DB34∕T 3308-2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法(安徽省).pdf

ICS 65.020.99 B 05 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 33082018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法 Protocol for purity detection of two-line hybrid seeds-molecular marker method 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 33082018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。 本标准起草单位： 安徽省种子质量监督检验站、 合肥丰乐种业股份有限公司、 安徽省种子管理总站、安徽出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、曹玉洁、周贤达、张文晓、范家萌、周锐、周红英、宗凯、张奇、徐丽媛、王凤杰、胡娜、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。 DB34/T 33082018 1 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法 1 范围 本标准规定了两系杂交水稻种子纯度分子标记检测的原理、实验步骤、结果分析和报告。 本标准适用于两系杂交水稻种子纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1433 水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：base pair，碱基对 CTAB：cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 dNTPs：deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamide gelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 SSR：simple sequence repeat，简单序列重复 Taq 酶：Taq-DNA polymerase，耐热 DNA 聚合酶 ddH2O：双蒸水（超纯水） 4 原理 我国生产上两系水稻的不育基因主要为温敏核不育基因 tms5， 其次为光敏核不育基因 pms1、 pms3，根据其对应的特征标记在品种中的等位基因型，可判断该品种是否为两系杂交水稻或不育系。同时，水稻的不同品种， 其基因组存在着能够世代稳定遗传的重复次数不同的简单重复序列(SSR)， 且 SSR 标记具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不同品种筛选其区别于其它品种的特征 SSR标记，通过 SSR 多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征 SSR 标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或百分率，从而对整体样品的一致程度作出评价。 DB34/T 33082018 2 5 仪器设备 高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30100）、核酸蛋白测定仪、组织研磨仪、PCR 扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2 L、10 L、100 L、1000 L）。 6 试剂和溶液配制 所用试剂均为分析纯，试剂配制用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求。 6.1 试剂 6.1.1 DNA 提取 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。 6.1.2 PCR 扩增 引物、DNA、dNTPs、Taq 酶、10Buffer 缓冲液、ddH2O、和 Mg2+ 或者 Mix 反应混合液。 6.1.3 PAGE 电泳 去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青 FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。 6.2 溶液配制 见附录A。 7 实验步骤 7.1 取样 从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体独立检测。试样的抽取应有代表性，符合 GB/T 3543.2 的规定。 试样的检测应设置重复，重复的次数以达到 GB/T 3543.5 规定的容许误差范围内为止，每次重复的数量应至少含有 90 粒种子。 7.2 DNA 提取 7.2.1 CTAB 法 取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约 200300 mg 置于 2.0 mL 离心管，充分研磨；每管加入700 L 经 65预热的 CTAB 提取液，充分混合，65水浴 30 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置 10 min；10000 g 离心 10 min，吸取上清液 300 L 转移至一新管，加入 600 L 预冷 95乙醇，颠倒混匀，-20冷冻 30 min；10000 g 离心 10 min，弃上清液，用 70乙醇溶液洗涤 2 遍；室温自然晾干后，加入超纯水或 TE 缓冲液 400 L，充分溶解；检测浓度后备用。 