自身免疫病及免疫检验-PPT.pptx

自身免疫病及免疫检验自身免疫病及免疫检验第二十五章第二十五章 自身免疫病及免疫检验自身免疫病及免疫检验目录目录 概述概述 1自身免疫病的发病机制自身免疫病的发病机制2自身免疫病检验自身免疫病检验3自身抗体检测实验选择的原则自身抗体检测实验选择的原则4 1、自身耐受自身耐受(self-tolerance)正常情况下正常情况下,免疫系统对宿主自身得组织与细免疫系统对宿主自身得组织与细胞不产生免疫应答。胞不产生免疫应答。2、自身免疫自身免疫 (autoimmunity)当某种原因使自身耐受当某种原因使自身耐受性破坏时性破坏时,免疫系统就免疫系统就会对自身组织成分、细胞成分及其产物发生免疫会对自身组织成分、细胞成分及其产物发生免疫应答。应答。第一节第一节 概述概述一、基本知识一、基本知识3 3、自身免疫病自身免疫病(autoimmune disease,AID)自身免疫应答过强或持续时间过久自身免疫应答过强或持续时间过久,表现为质与表现为质与量得异常量得异常,所产生得自身抗体与所产生得自身抗体与(或或)自身致敏淋巴细自身致敏淋巴细胞对表达自身靶抗原得细胞与组织发动攻击胞对表达自身靶抗原得细胞与组织发动攻击,导致损导致损伤或功能障碍伤或功能障碍,并出现相应临床症状。并出现相应临床症状。二、自身免疫病得分类二、自身免疫病得分类1 1、按病程分为急性与慢性两种按病程分为急性与慢性两种2 2、按病因清楚与否分为原发性与继发性两种按病因清楚与否分为原发性与继发性两种3 3、按受累得解剖系统分为结缔组织病、神经肌按受累得解剖系统分为结缔组织病、神经肌肉疾病、消化系统病与内分泌疾病等肉疾病、消化系统病与内分泌疾病等4 4、按自身抗原得分布范围分为器官特异性与非按自身抗原得分布范围分为器官特异性与非器官特异性两类器官特异性两类分类分类疾病疾病结缔组织结缔组织系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿性关节炎、混合系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病性结缔组织病内分泌系统内分泌系统桥本甲状腺炎、桥本甲状腺炎、Graves病、病、Addison病、胰岛素依赖性糖病、胰岛素依赖性糖尿病尿病消化系统消化系统萎缩性胃炎、溃疡性胃炎、原发性胆汁性肝硬化萎缩性胃炎、溃疡性胃炎、原发性胆汁性肝硬化血液系统血液系统恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜性紫癜心血管系统心血管系统风湿性心肌炎风湿性心肌炎泌尿系统泌尿系统肾小球肾炎肾小球肾炎呼吸系统呼吸系统特发性肺纤维化特发性肺纤维化神经系统神经系统重症肌无力、多发性神经炎重症肌无力、多发性神经炎皮肤皮肤荨麻疹荨麻疹按发病部位得解剖系统分类按发病部位得解剖系统分类器官特异性自身免疫病器官特异性自身免疫病器官非特异性自身免疫病器官非特异性自身免疫病患者得病变常局限于患者得病变常局限于某一特定得器官某一特定得器官,由对由对器官得特异性抗原得器官得特异性抗原得免疫应答引起免疫应答引起全身性或系统性自身全身性或系统性自身免疫性疾病免疫性疾病;患者得病患者得病变可见于多种器官及变可见于多种器官及结缔组织结缔组织(结缔组织病结缔组织病或胶原病或胶原病)按自身抗原得分布范围分类按自身抗原得分布范围分类器官特异性器官特异性病病 名名自自 身身 抗抗 