观：外观：外观：外观：透明、清亮、无混浊、无沉淀，颜色符合要求，表面湿润但无透明、清亮、无混浊、无沉淀，颜色符合要求，表面湿润但无水汽、平整、光洁无凹坑和气泡。整块平板厚薄均匀。水汽、平整、光洁无凹坑和气泡。整块平板厚薄均匀。厚度厚度厚度厚度：一般厚度在一般厚度在3mm3mm，但但MHMH平板厚度平板厚度4mm4mm。斜面的长度。斜面的长度试管长度的试管长度的2/32/3。pHpHpHpH是细菌生长的重要条件之是细菌生长的重要条件之一，合格培养基的一，合格培养基的pHpH应在规定值上下应在规定值上下0.20.2的范围内。的范围内。uu无菌试验：无菌试验：无菌试验：无菌试验：新制备或新买的培养基在使用前要随机抽取一定数量的样品作无菌试验。新制备或新买的培养基在使用前要随机抽取一定数量的样品作无菌试验。购买的培养基要有质量保证如合格证明等文件；若无质量保证需检测相应的性能。购买的培养基要有质量保证如合格证明等文件；若无质量保证需检测相应的性能。培养基的质量控制培养基的质量控制培养基的质量控制培养基的质量控制uu细菌生长试验：细菌生长试验：细菌生长试验：细菌生长试验：所有的培养基在使用前还必须做细菌生长试验以测定培养基性能所有的培养基在使用前还必须做细菌生长试验以测定培养基性能是否符合要求。标准菌株分是否符合要求。标准菌株分2 2种：一种是已知的可在某种培养基上生长并产生典种：一种是已知的可在某种培养基上生长并产生典型生物学性状的，对培养基中的某种物质产生阳性反应的菌株；另一种是用已知型生物学性状的，对培养基中的某种物质产生阳性反应的菌株；另一种是用已知的不能在某种培养基上生长或对培养基中的某种物质产生阴性生化反应的菌株。的不能在某种培养基上生长或对培养基中的某种物质产生阴性生化反应的菌株。如血琼脂平板：乙型溶血性链球菌生长，如血琼脂平板：乙型溶血性链球菌生长，溶血；甲型链球菌，溶血；甲型链球菌，a a溶血；巧克力溶血；巧克力琼脂平板：流感嗜血杆菌生长良好；中国蓝琼脂平板和琼脂平板：流感嗜血杆菌生长良好；中国蓝琼脂平板和SSSS琼脂平板：革兰阴性菌琼脂平板：革兰阴性菌生长，革兰阳性菌不生长。生长，革兰阳性菌不生长。试剂质控试剂质控试剂质控试剂质控 临床微生物实验室常用的试剂包括染色液、诊断血清以及各种生化反应试剂等。临床微生物实验室常用的试剂包括染色液、诊断血清以及各种生化反应试剂等。染染染染色色色色液液液液及及及及染染染染色色色色方方方方法法法法质质质质量量量量控控控控制制制制：购购买买的的或或配配置置的的染染色色液液，每每次次需需做做好好相相关关的的记记录录，如如操操作作者者和和开开瓶瓶日日期期等等；还还要要进进行行染染色色步步骤骤质质控控，如如革革兰兰染染色色在在一一张张玻玻片片上上同同时时涂涂有有金葡菌和大肠杆菌，以保证染色性判断准确无误。金葡菌和大肠杆菌，以保证染色性判断准确无误。常常常常用用用用生生生生化化化化试试试试剂剂剂剂的的的的质质质质控控控控：随随着着细细菌菌鉴鉴定定仪仪和和快快速速微微量量生生化化鉴鉴定定板板条条的的普普及及，临临床床微微生生物物检检验验常常用用的的生生化化试试剂剂种种类类日日趋趋减减少少，应应注注意意在在用用试试剂剂在在贮贮存存时时的的避避光光、冷冷藏藏等等要要求，保证试剂的稳定性。不要使用过期的试剂。求，保证试剂的稳定性。不要使用过期的试剂。诊诊诊诊断断断断血血血血清清清清的的的的质质质质控控控控：诊诊断断血血清清是是一一种种重重要要的的细细菌菌鉴鉴定定试试剂剂，应应从从有有资资质质的的生生产产单单位位购购买买。验验收收时时必必须须看看清清生生产产批批号号、血血清清效效价价、透透明明度度与与色色泽泽。试试验验中中应应注注意意无无菌菌操操作作，避避免免细细菌菌污污染染。要要经经常常检检查查贮贮存存在在44冰冰箱箱中中的的各各种种血血清清，若若发发现现混混浊浊，出出现现絮絮状状，应应停停止止使使用用。为为保保证证血血清清凝凝集集反反应应结结果果准准确确，应应每每3 3个个月月对对血血清清进进行行一一次次质质控控。不不要使用过期的血清。要使用过期的血清。