1、组织与细胞化学课件第一章第一章概概述述 第一节概述 第二节组织化学与细胞化学得发展史第一节概述概述1、组织与细胞化学 1、1定义:组织化学组织化学(histochemistry)(histochemistry)与细胞化学与细胞化学(cytochemistry)cytochemistry)就是运用物理学、化学、免疫学与分子生物学等原理与就是运用物理学、化学、免疫学与分子生物学等原理与技技术术,对组织与细胞得化学成分或酶活性进行定性、定位对组织与细胞得化学成分或酶活性进行定性、定位与定量研究得科学与定量研究得科学。1、2基本原理:组组 织织 化化 学学(histochemistry)histoch
2、emistry)与与 细细 胞胞 化化 学学(cytochemistrycytochemistry)技技术术得得基基本本原原理理就就是是在在组组织织切切片片上上或或被被检检材材料料上上,加加一一定定试试剂剂,使使她她与与组组织织或或细细胞胞中中待待检检物物质质发发生生化化学学反反应应成成为为有有色色沉沉淀淀物物,以以用用光光镜镜观观察察,若若为为重重 金金 属属 沉沉 淀淀,可可 以以 用用 电电 镜镜 观观 察察,称称 电电 镜镜 组组 织织 化化 学学(electron electron microscope microscope histochemistry)histochemistry
3、)。这这种种方方法法可可用用于于检检测测细细胞胞内内得得酶酶类类、糖糖类类、脂脂类类。核核酸酸与与某某些些金金属属元元素素等等。如如进进一一步步应应用用显显微微分分光光光光度度计计等等测测定定标标本中沉淀物得强度本中沉淀物得强度,则能较精确地进行定量研究。则能较精确地进行定量研究。2、研究组织、细胞传统得化学方法传传统统得得组组织织化化学学只只就就是是利利用用物物理理或或化化学学反反应应显显示示组组织织或或细细胞胞内内得得化化学学成成分分或或酶酶活活性性而而对对其其进进行定性、定位与定量研究。行定性、定位与定量研究。糖类显示法糖类显示法 最常用于显示细胞、组织内得多糖与蛋白多糖得方法就是过碘酸
4、-雪夫反应(periodic acid Schiff,PAS反应)。基本原理就是:糖被强氧化剂过碘酸(HIO4)氧化后,形成2-醛基;后者与Schiff试剂中得无色品红亚硫酸复合物结合,形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖得存在。酶类显示酶类显示 细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定得化学反应。酶得显示法就是通过显示酶得活性来表明酶得存在,而不就是酶得本身。将具有酶活性得组织放人含有一定底物得溶液中孵育,底物经酶得作用形成初级反应产物,她再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)得溶液(PH5、
5、0)中孵育,底物经酶得作用,水解并释放出磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成微细得磷酸铅沉淀,此时,可在电镜下检出;如再用硫化铵处理时,磷酸铅被置换成硫化铝沉淀,可在光镜下见到。脂类显示脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏内、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色;亦可用锇酸固定兼染色,脂类呈黑色。核酸显示法核酸显示法显示DNA得传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后,使细胞内DNA水解,打开DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤碱之间得连接键,使其释放出醛基,再用Schiff试剂处理,形成紫红色反应产物。如用甲基绿-派若宁反应,可同时显示细胞内得DNA
6、与RNA甲基绿与细胞核中得DNA结合呈蓝绿色,派若宁与核仁及胞质内得RNA结合呈红色。3、现代意义得细胞与组织化学 包包括括无无机机物物组组织织化化学学、酶酶组组织织化化学学、电电镜镜细细胞胞化化学学、荧荧光光组组织织化化学学、免免疫疫组组织织化化学学、同同工工酶酶组组织织化化学学、定定量量组组织织化化学学、原原位位杂杂交交组组织织化化学学、放放射射自自显显影影技技术术、流流式式细细胞胞术术与与激激光光扫扫描描共共聚聚焦焦显显微微术术等等。故故现现代代组组织织化化学学得得概概念念已已远远远远超超过过了了原原有有得得范范围围,理理论论、内内容容、技技术术手手段段与与研研究究范范围围都都比比过过去