原原桥本甲状腺炎桥本甲状腺炎甲状腺球蛋白与甲状腺微粒体甲状腺球蛋白与甲状腺微粒体甲状腺功能亢进甲状腺功能亢进(Graves病病)TSH受体受体Addison病病肾上腺皮质细胞肾上腺皮质细胞自身免疫性萎缩性胃炎自身免疫性萎缩性胃炎胃壁细胞、内因子胃壁细胞、内因子溃疡性结肠炎溃疡性结肠炎结肠黏膜细胞结肠黏膜细胞重症肌无力重症肌无力乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体交感性眼炎交感性眼炎眼晶状体蛋白眼晶状体蛋白胰岛素依赖型糖尿病胰岛素依赖型糖尿病胰岛胰岛细胞细胞胰岛素抵抗型糖尿病胰岛素抵抗型糖尿病胰岛素受体胰岛素受体原发性胆汁性肝硬化原发性胆汁性肝硬化小胆管上皮细胞小胆管上皮细胞10大家应该也有点累了大家应该也有点累了,稍作休息稍作休息大家有疑问得大家有疑问得,可以询问与交流可以询问与交流器官非特异性器官非特异性病病 名名自自 身身 抗抗 原原SLESLE细胞核成分、细胞浆成分细胞核成分、细胞浆成分RARA变性变性IgG、类风湿相关得核抗原、类风湿相关得核抗原SSSS涎腺上皮细胞涎腺上皮细胞混合性结缔组织病混合性结缔组织病细胞核细胞核(RNP)自身免疫性溶血性贫血自身免疫性溶血性贫血红细胞红细胞特发性血小板减少性紫癜特发性血小板减少性紫癜血小板血小板特发性白细胞减少症特发性白细胞减少症白细胞白细胞硬皮病硬皮病细胞核蛋白、细胞核染色体着丝点细胞核蛋白、细胞核染色体着丝点多发性肌炎多发性肌炎细胞核蛋白细胞核蛋白三、自身免疫病得共同特点三、自身免疫病得共同特点1 1、血清中有自身抗体或自身反应性致敏血清中有自身抗体或自身反应性致敏T T淋巴细胞。淋巴细胞。自身抗体与自身抗体与(或或)自身反应性自身反应性T T细胞作用于靶抗原所在得细胞作用于靶抗原所在得组织细胞组织细胞,导致组织损伤与功能障碍。导致组织损伤与功能障碍。2 2、可复制出与可复制出与AIDAID相似得动物模型相似得动物模型,并可通过血清或致并可通过血清或致敏得淋巴细胞使疾病被动转移。敏得淋巴细胞使疾病被动转移。3 3、有一定得遗传倾向。病情转归与自身免疫反应得强、有一定得遗传倾向。病情转归与自身免疫反应得强度密切相关。度密切相关。4 4、部分自身免疫病好发于女性、部分自身免疫病好发于女性,且发病率随年龄增长且发病率随年龄增长而上升。而上升。5 5、免疫抑制剂治疗有效但不能根治。、免疫抑制剂治疗有效但不能根治。一、自身抗原形成一、自身抗原形成第二节第二节 自身免疫病得发病机制自身免疫病得发病机制1、隐蔽抗原得释放隐蔽抗原得释放 2、自身抗原改自身抗原改变变交感性眼炎交感性眼炎3、分子模拟分子模拟4、表位扩展、表位扩展2 2、B B细胞得多克隆激活细胞得多克隆激活二、免疫细胞与免疫调节二、免疫细胞与免疫调节功能功能得异常得异常3 3、调节性调节性T T细胞得功能异常细胞得功能异常1 1、T T、B B细胞得异常活化细胞得异常活化4 4、MHC-IIMHC-II类分子异常表达类分子异常表达三、遗传因素三、遗传因素自身免疫病自身免疫病HLA HLA 基因基因相关系数相关系数强直性脊柱炎强直性脊柱炎 B27B27 8787、4 4全身性红斑狼疮全身性红斑狼疮 DR2/DR3DR2/DR35 5、8 81 1型糖尿病型糖尿病 DR3/DR4DR3/DR41010类风湿性关节炎类风湿性关节炎DR4DR44 4、2 2GravesGraves病病DR3DR33 3桥本氏甲状腺炎桥本氏甲状腺炎 DR5DR53 3多发性硬化多发性硬化DR2DR24 4、1 1重症肌无力重症肌无力 DR3DR32 2、5 5HLA HLA 基因与自身免疫病相关性举例基因与自身免疫病相关性举例四、生理因素四、生理因素五、环境因素五、环境因素 1 1、自身免疫病得发病率随年龄增长呈上升趋势自身免疫病得发病率随年龄增长呈上升趋势;2 2、自身免疫病得发病也具有明显得性别差异自身免疫病得发病也具有明显得性别差异,女女性发病率较高性发病率较高 自身免疫病得发生与日晒、潮湿、寒冷等环境因自身免疫病得发生与日晒、潮湿、寒冷等环境因素可能有关。