纸片药敏试验的室内质控纸片药敏试验的室内质控纸片药敏试验的室内质控纸片药敏试验的室内质控 基础质控：连续做基础质控：连续做3030天，如失控超过天，如失控超过3 3次还需继续，如失控低于次还需继续，如失控低于3 3次可改为每周次可改为每周1 1次次 纠控：每周质控中发生失控应纠控，方法：连续纠控：每周质控中发生失控应纠控，方法：连续5 5天，每天天，每天1 1次，每次重复次，每次重复5 5个纸个纸片，如找到明确失控原因，可立即改为每周片，如找到明确失控原因，可立即改为每周1 1次，否者继续次，否者继续 44冰箱保存一周的用量冰箱保存一周的用量 药物敏感试验是临床微生物检验的重要步骤之一，其结果正确与否涉及治疗效果药物敏感试验是临床微生物检验的重要步骤之一，其结果正确与否涉及治疗效果的好坏。的好坏。仪器的质量控制仪器的质量控制仪器的质量控制仪器的质量控制 按仪器说明规定用标准菌株定期对不同批号的试剂进行质控按仪器说明规定用标准菌株定期对不同批号的试剂进行质控 对冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本设备的每日温度、气体浓对冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本设备的每日温度、气体浓度的监控记录；显微镜、细菌鉴定仪等仪器的使用、保养、维修记录。以保度的监控记录；显微镜、细菌鉴定仪等仪器的使用、保养、维修记录。以保障实验室各种设备、仪器的正常运转。障实验室各种设备、仪器的正常运转。对仪器进行性能验证，若有两台以上的仪器则要进行仪器比对对仪器进行性能验证，若有两台以上的仪器则要进行仪器比对细菌鉴定的基本步骤细菌鉴定的基本步骤细菌鉴定的基本步骤细菌鉴定的基本步骤1.1.标本的分离培养（这关系到整个结果的可靠性）标本的分离培养（这关系到整个结果的可靠性）2.2.培养结果的观察（致病菌的选择）培养结果的观察（致病菌的选择）3.3.细菌的分纯、鉴定（天地人鉴定系统、细菌的分纯、鉴定（天地人鉴定系统、ATBATB半自动微生物鉴定、半自动微生物鉴定、VITEKVITEK系统、系统、MicroScanMicroScan自动微生物分析系统、自动微生物分析系统、Sensititre Sensititre 全自动微生物鉴定系统）全自动微生物鉴定系统）常用的培养基种类和用途常用的培养基种类和用途常用的培养基种类和用途常用的培养基种类和用途 血平板血平板普通细菌用普通细菌用 巧克力平板巧克力平板含含V V、X X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用 中国蓝中国蓝/麦康凯平板麦康凯平板G-G-杆菌用杆菌用 SSSS平板平板沙门氏菌和志贺氏菌用沙门氏菌和志贺氏菌用 M-HM-H平板平板细菌药敏用细菌药敏用 TCBSTCBS平板平板弧菌科细菌用弧菌科细菌用 真菌显色平板真菌显色平板真菌培养用真菌培养用 罗氏培养基罗氏培养基分枝杆菌用分枝杆菌用常见标本细菌培养基选择常见标本细菌培养基选择常见标本细菌培养基选择常见标本细菌培养基选择 痰痰-血平板、巧克力平板、（中国蓝血平板、巧克力平板、（中国蓝/麦康凯）放麦康凯）放CO2CO2环境，能分离肺炎链球菌、环境，能分离肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌 尿尿-血平板、（中国蓝血平板、（中国蓝/麦康凯）定量培养麦康凯）定量培养 粪便粪便-中国蓝中国蓝/麦康凯平板、麦康凯平板、SSSS平板等能分离沙门菌、志贺菌等，报告平板等能分离沙门菌、志贺菌等，报告“未检未检出出XXXXXX菌菌”脑脊液脑脊液-血平板、巧克力平板血平板、巧克力平板CO2CO2环境，能分离常见苛养菌（脑膜炎奈瑟菌、环境，能分离常见苛养菌（脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、单核细胞李斯特菌等），常规进行革兰染色、墨汁染色流感嗜血杆菌、单核细胞李斯特菌等），常规进行革兰染色、墨汁染色 胸腹水：血平板、巧克力、肉汤胸腹水：血平板、巧克力、肉汤 胃液、胆汁：血平板、中国兰、肉汤胃液、胆汁：血平板、中国兰、肉汤 真菌培养：沙氏培养基真菌培养：沙氏培养基 