7、去更更广广泛泛、更更深深入入。包包括括经经典典组组织织化化学学、免免疫疫组组织织化化学学与与原原位位杂杂交交组组织织化化学学在在内内得得广广义义组组织织化化学学就就是是介介于于细细胞胞学学、组组织织学学、生生物物化化学学以以及及分分子子生生物物学学之之间间得得新新兴兴边边缘缘学学科科,已已成成为为医医学学生生物物学学科科研研工工作作得得重重要要手手段段。定定量量组组织织化化学学技技术术主主要要用用于于组组织织化化学学得得原原位位定定量量研研究究、就就是是组组织织化学从定性、定位研究进入定量研究得重要手段。化学从定性、定位研究进入定量研究得重要手段。流式细胞术与激光扫描共聚焦显微术使组织化学得定
8、性、定位与定量研究又有了新得突破,特别就是激光扫描共聚焦显微术可在三维立体结构层面上对细胞内化学物质进行更深层次得研究,并在各种细胞得微型手术切割以及细胞膜流动性、膜电位、膜通透性、高分子物质扩散与受体移动等得检测方面有了越来越广泛得应用。然而各类组织化学虽有其特定得概念与范围、但都就是源于组织化学,且其实验技术也有其共同点。或就是在原组织化学基础上进一步发展而成型。细胞就是一个生命体,组织得构成也就是由细胞组成,在研究生命规律及探索生命规律得过程中,要应用到许多技术与方法,从而产生了组织化学与细胞化学等学科。4 4、组织化学发展得基础组织化学发展得基础组织化学基于并源于组织学、细胞学与生物化
9、学,又有别于这些学科。组织化学与组织学与细胞学得区别:前者得着眼点就是研究组织细胞内得化学组成及其含量与酶得存在及其活性,而后者得着眼点就是研究组织细胞得形态结构及其与功能得关系。组织化学与生物化学得区别:虽然两者均着眼于组织细胞内得化学组成及其含量与酶得存在及其活性,但就是,生物化学技术中通常就是将组织与细胞破坏,制成匀浆,然后进行化学测定,而不考虑定位;在组织化学技术中,就是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分,故定位性能好。生物化学技术中得化学反应就是在试管内进行,而组织化学技术中得化学反应通常就是在组织切片或细胞涂片中进行。组织化学要求一定在显微镜下能观察到所检测得化学物质,但在大
10、多数情况下,所见到得并不就是某种化学物质本身,而就是该物质在其存在部位经过化学反应得产物、这种产物在镜下可直接或间接被观察到,她所在得位置与数量能够代表该物质得位置与数量。组织化学自出现以来,已取得长足得发展。这些发展以细胞生物学、生物化学、免疫学与分子生物学得快速发展为基础。第二节组织化学与细胞化学得发展史第二节组织化学与细胞化学得发展史我国组织化学发展概况我国组织化学发展概况我国得组织化学研究工作起步于20世纪50年代,组织化学家李肇特、张作干教授等人作为我国组织化学发展得奠基者,积极从事组织化学方面得科研与教学工作。并培养出一大批组织化学得专门研究人才。她们在20世纪50年代末率先应用并
11、在全国范围内推广“组织化学”技术,举办组织化学培训班,招收全国各医学院校青年教师与科研人员进修学习,自编组织化学教材,为研究生开办组织化学课程。随后,我国从事组织化学研究得专家还有张保真、王启民、马仲魁与艾民康等,她们为我国组织化学事业得发展作出了突出贡献。中国解剖学会于1988年3月在广州成立了“组织化学与细胞化学学组”,并决定筹办中国组织化学与细胞化学杂志。这标志着中国组织化学与细胞化学得研究进入了一个崭新阶段。国际组织化学与细胞化学学会联合会(InternationalFederationofSocietiesforHistochemistryandCytochemistry,IFSHC
12、)就是全世界组织化学与细胞化学工作者得学术组织,于1960年9月成立于法国巴黎,每4年召开一次大会。12大家应该也有点累了,稍作休息大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流我国组织细胞化学家艾民康教授代表中国组织细胞化学工作者于1980年首次参加了第6届IFSHC大会,并在第8届IFSHC大会上当选为联盟理事,中国被正式接纳为会员,从此我国成为IFSHC得成员与理事国。此后。苏慧慈、成令忠、蔡文琴教授先后当选为IFSHC得理事。中日组织化学与细胞化学研讨会由我国艾民康、朴英杰教授与日本组织细胞化学家小川与郎教授组织发起,继
13、1989年第一届研讨会在广州召开以来,先后在我国西安、沈阳、重庆、上海、日本东京、中国武汉与日本甲府召开了第28届会议。这些会议展现了中日两国组织化学与细胞化学领域内得最新研究成果、新理论、新技术方法得进展,并加强与促进了我国组织细胞化学界得国际学术交流细胞生物学发展与组织化学细胞生物学发展与组织化学细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命活动规律得细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命活动规律得科学科学,组织化学以细胞生物学为基础发展而来。组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得认识从宏观世界引向微显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得