素可能有关。1 1、自身抗体介导细胞破坏自身抗体介导细胞破坏 六、自身免疫病得病理损伤机制六、自身免疫病得病理损伤机制病理机制病理机制:IIII型超敏反应型超敏反应常见疾病常见疾病:新生儿溶贫、重症肌无力、新生儿溶贫、重症肌无力、GravesGraves病病自身免疫性溶血性贫血自身免疫性溶血性贫血重症肌无力重症肌无力 GravesGraves病病3 3、自身反应性自身反应性T T细胞引发炎症性损伤细胞引发炎症性损伤 2 2、循环免疫复合物介导组织损伤循环免疫复合物介导组织损伤 病理机制病理机制:IIIIII型超敏反应型超敏反应病理机制病理机制:IVIV型超敏反应型超敏反应抗核抗体抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)就是以真核细胞得核成分为靶抗原得自身抗体就是以真核细胞得核成分为靶抗原得自身抗体得总称得总称;在某些因素作用下改变细胞核某些成分性在某些因素作用下改变细胞核某些成分性质质,激发机体产生许多抗不同核成分得抗体。激发机体产生许多抗不同核成分得抗体。第三节自身免疫病检验第三节自身免疫病检验一、自身抗体得检测一、自身抗体得检测(一一)抗核抗体检测抗核抗体检测lANA主要就是IgG,也有IgM、IgA、IgD与IgE;lANA无器官特异性与种属特异性;lANA主要存在于血清中;l将检出ANA作为AID存在得依据。抗抗DNA抗体抗体:抗抗dsDNA/抗抗nDNA、抗、抗ssDNA/抗抗dDNA等等 抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体(AHA):抗抗H1、抗、抗H2A、抗、抗H2B、抗抗H3、抗、抗H4抗体等抗体等 抗非组蛋白抗体抗非组蛋白抗体:抗抗nRNP/抗抗U1RNP、抗、抗Scl-70、抗抗SSA、抗、抗Sm、抗、抗SSB、抗、抗Jo-1、抗、抗Rib抗体、抗体、AnuA、抗、抗DNP、抗、抗DM53抗体抗体 抗抗RANA抗体、抗着丝点、抗抗体、抗着丝点、抗Ku抗体等抗体等 抗核仁抗体抗核仁抗体:抗抗PM-Scl抗体、抗抗体、抗Th/To抗体、抗体、抗抗U3-RNP、抗、抗4-6-S-RNA抗体等抗体等1 1、ANA得类型与临床意义得类型与临床意义 ANA谱谱 抗天然抗天然DNA(native DNA,nDNA)抗体抗体,又称抗双链又称抗双链DNA(double stranded DNA,dsDNA)抗体。抗体。抗变性抗变性DNA(denatured DNA,dDNA)抗体抗体,又称抗单链又称抗单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)抗体。抗体。对对SLE有高特异性有高特异性;SLE诊断标准之一诊断标准之一缓解期降低缓解期降低70%90%SLE活动期增高活动期增高药物疗效药物疗效抗抗dsDNA抗体抗体 抗抗DNA抗体抗体 抗组蛋白抗体抗组蛋白抗体(anti-histonic antibody,AHA):由由H1、H2A、H2B、H3与与H4五个亚单位五个亚单位,各自都各自都 有特异性抗体有特异性抗体;AHA检检出出百百分分率率抗抗dsDNAdsDNA507090100药物诱导药物诱导性狼疮只性狼疮只能检出此能检出此SLEAHAAHA抗抗组蛋白组蛋白抗体抗体 可提取性核抗原可提取性核抗原 (extractable nuclear antigen,ENA)就是盐水可提取性核抗原得总称就是盐水可提取性核抗原得总称,就是非组蛋白得就是非组蛋白得核蛋白核蛋白,属酸性核蛋白抗原属酸性核蛋白抗原,由许多小分子量得由许多小分子量得RNARNA与多与多 肽组成。