厌氧培养：厌氧血平板、中国兰、肉汤、涂片厌氧培养：厌氧血平板、中国兰、肉汤、涂片 阴拭子、脓、分泌物：血平板、中国兰、肉汤阴拭子、脓、分泌物：血平板、中国兰、肉汤 咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中国兰、肉汤；咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中国兰、肉汤；TBTB培养：罗氏鸡蛋培养培养：罗氏鸡蛋培养注：血平板和巧克力平板放置注：血平板和巧克力平板放置注：血平板和巧克力平板放置注：血平板和巧克力平板放置CO2CO2CO2CO2培养箱或烛缸培养，其它放置普通培养环境培养箱或烛缸培养，其它放置普通培养环境培养箱或烛缸培养，其它放置普通培养环境培养箱或烛缸培养，其它放置普通培养环境培养结果的观察（致病菌的选择）培养结果的观察（致病菌的选择）培养结果的观察（致病菌的选择）培养结果的观察（致病菌的选择）观察培养基上是否有细菌生长观察培养基上是否有细菌生长 观察生长情况（是单一种细菌还是多种细菌）观察生长情况（是单一种细菌还是多种细菌）观察生长的细菌是否具有某些典型特征观察生长的细菌是否具有某些典型特征 排除污染细菌排除污染细菌 对于无菌部位所采集的标本（对于无菌部位所采集的标本（CSFCSF、胸水、腹水、关节液、血液、骨髓、各器、胸水、腹水、关节液、血液、骨髓、各器官穿刺液等等），只要培养出细菌（排除污染）一律都视为致病菌。官穿刺液等等），只要培养出细菌（排除污染）一律都视为致病菌。对于有菌部位或易被正常菌群污染的标本，培养出细菌后，要根据标本的不对于有菌部位或易被正常菌群污染的标本，培养出细菌后，要根据标本的不同，排除正常菌群后，再挑选致病菌（请看下图）。同，排除正常菌群后，再挑选致病菌（请看下图）。无无菌菌部部位位标标本本涂片染色涂片染色涂片染色涂片染色 涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。1 1 革革兰兰染染色色：革革兰兰染染色色报报告告必必须须包包括括染染色色反反应应或或微微生生物物种种类类和和类类别别，描描述述物物种种的的形形态态或或结结构构。如如革革兰兰染染色色见见到到革革兰兰阳阳性性球球菌菌，呈呈葡葡萄萄状状排排列列；又又如如革革兰兰染染色色见到真菌小分生孢子及菌丝。见到真菌小分生孢子及菌丝。2.2.抗抗酸酸染染色色：抗抗酸酸染染色色报报告告应应显显示示找找到到或或未未找找到到或或可可疑疑抗抗酸酸杆杆菌菌三三种种结结果果，报报告告中中应应以以加加号号体体现现标标本本中中抗抗酸酸杆杆菌菌的的存存在在量量。如如找找到到抗抗酸酸杆杆菌菌+；见见到到染染色色不不典典型型抗抗酸酸杆杆菌菌+，建建议议再再送送标标本本；不不能能报报告告找找到到结结核核杆杆菌菌但但可可报报告告未未找找到到结结核核杆菌。杆菌。细菌鉴定细菌鉴定血清学试验血清学试验血清学试验血清学试验 肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备细菌室应具备1-31-3项血清试剂。项血清试剂。1.1.志贺氏菌多价和单价凝集血清：志贺氏菌多价和单价凝集血清：2.2.沙门氏菌多价和单价凝集血清沙门氏菌多价和单价凝集血清 3.3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清 4.4.耶尔森氏菌凝集血清耶尔森氏菌凝集血清 真菌鉴定真菌鉴定真菌鉴定真菌鉴定1 1每每一一基基层层实实验验室室必必须须开开展展真真菌菌涂涂片片，报报告告临临床床是是否否找找到到真真菌菌；是是否否见见到到真真菌菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌;区别曲菌或毛霉菌。区别曲菌或毛霉菌。2 2开开展展酵酵母母样样真真菌菌分分离离培培养养，应应具具备备最最基基本本的的沙沙氏氏培培养养基基或或用用显显色色培培养养基基，鉴鉴别白念和非白念，隐球菌等。别白念和非白念，隐球菌等。3.3.有条件的实验室应开展非培养的鉴定方法，如有条件的实验室应开展非培养的鉴定方法，如-D-D葡聚糖的检测。