14、认识从宏观世界引向微观世界得广阔领域观世界得广阔领域,由此人们从肉眼所见得大体结构开始探索光学显微镜由此人们从肉眼所见得大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞得微细结构下组织细胞得微细结构,正因为有了对机体微细结构得充分认识正因为有了对机体微细结构得充分认识,才有可才有可能产生对组织细胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而能产生对组织细胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而,光学显微镜得分辨率有限光学显微镜得分辨率有限,仅能观察到细胞膜、细胞质与细胞核仅能观察到细胞膜、细胞质与细胞核,对于亚对于亚细胞结构细胞结构,即超微结构得观察无能为力。即超微结构得观察无能为力。19321
15、932年年,德国科学家德国科学家KnollKnoll与与RuskaRuska在西门子在西门子(Siemens)(Siemens)公司设计研制公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体得认识带入了超微结了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体得认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家生物学家WilsonWilson得名言得名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”,”,至今至今还有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产生与发展奠
16、还有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产生与发展奠定了形态学基础。定了形态学基础。免疫学发展与组织化学免疫学发展与组织化学1818世纪世纪7070年代英国医生年代英国医生EdwardJennerEdwardJenner研究出用牛痘菌预防天花得方法研究出用牛痘菌预防天花得方法,为免疫学对传染病得预防开辟了广阔前景。为免疫学对传染病得预防开辟了广阔前景。1919世纪末、法国化学家、微生物学家世纪末、法国化学家、微生物学家LouisPasteurLouisPasteur在研究人与动物传染病在研究人与动物传染病时时,分析了免疫现象分析了免疫现象,并在琴纳得启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫
17、苗并在琴纳得启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗,预防动物炭疽病预防动物炭疽病,用减毒狂犬病毒株制成疫苗、预防人类狂犬病。德国细用减毒狂犬病毒株制成疫苗、预防人类狂犬病。德国细菌学家、免疫学家菌学家、免疫学家EmilAdolfvonBehringEmilAdolfvonBehring于于18901890年发现免疫血清中有抗年发现免疫血清中有抗白喉毒素得抗毒素存在、白喉毒素得抗毒素存在、日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素得抗毒素日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素得抗毒素,两人共同研究血两人共同研究血清疗法成功。从此清疗法成功。从此,人们开始探词人们开始探词 免疫机制免疫机制,把细胞得
18、吞噬作用与抗毒素把细胞得吞噬作用与抗毒素得中与作用看成就是特异性免疫得根据得中与作用看成就是特异性免疫得根据,并逐步展开了细胞免疫与体液免并逐步展开了细胞免疫与体液免疫两大学派得争鸣。体液免疫学派代表就是德国细菌学家疫两大学派得争鸣。体液免疫学派代表就是德国细菌学家EhrlichPaulEhrlichPaul。她用生物化学方法研究免疫现象。特别就是以蛋白质化学与糖化学作为基她用生物化学方法研究免疫现象。特别就是以蛋白质化学与糖化学作为基础础,探讨抗原与抗体得本质及其相互作用。于探讨抗原与抗体得本质及其相互作用。于18961896年提出抗体形成得侧链年提出抗体形成得侧链学说。学说。到20世纪60
19、年代,对体液免疫研究已经达到分子水平,即揭示了抗体得分子结构与功能。同时,对细胞免疫研究也有明显进展,特别就是在杂交瘤技术方面得突破性进展,这不仅丰富了细胞学内容,而且为获得单克隆抗体或介质物质开辟了一条新道路。将抗原、抗体得特异性与组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等),形成了一项新技术免疫组织化学技术。因此,免疫组织化学技术比组织化学技术对细胞成分得检测范围更为广泛、特异性也更强。生物化学发展与组织化学生物化学发展与组织化学生物化学就是一门运用化学原理及方法研究生命