肽组成。抗抗ENA抗体抗体 对类风湿有特异诊断价值得ENA:抗nRNP(nuclear RNP,nRNP)抗体;抗Sm抗体;抗SSA抗体;抗SSB抗体;抗Scl-70抗体;抗Jo-1抗体;抗核糖体抗体。核蛋白核蛋白(DNP)由由DNA与蛋白质组成。与蛋白质组成。DNP抗原有不抗原有不溶性及可溶性两种溶性及可溶性两种,分别产生相应得抗体。分别产生相应得抗体。检出检出百分百分率率抗抗DNP20406080 SLE非活动期非活动期 SLE活动期活动期抗不溶性抗不溶性DNP抗体抗体抗抗DNP抗抗DNP100RA滑滑膜液中膜液中抗抗DNP抗可溶性抗可溶性DNP抗体抗体(1 1)抗抗DNP抗体抗体 抗核小体抗体抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody,AnuA)l核小体就是细胞核染色质得基本组成单位核小体就是细胞核染色质得基本组成单位;l细胞凋亡致核小体大量蓄积细胞凋亡致核小体大量蓄积,并诱导并诱导B细胞产生细胞产生AnuAlAnuA就是就是SLE特异得标志性抗体。特异得标志性抗体。抗抗dsDNA抗体抗体 抗核小体抗体抗核小体抗体 抗抗dsDNA与抗与抗Sm阴性得阴性得SLE阳性阳性率为率为60%80%,特异性特异性97%。(2 2)抗抗核小体核小体抗体抗体 常见常见AID得得ANA阳性检出率阳性检出率疾病疾病ANA(%)疾病疾病ANA(%)SLE9595SS70708080MCTD9595PM/DM3030PSS85859595RA202030302 2、ANA得检测方法得检测方法 l稀释患者血清可做定量检测稀释患者血清可做定量检测,1:80稀释仍呈阳性对诊断稀释仍呈阳性对诊断SLE有较大参考价值。有较大参考价值。(1 1)间接荧光免疫法间接荧光免疫法抗核抗体核型与相关疾病抗核抗体核型与相关疾病核型核型荧光图形荧光图形抗体抗体相关疾病相关疾病周边型周边型核周环状荧光核周环状荧光抗抗dsDNAdsDNASLESLE、慢活肝炎、慢活肝炎均质型均质型核呈均质荧光核呈均质荧光抗抗DNADNA、AHAAHA、AnuAAnuASLESLE、RARA、PSSPSS、慢性、慢性肝病肝病斑点型斑点型核内颗粒状荧光核内颗粒状荧光抗抗ENAENAMCTDMCTD、SLESLE、PSSPSS、SSSS、PMPM核仁型核仁型核仁有荧光核仁有荧光抗核仁抗体抗核仁抗体PSSPSS、雷诺现象、雷诺现象、SLESLE着丝点型着丝点型核浆细小相同颗粒核浆细小相同颗粒荧光荧光抗着丝点抗着丝点PSSPSS、CRESTCREST综合征综合征均质型均质型抗核抗体核型抗核抗体核型着丝点型着丝点型核仁型核仁型斑点型斑点型 用间接ELISA检测抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体与抗核小体抗体。(2)ELISA法法SDS-PAGE加待检血清加待检血清形成分子大小不同区带形成分子大小不同区带 分离分离电转移电转移PVDF膜或膜或NC膜膜抗抗ENA与相应抗原特异结合与相应抗原特异结合抗人抗人IgGHRPENA抗抗ENA抗人抗人IgGHRP(3)免疫印迹法免疫印迹法显色并判读结果显色并判读结果l 类风湿因子类风湿因子(rheumatoid factor,RF):抗变性抗变性IgG得自身抗体得自身抗体,可为可为19S得得IgM,也可为也可为7S得得IgG与与IgA。