DB34∕T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法(安徽省).pdf

ICS 65.020.99 B 21 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 33072018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR 法 Protocol for molecular marker assisted-selection of rice blast resistance gene Pi1 and Pi2 PCR method 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 33072018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。 本标准起草单位： 安徽省种子质量监督检验站、 合肥丰乐种业股份有限公司、 安徽省种子管理总站、安徽出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、张文晓、周锐、周贤达、曹玉洁、范家萌、徐丽媛、周红英、王凤杰、胡娜、宗凯、张奇、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。 DB34/T 33072018 1 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因 Pi1 和 Pi2 的 PCR 检测方法。 本标准适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种，以及水稻品种中稻瘟病抗源基因的分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：base pair，碱基对 CTAB：cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 dNTPs：deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamide gelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 SSR：simple sequence repeat，简单序列重复 Taq 酶：Taq-DNA polymerase，耐热 DNA 聚合酶 ddH2O：双蒸水（超纯水） 4 原理 根据水稻抗稻瘟病基因 Pi1、Pi2 在染色体上的位置和保守区序列， 分别筛选两套特异性检测引物，包括适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种和水稻品种中稻瘟病抗源基因初步鉴定的、 与抗稻瘟病基因 Pi1和 Pi2 紧密连锁的分子标记，以及适用于对连锁标记检测结果进行验证和水稻品种中稻瘟病抗源基因精确鉴定的、 位于抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 序列内的特异性检测标记。 提取不同水稻品种或育种群体的 DNA，利用筛选的特异性检测引物对样品 DNA 进行 PCR 扩增，依据是否扩增获得预期大小的 DNA片段来判断样品是否携带该抗稻瘟病基因及其等位基因型。 5 仪器设备 DB34/T 33072018 2 高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30100）、核酸蛋白测定仪、组织研磨仪、PCR 扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2 L、10 L、100 L、1000 L）。 6 试剂和溶液配制 所用试剂均为分析纯，试剂配制的用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求。 6.1 试剂 6.1.1 DNA 提取试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。 6.1.2 PCR 扩增试剂 引物、DNA、dNTPs、Taq 酶、10Buffer 缓冲液、ddH2O、和 Mg2+ 或者 Mix 反应混合液。 6.1.3 PAGE 电泳试剂 去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青 FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。 6.2 溶液配制 见附录A。 7 实验步骤 7.1 DNA 提取 7.1.1 CTAB 法 取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约 200300 mg 置于 2.0 mL 离心管，充分研磨；每管加入700 L 经 65预热的 CTAB 提取液，充分混合，65水浴 30 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置 10 min；10000 g 离心 10 min，吸取上清液 300 L 转移至一新管，加入 600 L 预冷 95乙醇，颠倒混匀，-20冷冻 30 min；10000 g 离心 10 min，弃上清液，用 70乙醇溶液洗涤 2 遍；室温自然晾干后，加入超纯水或 TE 缓冲液 400 L，充分溶解；检测浓度后备用。 7.1.2 碱煮法 将种子发芽至幼苗长度达到 3 cm 左右时剪取 0.5 cm 长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取 0.5 cm0.5 cm 大小，放入 96 孔深孔板中。