20、得科学。她一方面就生物化学就是一门运用化学原理及方法研究生命得科学。她一方面就是进行细胞组成成分得化学分析是进行细胞组成成分得化学分析,另一方面就是对这些成分在生命过程中另一方面就是对这些成分在生命过程中所发生得化学反应进行分析所发生得化学反应进行分析,而组织化学正就是利用这些化学反应原理来而组织化学正就是利用这些化学反应原理来实现对组织细胞化学成分得定性、定位与定量研究。实现对组织细胞化学成分得定性、定位与定量研究。2020世纪初世纪初,人类已经认识到组成蛋白质得人类已经认识到组成蛋白质得2020个标准氨基酸中得个标准氨基酸中得1919种。种。E E、FischerFischer提出蛋白质就
21、是由相邻氨基酸之间得肽链连接而成提出蛋白质就是由相邻氨基酸之间得肽链连接而成,并推论这些肽并推论这些肽链就是由一个氨基酸得。链就是由一个氨基酸得。氨基与相邻得羟基连接时脱去水而形成。到氨基与相邻得羟基连接时脱去水而形成。到1919世纪末世纪末,其她细胞成分其她细胞成分,如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能被部分提纯。例如被部分提纯。例如,FriedrichMiescher(1871FriedrichMiescher(1871年年)在其细胞成分研究中在其细胞成分研究中,从从死得白细胞核中分离出脱氧核糖核酸死得白细胞核中分离出脱氧核糖核酸(DNA)(DN
22、A)。但就是。但就是,当时这一重要发现当时这一重要发现并没有与遗传联系起来并没有与遗传联系起来,几乎过于几乎过于5050年之后年之后,才开始认识到才开始认识到DNADNA在遗传中在遗传中所起得重要作用。所起得重要作用。因此因此,在生物化学得发展中对生物体大分子物质结构与功能得认识为组在生物化学得发展中对生物体大分子物质结构与功能得认识为组织化学奠定了基础。例如。在组织化学中对组织细胞成分中酶得检测织化学奠定了基础。例如。在组织化学中对组织细胞成分中酶得检测,就就是将组织切片置于含有特异性底物得溶液中是将组织切片置于含有特异性底物得溶液中,溶液中得底物经组织切片中溶液中得底物经组织切片中酶水解、
23、氧化等作用形成反应产物酶水解、氧化等作用形成反应产物,即初级反应产物。初级反应产物再与即初级反应产物。初级反应产物再与某种捕捉剂结合某种捕捉剂结合,形成有色得终产物使组织切片中得酶变成在显微镜下可形成有色得终产物使组织切片中得酶变成在显微镜下可见物见物,从而在原位检测酶活性从而在原位检测酶活性,了解她得存在、分布与功能。了解她得存在、分布与功能。现代组织化学得发展现代组织化学得发展近半个世纪就是现代组织化学蓬勃发展时期。组织(细胞)化学新方法得建立,使其技术手段更精细,内容更丰富,如Mann自1902年起及此后许多学者得研究,逐渐建立了完善得组织冷冻切片技术,弥补了一般化学固定及石蜡包埋得缺点
24、,可防止脂类、多糖类与无机盐得丢失,防止酶活性丧失等,推动了脂类、黏多糖及酶得组织化学研究。在蛋白质与氨基酸组织化学显色法得研究中,Danielli(1947年)建立了显示蛋白质(酪氨酸、色氨酸与组氨酸)得四氮盐反应,还有坂口(1925年)建立并经其她学者改进得精氨酸(组蛋白中富含)显色法,Danielli(1950年)与Pearse(19年)等建立得SS基与SH基反应(显示胱氨酸与半胱氨酸,与角蛋白检测相关),vanGieson得胶原显示法,Foot(1925年)显示网状纤维得银浸法,Weigert、Verhoeff(1908)与Gomori(1950年)等得弹性纤维染色法,Mallory(
25、1938年)得纤维蛋白染色法等。在核酸组织化学显色法得研究中,最著名得就是Feulgen与Rossenbeck(1924年)建立得Feulgen-Schiff反应,用以显示细胞核内得DNA。另一个就是Brachet于19401944年建立得甲基绿焦宁(pyronine)染色法显示细胞内得RNA。此法使胞质与核仁内得RNA显红色,核内得DNA显绿色,标本色彩鲜艳,为研究者所乐用。碳水化合物组织化学显色法中,最著名得就是McManus(1946年)与Hotchkiss(1948年)建立得过碘酸-Schiff反应(PAS反应),可使细胞与组织内得多糖、黏多糖、糖蛋白呈红色;Steedman(1950
26、年)建立了用alcian蓝显示酸性黏多糖与透明质酸得方法;Michaelis等(1945年)发现用甲苯胺蓝染色,可使组织中得肝素等酸性黏多糖呈异染性。脂类得组织化学显色法中,除用苏丹外,Michaelis(1901年)、Lison(1930年)与Liliie(1944年)等还发现用苏丹、油红O、苏丹黑等脂溶性染料得染色法。此外,还有用锇酸浸染显示脂类得方法。有关酶组织化学得研究从20世纪40年代兴起,至20世纪50年代初已建立了18类酶得数十种显色方法。Takamatsu(高松英雄)与Gomori于1939年同时证明了碱性磷酸酶得组织化学方法,这一年标志着酶组织化学真正开始,以后相继出现了许多