可与人变性可与人变性IgG结合结合,但不与正常但不与正常IgG发生凝集。发生凝集。RF可在可在RA患者检出患者检出,约约70%70%90%90%得血清、约得血清、约60%60%得得滑膜液可检出滑膜液可检出IgG类得类得RF;(二二)类风湿因子测定类风湿因子测定l IgG类抗体与相应抗原结合后发生变性类抗体与相应抗原结合后发生变性;l炎症过程亦可发生炎症过程亦可发生IgG变性变性,构成自身抗原构成自身抗原,刺激刺激机体产生各种抗机体产生各种抗IgG抗体抗体;l滑膜液中得滑膜液中得IgG类类RF与变性与变性IgG结合可形成中等结合可形成中等大小得免疫复合物大小得免疫复合物,相比血清中得相比血清中得IgM类类RF更易更易致病。致病。RF检测方法检测方法 最常采用得检测方法。最常采用得检测方法。以吸附在聚苯乙烯胶乳颗粒上得以吸附在聚苯乙烯胶乳颗粒上得IgG作诊作诊断试剂断试剂,与待检血清中得与待检血清中得RF结合后结合后,出现胶乳出现胶乳凝集颗粒。此法得灵敏度与特异性不高凝集颗粒。此法得灵敏度与特异性不高,且只且只能检出血清中得能检出血清中得IgM类得类得RF。1、间接胶乳凝集试验间接胶乳凝集试验 稀释待检血清至一定浓度后稀释待检血清至一定浓度后,加入定量得变加入定量得变性性IgG诊断试剂诊断试剂,即用透射比浊或速率散射比浊即用透射比浊或速率散射比浊仪仪,检测血清中得检测血清中得RF。此法快速、敏感性高、精。此法快速、敏感性高、精密度高、稳定性好、可定量分析密度高、稳定性好、可定量分析,但仍只能检测但仍只能检测IgM类类RF。2、免疫比浊法免疫比浊法 IgM、IgG与与IgA类类RF可可用用ELISA检测检测,临临床上多采用双抗原夹心法或间接床上多采用双抗原夹心法或间接ELISA进行测进行测定。定。3、ELISA法法(三三)其她自身抗体测定其她自身抗体测定其她自身抗体得检测方法与临床意义其她自身抗体得检测方法与临床意义自身抗体得类型自身抗体得类型检测方法检测方法临床意义临床意义抗甲状腺球蛋白抗体抗甲状腺球蛋白抗体(A-TG)荧光免疫法、荧光免疫法、ELISA、RIA桥本甲状腺炎桥本甲状腺炎抗甲状腺过氧化物酶抗体抗甲状腺过氧化物酶抗体ELISAGraves 病病,桥本甲状腺炎桥本甲状腺炎抗乙酰胆碱受体抗体抗乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)ELISA、RIA重症肌无力重症肌无力抗平滑肌抗体抗平滑肌抗体(SMA)荧光免疫法、荧光免疫法、ELISA、RIA自身免疫性肝炎自身免疫性肝炎,慢性活动性肝炎慢性活动性肝炎,原发性胆汁性肝硬化原发性胆汁性肝硬化抗线粒体抗体抗线粒体抗体(AMA)荧光免疫法、荧光免疫法、ELISA、RIARA,SS,SLE,原发性胆汁性肝硬化原发性胆汁性肝硬化,慢性活动性肝炎慢性活动性肝炎,持续性肝阻塞持续性肝阻塞抗胃壁细胞抗体抗胃壁细胞抗体荧光免疫法荧光免疫法恶性贫血恶性贫血抗胰岛素抗体抗胰岛素抗体(IAA)ELISA胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病抗精子抗体抗精子抗体(AsAb)ELISA、荧光免疫法、荧光免疫法不育症不育症,不孕症不孕症抗红细胞抗体抗红细胞抗体直接凝集试验、直接凝集试验、Coombs试验试验新生儿溶血新生儿溶血,自身免疫性溶血性贫血自身免疫性溶血性贫血抗血小板抗体抗血小板抗体ELISA法、法、ABC-ELISA法法原发性血小板减少性紫癜、输血史原发性血小板减少性紫癜、输血史抗心磷脂抗体抗心磷脂抗体(ACA)RIA、ELISASLE,血栓血栓,自发性流产自发性流产,血小板减少血小板减少抗肾小球基底膜抗体抗肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)荧光免疫法荧光免疫法Goodpasture综合征综合征,狼疮肾炎狼疮肾炎二、细胞检查二、细胞检查(一一)淋巴细胞检测淋巴细胞检测1 