每孔加入 40 L 氢氧化钠提取液，沸水加热 1 min，然后加入 60 L TE 缓冲液，沸水加热 2 min。放在 4冰箱备用。 7.2 PCR 扩增 7.2.1 筛选引物 DB34/T 33072018 3 本标准针对抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 分别筛选出两对检测引物（见表1），包括与抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 紧密连锁的分子标记 P1-1 和 P2-1， 适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种和水稻品种中稻瘟病抗源基因的初步鉴定； 以及位于抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 序列内的特异性检测标记 P1-2 和 P2-2，适用于水稻品种中稻瘟病抗源基因的精确鉴定，或对引物 P1-1 和 P2-1 的鉴定结果进行验证。 表1 检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的引物序列和扩增产物片段大小 基因名称 引物编号 引物序列 抗性基因扩增产物片段大小 （bp） Pi1 P1-1 F: ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC 94 R: AAGTGGAGGCAGTTCACCAC P1-2 F:GTGCTGCTGTGGCTA GTTTG 460 R: AGTCCCCGCTCAATTTTTCT Pi2 P2-1 F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA 143 R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC P2-2 F:TGATTATGTTTTTTATGTGGGG 111 R: ATTAGTGAGATCCATTGTTCC 7.2.2 连锁标记两重 PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量， 可以依据试验条件不同作相应调整。 缓冲液若含有 MgCl2，不再加 MgCl2 溶液，加等体积无菌水替代。 7.2.3 特异标记 PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量， 可以依据试验条件不同作相应调整。 缓冲液若含有 MgCl2，不再加 MgCl2 溶液，加等体积无菌水替代。 7.2.4 PCR 反应程序 预变性：94 4 min； 扩增：94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 45 s，进行 32 次循环； 终延伸：72 5 min。 扩增产物加入 2 L 上样指示剂后于 4保存。 7.3 扩增产物 PAGE 电泳检测 7.3.1 凝胶制备 沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，晾干后用 95乙醇擦洗两遍；将 1 mL 亲和硅烷工作液均匀涂在无凹槽的玻璃板上，两侧对齐放置塑料边条，将 1 mL 剥离硅烷均匀涂在带凹槽的玻璃板上，涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称夹上夹子；将 65 mL 4聚丙酰胺凝胶（现配现用）缓慢注入两玻璃板之间，灌胶过程应防止气泡的出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳，在室温下聚合 1 h 以上。 7.3.2 电泳 拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽注入 0.5TBE 缓冲液， 并使其没过凹槽玻璃板。 用移液器吹掉加样孔内的气泡和杂质， 插入 100 孔样品梳 （鲨鱼齿朝下） 。DB34/T 33072018 4 针对连锁标记两重 PCR 扩增产物的检测，若样本量大（多于 96 个样品），进行两道电泳，即每一个加样孔点入 3 L 扩增产物，点样 96 个（包括两个对照样品），2000 V，85 W 电泳约 10 min 后，断开电源，第二次点样 96 个（包括两个对照样品），2000 V，85 W 电泳 25 min 左右，停止电泳，一次性可检测 962=192 个不同样品（含 22=4 个对照样品）的抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 的等位基因型。若样本量小（不足 96 个样品），进行单道电泳，即每一个加样孔点入 3 L 扩增产物，点样 96 个以下（包括两个对照样品），2000 V，85 W 电泳约 25 min 左右，停止电泳；针对特异标记 PCR 扩增产物的检测，进行单道电泳，即 2000 V，85 W 电泳 50 min 左右，停止电泳。电泳结束后关闭电源，取下玻璃板。 7.3.3 银染显色 将附着凝胶的玻璃板（无凹槽玻璃板）胶面朝上在清水中漂洗不超过 15 秒；先放入染色液中染色8 分钟后取出，在清水中漂洗不超过 15 秒；再放入显影液中显影至 DNA 谱带清晰（约 5 分钟）后取出，在清水中漂洗 1 分钟左右；最后取出胶板，晾干，放在胶片观察灯下观察，记录结果，拍照保存（参见附录B）。 7.4 数据记录 通过电泳后呈现的特异谱带，参照对照样品，识别、记录检测样品每个引物位点的等位基因型。 