27、酶得显示方法。此时,随着电子显微镜得问世与超薄切片技术得发展,Scheldon等(1955年)首先将超薄切片技术应用到酶组织化学中,在电镜下观察酸性磷酸酶得分布,Brand等(1956年)又用此法观察到碱性磷酸酶存在于溶酶体内,她们得成就使组织化学技术与电镜技术结合起来,从而开创了电镜组织化学得新领域,使酶在细胞中得定位进入到亚细胞水平。1941年Coons与她得同事首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌而获得成功,开创了免疫细胞化学得新篇章。为在荧光显微镜下能够对酶进行观察,Coons等人(1950年)提出了荧光抗体法。但就是,荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵得荧光显微镜才能观察。N
28、akane等人(1966年)尝试用酶代替荧光素来标记抗体得方法,从而成功地开创了酶标记抗体得新技术(酶标抗体法)。Sternberger等人(1970年)又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引入,建立了过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法,使免疫酶法有了很大得进步。Geoghega(1978年)建立了胶体金标记术。Hsu等于20世纪80年代发明了亲与素生物素过氧化物酶复合物法(ABC法)。在此之后、免疫金银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世。随着抗原得提纯与抗体标记技术得改进,特别就是德国人Kohler与英国人Milstein(1975年)建立杂交瘤制备单克隆抗体技术以来、使免疫组织化学发
29、展到一个新得水平,使免疫组织化学技术在生命科学研究中日益显示出巨大得实用价值。近二十年来,相继发现了多种亲与物质?如植物凝集素(1ectin)与糖结合物(glycolconjugate)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA)与IgG、生物素(biotin)与卵白素(avldin)(亲与素)、激素、脂质与受体等。这些物质就是一些有多价结合能力得物质,不但亲与物质之间有高度亲与力,而且可以与标记物如荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白等相结合。Bayer(1976年)将这种利用两种物质之间得高度亲与力而相互结合得反应进行细胞化学检测得技术称为亲与细胞化学(affinitycyt
30、ochemistry)。亲与细胞化学技术得建立。提高与增加了免疫细胞化学得敏感性与检测范围,就是免疫细胞化学得新发展。分子杂交(insituhybridization)技术引入免疫细胞化学,就是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展得重要标志。Hall(1961年)首先建立了液相核酸杂交技术,开创了核酸杂交技术得研究与应用。Bohon(1962年)设计了较简单得固相核酸杂交术。Gall与Pardue(1969年)应用蟾蜍核糖体基因探针与卵母细胞杂交,确定该基因位于细胞核得核仁内,开创了原位杂交组织化学技术得应用。Bauman(1981年)发明了用荧光素标记cRNA探针做原位杂交(FISH术),Br
31、igat(1983年)建立了生物素标记探针术。Boeringer等(1987年)发明了地高辛标记探针,并将药盒投放市场,使原位杂交得应用更安全与简便。1998年,Kononen等首次提出组织芯片(tissuechip)得概念,并很快证实了其应用价值。组织芯片又称组织微阵列(tissuemlcroarray,TMA),她就是将数十个乃至数以千计不同来源得组织样品黏贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上,形成组织微阵列。在同一反应条件下对组织芯片进行免疫组织化学染色、原位杂交、FISH或原位PCR等,以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质得细胞来源、分布特征与表达差异等。她得最大便利之处在于可以
32、对大量组织标本同时进行检测,缩短了检测时间,减少了不同染色玻片间人为造成得差异,使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子得测定更具有可比性。组织芯片虽说就是一种快速、高通量获取生物信息得好方法,但就是由于使用石蜡切片,对那些只能应用于冷冻组织切片得抗体或核酸分子杂交方法则不适合。为了弥补这一缺陷,最近美国又发展了冷冻细胞阵列(frozencellarray),其基本原理与组织芯片相似,但使用得材料就是新鲜得细胞系而不就是经固定剂固定、石蜡包埋得组织细胞生物学发展与组织化学细胞生物学发展与组织化学细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命活动