1、特异性致敏淋巴细胞、特异性致敏淋巴细胞2 2、淋巴细胞数量与比例、淋巴细胞数量与比例如淋巴细胞转化试验或吞噬细胞移动抑制试验如淋巴细胞转化试验或吞噬细胞移动抑制试验检测淋巴细胞得总数、检测淋巴细胞得总数、T T、B B细胞分类与计数、细胞分类与计数、CD4/CD8CD4/CD8亚群比例等进行亚群比例等进行(二二)狼疮狼疮(lupus erythmatosuslupus erythmatosus,LELE)细胞试细胞试验验 LELE细细胞胞为为胞胞浆浆内内含含有有大大块块状状聚聚合合DNADNA得得中中性性粒粒细细胞。胞。有有75758080得得SLESLE病病人人LELE呈呈阳阳性性,RARA、结结节节性性动动脉脉炎炎、多多发发性性硬硬化化症症、硬硬皮皮病病、部部分分肝肝炎炎、皮皮肌肌炎与变态反应病等偶尔亦可呈阳性反应。炎与变态反应病等偶尔亦可呈阳性反应。三、免疫复合物与补体检测三、免疫复合物与补体检测四、细胞因子检测四、细胞因子检测 1 1、CKCK在自身免疫病得免疫病理损伤中有重要作用。在自身免疫病得免疫病理损伤中有重要作用。2 2、检测检测CKCK,对研究疾病得发生机制、了解病情、指对研究疾病得发生机制、了解病情、指导治疗均有意义。导治疗均有意义。对诊断部分自身免疫病与判断疾病得活动情对诊断部分自身免疫病与判断疾病得活动情况有一定得意义。况有一定得意义。1 1、筛选试验与确诊性试验得合理组合。筛选试验与确诊性试验得合理组合。2 2、结合临床症状选择性检测相关得自身抗体。结合临床症状选择性检测相关得自身抗体。3 3、切忌盲目得全面检测自身抗体。切忌盲目得全面检测自身抗体。4 4、通常以抗核抗体作为筛选试验通常以抗核抗体作为筛选试验,ANA在许多在许多AID中中 可呈阳性。可呈阳性。5 5、ANA阳性时阳性时,再进行针对特异性靶抗原成分得自身再进行针对特异性靶抗原成分得自身 抗体得检测抗体得检测,达到明确诊断得目得。达到明确诊断得目得。第四节第四节 自身抗体得检测实验选择得原则自身抗体得检测实验选择得原则 一、自身抗体检测得一般原则一、自身抗体检测得一般原则二、实验室方法得选择及结果得确认二、实验室方法得选择及结果得确认IIF法法筛选试验筛选试验 ANA抗抗dsDNAIB法法ELISA法法IFA法法特异性实验特异性实验抗原基质片抗原基质片(如如Hep-2Hep-2、小、小鼠肝印片鼠肝印片/切片切片),加入自加入自身抗体后与抗原相结合身抗体后与抗原相结合,再与荧光标记得抗抗体结再与荧光标记得抗抗体结合合,根据细胞得荧光着色根据细胞得荧光着色进行定性、定位分析。进行定性、定位分析。以特异性纯化抗原包被以特异性纯化抗原包被载体载体,检测特异性自身检测特异性自身抗体抗体;但特异性抗原不但特异性抗原不易纯化或不明确易纯化或不明确,用用ELISA与与IBT等检测自等检测自身抗体存在一定误差。身抗体存在一定误差。小小 结结 自身免疫病就是由于某种原因使自身免疫应答自身免疫病就是由于某种原因使自身免疫应答过强或持续时间过久过强或持续时间过久,表现为质与量得异常表现为质与量得异常,所产所产生得自身抗体与生得自身抗体与(或或)自身致敏淋巴细胞对表达自自身致敏淋巴细胞对表达自身靶抗原得细胞与组织发动攻击身靶抗原得细胞与组织发动攻击,导致损伤或功能导致损伤或功能障碍障碍,并出现相应临床症状。并出现相应临床症状。