8 结果分析 8.1 判定原则 鉴定育种群体或水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因 Pi1 或 Pi2 时， 如不能扩增出与阳性对照相同长度的 PCR 扩增产物，则可判断检测样品中不含有相应的抗稻瘟病基因；如可扩增出与阳性对照相同长度的 PCR 产物，则可判断检测样品中含有相应的抗稻瘟病基因。 8.2 连锁标记检测结果分析 用引物 P1-1 或 P2-1 扩增对照品种和待检样品（分子标记辅助育种群体或品种资源），其扩增产物电泳谱带与含有抗稻瘟病基因 Pi1 或 Pi2 的阳性对照相同时，基因型记为 Pi1/Pi2 纯合导入，与阴性对照相同时，基因型记为 Pi-1/Pi-2 无导入，同时具有阳性对照与阴性对照两条谱带时，基因型记为 Pi1/Pi2 杂合导入。 8.3 特异标记检测结果分析 用引物 P1-2 或 P2-2 扩增对照品种和待检样品。用 P1-2 扩增出 460 bp 特异性条带的样品，证明含有 Pi1 抗性基因；无扩增产物的，证明不含 Pi1 抗性基因。用 P2-2 扩增出 111 bp 特异性条带的样品，证明含有 Pi2 抗性基因；扩增出不同片段长度产物的，证明不含 Pi2 抗性基因。 8.4 连锁标记与特异标记检测结果差异性分析 当连锁标记检测结果与特异标记检测结果有差异时，以特异检测标记检测结果作为判定依据。 DB34/T 33072018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA 提取试剂 A.1.1 0.5 mol/L EDTA 溶液 乙二胺四乙酸二钠 93.5 g 溶于 400 mL 蒸馏水中，调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。 A.1.2 1 mol/L Tris-HCl 溶液 三羟甲基氨基甲烷 60.55 g 溶于 400 mL 蒸馏水中，调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL，高压灭菌。 A.1.3 1.5CTAB 提取液 十六烷基三甲基溴化铵 15 g、氯化钠 61.4 g、1 mol/L Tris-HCl 溶液 75 mL 和 0.5 mol/L EDTA溶液 30 mL，加水溶解、定容至 1000 mL，室温贮存。 A.1.4 0.2 mol/L NaOH 提取液 固体氢氧化钠 4 g，加水定容至 500 mL。 A.1.5 TE 缓冲液 1（DNA 溶解） 1 mol/L Tris-HCl溶液 5 mL 和 0.5 mol/L EDTA 溶液 1 mL，调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL。 A.1.6 TE 缓冲液 2（碱煮法 DNA 提取） 1 mol/L Tris-HCl 溶液 50 mL、盐酸 4 ml，加水定容至 300 mL。 A.2 PCR 扩增试剂 A.2.1 SSR引物 用 TE 缓冲液 1（或超纯水）分别配制正向引物、反向引物终浓度均为 100 mol/L 的储存液，左右引物储存液与 TE 缓冲液 1（或超纯水）按 1:1:18 体积混合，稀释成 5 mol/L 的工作液。 A.2.2 6加样缓冲液 去离子甲酰胺 100 mL、0.5 mol/L EDTA 溶液 2 mL、溴酚兰 0.25 g 和二甲苯青 0.25 g 混合。 A.3 电泳试剂 A.3.1 40PAGE 胶 DB34/T 33072018 6 丙烯酰胺 190 g 和甲叉双丙烯酰胺 10 g，加水定容至 500 mL。 A.3.2 4PAGE 胶 尿素 400 g、5TBE 缓冲液 150 mL 和 40PAGE 胶 110 mL，加水定容至 1000 mL。 A.3.3 亲和硅烷工作液 95乙醇 199 mL，冰乙酸 1 mL，亲和硅烷 6 mL 混合。 A.3.4 10过硫酸铵溶液 10 g 过硫酸铵溶于 100 mL 蒸馏水中。 A.3.5 5TBE 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 54 g、硼酸 27.5 g 和 0.5 mol/L EDTA 溶液 20 mL，加水定容至 1000 mL。 A.3.6 0.5TBE 缓冲液 5TBE 缓冲液 500 mL，加水定容至 5000 mL。 A.4 银染试剂 A.4.1 染色液 硝酸银 2 g，加水定容至 2000 mL。 A.4.2 显影液 氢氧化钠 40 g 和甲醛 10 mL，加水定容至 2000 mL。 DB34/T 33072018 7 B B 附 录 B （资料性附录） PCR 反应体系和 PAGE 电泳图 B.1 连锁标记两重 PCR 反应体系（总体积 10 L） 见表B.1。 表B.1 反应组分 原 浓 度 终 浓 度 体 积 ， L ddH2O 4.1 10Buffer 10 1 1 MgCl2 25 mmol/L 2.5 mmol/L 1 dNTP 2.5 mmol/L 0.2 mmol/L 0.8 Taq酶 5 U/L 0.5 U 0.1 P1-1引 物 5 mol/L 0.25 mol/L 0.5 P2-1引 物 5 mol/L 0.25 mol/L 0.5 DNA 25 ng/L 5 ng/L 2 B.2 特异标记 PCR 反应体系（总体积 10 L） 见表B.2。 表B.2 反应组分 原 浓 度 终 浓 度 体 积 ， L ddH2O 4.6 10Buffer 10 1 1 MgCl2 25 mmol/L 2.5 mmol/L 1 dNTP 2.5 mmol/L 0.2 mmol/L 0.8 Taq酶 5 U/L 0.5 U 0.1 P1-2或 P2-2引 物 5 mol/L 0.25 mol/L 0.5 DNA 25 ng/L 5 ng/L 2 B.3 PAGE 电泳图示例 见图B.1。 DB34/T 33072018 8 图B.1 _