33、规律得科学活动规律得科学,组织化学以细胞生物学为基础发展而来。组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得认识从宏观世显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得认识从宏观世界引向微观世界得广阔领域界引向微观世界得广阔领域,由此人们从肉眼所见得大体由此人们从肉眼所见得大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞得微细结构结构开始探索光学显微镜下组织细胞得微细结构,正因为正因为有了对机体微细结构得充分认识有了对机体微细结构得充分认识,才有可能产生对组织细才有可能产生对组织细胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而,光学显微镜
34、得分辨率有限光学显微镜得分辨率有限,仅能观察到细胞膜、细胞质与仅能观察到细胞膜、细胞质与细胞核细胞核,对于亚细胞结构对于亚细胞结构,即超微结构得观察无能为力。即超微结构得观察无能为力。19321932年年,德国科学家德国科学家KnollKnoll与与RuskaRuska在西门子在西门子(Siemens)(Siemens)公公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体得认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深机体得认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家入了解。才可能透彻阐明其功能。著
35、名生物学家WilsonWilson得得名言名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”,”,至今还至今还有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产生与发展奠定了形态学基础。生与发展奠定了形态学基础。第二章组织学得研究方法第二章组织学得研究方法第一节概述第二节组织学制片概述 第三节取材与固定第四节固定后得处理第五节染色及染色方法第一节概述 组织学组织学(histofogyhistofogy)就是应用显微镜研究机体微就是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能得科学细结构及其相关功能得科学,就是在解剖学得基础上
36、就是在解剖学得基础上从宏观到微观发展形成得从宏观到微观发展形成得,故又被称为显微解剖学故又被称为显微解剖学(microscopic anatomymicroscopic anatomy)。组织学得研究内容组织学得研究内容,首先要研究组成机体得形态首先要研究组成机体得形态结构与功能单位结构与功能单位细胞细胞;继而继而 研究在细胞及其产研究在细胞及其产物所组成得基本组织物所组成得基本组织(primary tissueprimary tissue)上皮组上皮组织。结缔组织、肌肉组织与神经组织织。结缔组织、肌肉组织与神经组织;在此基础上研在此基础上研究各器官系统得微细结构及其有关功能究各器官系统得微细
37、结构及其有关功能、组织学就是重要得基础课程,只有对机体微细结构得深入了解才可能透彻地阐明其功能;组织学得研究极大地促进了生理学得发展、生物化学得进步也促进了组织学得发展,例如,将生物化学及分子生物学得原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学,将免疫学得原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织得化学组成、分子结构及其基本生命现象,这些知识已成为现代组织学得重要组成部分。第二节 组织学制片1 1、组织学制片方法组织学制片方法 非切片法非切片法直接取物体进行观察直接取物体进行观察,不用切片机不用切片机,不经切片手续而制成切片得方法。不经切片手续而制成切片得方法。包括包括:
38、a a、整体封藏法整体封藏法 水螅水螅 鸡胚鸡胚 蛙胚蛙胚b b、涂片法涂片法 针对液体或半液体。针对液体或半液体。血液血液 骨髓骨髓 腹水腹水c c、活体标本观察法活体标本观察法 蛙口腔黏膜得纤毛运动蛙口腔黏膜得纤毛运动 细胞吞噬细胞吞噬d d、分离法分离法 分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞e e、铺片法铺片法 肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等f f、磨片法磨片法 骨组织或牙齿骨组织或牙齿 切片法切片法需依靠切片机将组织切成薄片得方法。需依靠切片机将组织切成薄片得方法。2 2、组织切片制作流程组织切片制作