葡聚糖的检测。抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验-常用方法常用方法常用方法常用方法 扩散试验扩散试验diffusion testdiffusion test：纸片扩散法：纸片扩散法(抑菌圈直径抑菌圈直径)稀释试验稀释试验dilution testdilution test：肉汤稀释法、琼脂稀释法、最小抑菌浓度：肉汤稀释法、琼脂稀释法、最小抑菌浓度minimum minimum inhibitory concentrationinhibitory concentration，MICMIC E E试验试验E-testE-test 自动化仪器检测自动化仪器检测 纸片扩散法操作步骤纸片扩散法操作步骤制备接种物（制备接种物（0.50.5麦氏单位麦氏单位）M-HM-H琼脂平板上（琼脂平板上（1515分钟内接种，涂抹均匀分钟内接种，涂抹均匀）在接种好的琼脂平板上贴加纸片在接种好的琼脂平板上贴加纸片 孵育（孵育（1515分钟内反转平板，分钟内反转平板，3535C C空气孵育空气孵育）苛养菌苛养菌5 5COCO2 2孵育孵育 判度结果和解释结果判度结果和解释结果ESBL确认试验ESBLESBL的质控频率的质控频率的质控频率的质控频率 筛选试验和表型确证试验均可每日进行或每周进行，所选择菌株为肺克筛选试验和表型确证试验均可每日进行或每周进行，所选择菌株为肺克700603700603或或大肠埃希菌大肠埃希菌2592225922。应该注意的是：肺克应该注意的是：肺克应该注意的是：肺克应该注意的是：肺克700603ESBL700603ESBL700603ESBL700603ESBL基因在质粒上，应将其冻存于基因在质粒上，应将其冻存于基因在质粒上，应将其冻存于基因在质粒上，应将其冻存于-60-60-60-60或以下。或以下。或以下。或以下。奇异变形杆菌奇异变形杆菌奇异变形杆菌奇异变形杆菌 ESBL ESBL 监测试验监测试验监测试验监测试验不适用不适用不适用不适用CeftriaxoneCeftriaxone11 2727CefotaximeCefotaxime NANANANAAztreonamAztreonam11 2222CeftazidimeCeftazidime11*22*22*CefpodoximeCefpodoxime稀释法稀释法 (g/ml)g/ml)纸片扩散法纸片扩散法 (mm)(mm)DrugDrug可诱导的克林霉素可诱导的克林霉素耐药耐药 (erm-erm-介导介导)常规常规D D试验试验:阳性阳性 15 15 g g 红霉素纸红霉素纸片及片及 2 2 g g克林霉克林霉素之间距离为素之间距离为15-15-26.26.“D Test”阳性反应 纸片扩散法判读结果将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏忽略薄纱样蔓延生长，微弱生长（20%或更少），克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示“D”抑菌圈五、实验后质量控制药敏结果结果的审核药敏结果结果的审核药敏结果结果的审核药敏结果结果的审核n nS-S-敏感（敏感（SusceptibleSusceptible）：用常规用量治疗有效，常规用药时达到的平均血药浓）：用常规用量治疗有效，常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的度超过细菌的MIC 5MIC 5倍以上。倍以上。n nR-R-耐药（耐药（ResistanceResistance）：用常规用量治疗不能抑制细菌的生长，）：用常规用量治疗不能抑制细菌的生长，MICMIC高于药物在高于药物在血、体液中可能达到的浓度。血、体液中可能达到的浓度。n nI-I-中介中介 (Intermediate)(Intermediate)：MICMIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株，药物生理浓集部位有效株，药物生理浓集部位有效(泌尿道泌尿道)