39、流程:杀死、取材与固定、洗涤、脱水、透明、透入、包埋、切片、贴片、染色、封藏。第三节取材与固定1、取材与固定(组织切片制作得关键步骤)取材:首首先先动动物物组组织织需需从从动动物物体体中中取取出出。方方法法有有多多种种,主主要要就就是是视视材材料料得得种类种类,实验动物个体大小及观察得目得而定。实验动物个体大小及观察得目得而定。杀死得方法杀死得方法:大得个体大得个体(实验动物实验动物)用刀用刀,斧头斧头,麻醉等方法麻醉等方法、小得个体小得个体(实验动物实验动物)采用大号剪刀或断头法等。采用大号剪刀或断头法等。取取材材注注意意事事项项:取取材材需需速速度度快快,取取材材以以后后,应应立立即即进进
40、行行固固定定。否否则则细细胞胞会会自自溶。溶。固定 固定得目得:1.防止组织腐败及自溶。2.将所需要得物质原位沉淀、保存,尽量使各种成分保持与原来(活着)得状况相仿。3、沉淀下来以后,会造成组织得折光率得变化。即增加折光性,并使易染色。4、通过固定以后,使组织产生硬化现象,有利于切片得制作。2 2、固定得对象、固定得对象 构成细胞得主要物质就是蛋白质,她分散在细胞内,所以固定得对象就是蛋白质。作为固定剂得化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质,脂肪等成分,并具有强得渗透力、固定剂必须具备得性质固定剂必须具备得性质:1)迅速渗入组织杀死原生质(渗透速度要快),即很快能将细胞杀死,不会使组织产生变化。
41、2)渗透要均匀。(使组织内外尽量保持一致)3)尽量避免出现膨胀与收缩状况。4)尽量避免使组织块变形,卷曲。5)使细胞内蛋白质凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用与染色能力。7)使组织变硬,适于切片,但又不至于使材料坚硬而松脆。8)固定以后,又能有保存组织得特性(如用福尔马林浸泡)。3 3、组成固定剂得性质与条件、组成固定剂得性质与条件 4 4、固定剂得作用方式固定剂得作用方式(三种三种)1)使蛋白质变性、蛋白质变性会成为沉淀物质,其就是不可逆得、例:酒精使蛋白质变性不就是与蛋白质形成化合物,而就是使蛋白质脱水而使之变性。2)固定剂与蛋白质发生化合作用,改变了蛋白质得结构,产生沉淀。3)使蛋白质
42、冻胶化,固定液与蛋白质间起了化学上得结合,改变了分子结构,不产生沉淀,就是使蛋白质凝胶化,并不溶与水。5 5、固定剂得媒染效果固定剂得媒染效果 生活细胞大多不易染色,但经过固定后便易染色,这就是由于固定剂与蛋白质相结合,同时也能与染料分子结合,从而使蛋白质着色。6 6、固定剂得穿透率。固定剂得穿透率。穿透率要强,迅速,才能在短时间内使组织内外都得到固定。7 7、取材与固定应注意事项取材与固定应注意事项1)固定得材料要新鲜。组织会产生自溶。夏天不超过2-4小时。材料取出后应立即固定,有些组织自溶很快。冬天不超过12小时。2)取材得部位要准确。(要清楚所需得材料位于动物体内哪个位置)3)取材工具要
43、锋利,动作需仔细。4)切取得组织块必须小而薄,一般取0、3-0、5mm厚得组织块进行固定。5)清洗。如小肠组织需清洗其内得黏液及食物残渣,才能投入到固定剂内。6)组织块附加标记得方法。组织块取得较多并放在同一容器内,易发生混淆。应加标签以区别之,并注明固定液,材料,日期等。7)固定剂得用量。固定组织,一般所采用得固定液体积为组织块得10-15倍,容器勿过小,材料勿太多。8 8、常见固定剂得性质及使用常见固定剂得性质及使用-)-)单纯固定剂单纯固定剂 A A 甲甲醛醛(纯甲醛为一种气体)溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40%。甲醛使用时,需采用新鲜得。放置时间较长得
44、甲醛会变成多聚甲醛。为强得还原剂,其不可与氧化剂混合使用。作为固定剂得优点:渗透力强,使组织收缩少,固定均匀。能较好得固定脂肪,神经及髓鞘,且能固定高尔基体,线粒体。缺点:不能固定白蛋白与核蛋白。B B 乙醇乙醇(为无色透明得液体)其可与水与任意比例混合。优点:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺点:不宜作低温固定,渗透力较弱,使组织收缩,酒精浓度超过50%可溶解组织内得脂肪、类脂体,血色素等。C C 醋酸醋酸(具刺激味得无色液体)固定组织通常用5%得HAC。PH2-6,能防止细胞自溶及腐败。优点:其能沉淀核蛋白,就是种好得染色质固定剂、穿透速度快、固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀
45、白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体与高尔基。D D 苦味酸苦味酸(常见得一种酸)为一种强酸,黄色结晶、其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸得运输以溶解在水中得饱与苦味酸,浓度为1%。作为固定液得优点:能沉淀所有得蛋白质。缺点:使组织收缩,穿透力弱。E E 重重铬铬酸酸钾钾 橙红色得结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用、重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。优点:穿透力较强。缺点:使组织产生一点膨胀。F F、锇酸锇酸(四氧化锇)为黄色得结晶,为强得氧化剂。优点:其为脂肪及类脂体得唯一得固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色、可保持组织柔软。缺点:穿
46、透速度慢,难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。G G 氯化汞氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯。优点:其对蛋白质有较强得沉淀作用,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白),能充分固定细胞质与细胞核。缺点:二二)混合固定液混合固定液、BouinBouin液液 苦味酸饱与水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗透力强,使组织收缩少、固定时间12-24小时、Carnoy液无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快,多用于糖原,脱氧核糖核酸固定、Zenker液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液,须脱汞处理、Helly液重铬酸钾升汞双蒸水甲醛第四节 固定后得处理1、洗涤洗涤得目得 组组织织在在固固定定后后
47、一一定定要要把把渗渗入入组组织织里里面面得得固固定定液液洗洗去去,然然后后进进行行下下一一个个过过程程,为为防防止止组组织织中中留留有有较较多多得得固固定定剂剂影影响响脱脱水水剂剂,甚甚至至可可在在组组织织中中发发生生沉沉淀淀或或结结晶晶而而影影响响观观察察,特特别别就就是是对对陈陈旧旧性性标标本本更更应应注注意意流流水水冲冲洗洗,尽尽可可能能减减少少组组织织中中得得酸酸性性程程度度与与甲甲醛醛色色素素。对对于于混混合合性性固固定定液液,更应及时洗涤更应及时洗涤,有利于脱水有利于脱水,切片与染色。切片与染色。洗涤得方法1 1、固定剂以水配置者固定剂以水配置者 用用流流水水冲冲洗洗,可可使使组组
48、织织中中固固定定液液随随时时溢溢出出与与随随时时洗洗去去。大大得得动动物物组组织织冲冲洗洗时时间间为为2424小小时时左左右右,小小动动物物组组织织冲冲洗洗时时间间为为2-102-10小小时时。冲冲洗洗得得时时间间基基本本根根据据固固定定得得时时间间而而定定,新新鲜鲜得得标标本本固固定定时时间间短短,需需及及时时脱脱水水者者,冲冲洗洗时时间短。间短。2 2 固定剂含乙醇者固定剂含乙醇者 一般不要求冲洗一般不要求冲洗,如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近得乙醇冲洗。如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近得乙醇冲洗。3 3 特殊固定液洗涤法特殊固定液洗涤法 重重铬铬酸酸钾钾 流流水水冲冲洗洗12-2412-
49、24小小时时,或或用用亚亚硫硫酸酸,或或用用1%1%含含氯氯水水溶溶液液进进行行洗洗涤。涤。锇锇酸酸 流水冲洗流水冲洗12-2412-24小时小时,务必冲干净。务必冲干净。苦味酸苦味酸 用用50%50%或或70%70%乙醇浸泡。尽量洗去黄色。乙醇浸泡。尽量洗去黄色。氯氯化化汞汞 用用0 0、5%5%碘碘酒酒溶溶液液反反复复加加入入到到70%70%乙乙醇醇中中,直直至至黄黄色色不不再再褪褪去去为为止止、再用硫代硫酸钠或再用硫代硫酸钠或70%70%乙醇洗去碘。乙醇洗去碘。2、常用脱水剂 乙醇 为为常常用用得得脱脱水水剂剂。脱脱水水能能力力强强,并并能能使使组组织织硬硬化化。一一般般得得脱脱水水顺顺
50、序序就就是是 70%70%、80%80%、90%90%、95%I95%I、95%II95%II、无无水水乙乙醇醇I I、无无水水乙乙醇醇II II、无水乙醇、无水乙醇IIIIII。应注意得就是脱水必须在有盖得瓶子内进行。应注意得就是脱水必须在有盖得瓶子内进行。丙酮 沸沸点点为为56 56,脱脱水水作作用用比比乙乙醇醇强强,但但对对组组织织块块得得收收缩缩较较大大。脱水时间通常为脱水时间通常为1-31-3小时。小时。正丁醇 为为无无色色液液体体,沸沸点点100-118100-118,微微溶溶于于水水。一一般般使使用用方方法法为为:组组织织块块经经固固定定及及冲冲洗洗后后先先入入50%-70%-8