DB34/T 33082018 3 7.2.2 碱煮法 将种子发芽至幼苗长度达到 3 cm 左右时剪取 0.5 cm 长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取 0.5 cm0.5 cm 大小，放入 96 孔深孔板中。每孔加入 40 L 氢氧化钠提取液，沸水加热 1 min，然后加入 60 L TE 缓冲液，沸水加热 2 min。放在 4冰箱备用。 7.3 PCR 扩增 7.3.1 DNA 样品 在两个 96 孔 PCR 扩增板中分别加入待检样品的 94 个单样 DNA 和两个对照样品的 DNA， 对照样品分别为父、母本的 DNA 各 1 个或标准样品的 DNA 2 个。 7.3.2 引物 每个两系杂交水稻品种至少筛选 2 对引物进行纯度鉴定，包括针对该品种不育基因类型（tms5/pms3/pms1）的 1 对特征引物（见表1），以及根据 NY/T 1433 中 48 对引物筛选出的品种鉴别力强且在父母间具有多态性的 1 对以上特征 SSR 引物（见表2），并综合 2 对以上引物的检测结果判定异品种类型（自交、异交、混杂）。 表1 检测两系不育基因的特征引物序列及等位基因型 不育基因 检测 引物 引物编号引物序列 等位基因型 tms5 tms5-1 A1 F: ATGGCCTCGTCGAGTTCTAA 含有 tms5 基因的品种较不含 tms5 基因的品种扩增产物片段小。 R: CGGTCAGCTGAATTTCTCTGT pms3 pms3-1 A2 F:AGGCATGGTGAAGCAAAGAAGTG 含有 pms3 基因的品种较不含 pms3 基因的品种扩增产物片段小。 R: TGAAGCGGCGGCTCCGTTAT M:GAAGCAAAGAAATGCATTGTTTGTG pms1 pms1-1 A3 F: AGGCGCAGTAAAAACACCTG 含有 pms1 基因的品种较不含 pms1 基因的品种扩增产物片段大。 R: CTTGCGTGGTTTCAAGGG 表2 特征 SSR 引物序列 引物编号 引物名称 引物序列 B1 RM336 F:CTTACAGAGAAACGGCATCG R:GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG B2 RM481 F:TAGCTAGCCGATTGAATGGC R:CTCCACCTCCTATGTTGTTG B3 RM258 F:TGCTGTATGTAGCTCGCACC R:TGGCCTTTAAAGCTGTCGC B4 RM224 F:ATCGATCGATCTTCACGAGG R:TGCTATAAAAGGCATTCGGG B5 RM8277 F:AGCACAAGTAGGTGCATTTC R:ATTTGCCTGTGATGTAATAGC B6 OSR28 F:AGCAGCTATAGCTTAGCTGG R:ACTGCACATGAGCAGAGACA DB34/T 33082018 4 表 2（续） 引物编号 引物名称 引物序列 B7 RM21 F:ACAGTATTCCGTAGGCACGG R:GCTCCATGAGGGTGGTAGAG B8 RM424 F:TTTGTGGCTCACCAGTTGAG R:TGGCGCATTCATGTCATC 7.3.3 PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量， 可以依据试验条件不同作相应调整。 缓冲液若含有 MgCl2，不再加 MgCl2 溶液，加等体积无菌水替代。 7.3.4 PCR 反应程序 预变性：94 4 min； 扩增：94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 45 s，进行 32 次循环； 终延伸：72 5 min。 扩增产物加入 2 L 上样指示剂后于 4保存。 7.4 扩增产物 PAGE 电泳检测 扩增产物基因型可用 PAGE 电泳或毛细管电泳检测， 毛细管电泳检测方法参照相应毛细管电泳仪的操作规程，本标准宜使用 100 孔垂直电泳槽进行 PAGE 电泳检测的方法。 7.4.1 凝胶制备 沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，晾干后用 95乙醇擦洗两遍；将 1 mL 亲和硅烷工作液均匀涂在无凹槽的玻璃板上，两侧对齐放置塑料边条，将 1 mL 剥离硅烷均匀涂在带凹槽的玻璃板上，涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称夹上夹子；将 65 mL 4聚丙酰胺凝胶（现配现用）缓慢注入两玻璃板之间，灌胶过程应防止气泡的出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳，在室温下聚合 1 h 以上。 7.4.2 电泳 拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽注入 0.5TBE 缓冲液， 并使其没过凹槽玻璃板。 用移液器吹掉加样孔内的气泡和杂质， 插入 100 孔样品梳 （鲨鱼齿朝下） ，电泳两道，即每一个加样孔点入 3 L 扩增产物，点样 96 个（包括两个对照样品），2000 V，85 W 电泳约 10 min 后，断开电源，第二次点样 96 个（包括两个对照样品），2000 V，85 W 电泳 25 min 左右，停止电泳，一次性可检测 962=192 个不同样品（含 22=4 个对照样品）的等位基因型。电泳结束后关闭电源，取下玻璃板。 7.4.3 银染显色 将附着凝胶的玻璃板（无凹槽玻璃板）胶面朝上在清水中漂洗不超过 15 秒；先放入染色液中染色8 分钟后取出，在清水中漂洗不超过 15 秒；再放入显影液中显影至 DNA 谱带清晰（约 5 分钟）后取出，在清水中漂洗 1 分钟左右；最后取出胶板，晾干，放在胶片观察灯下观察，记录结果，拍照保存（参见附录B）。 7.5 数据记录 DB34/T 33082018 5 通过电泳后呈现的特异谱带，参照对照样品，识别、记录检测样品每个引物位点的等位基因型。 8 结果分析 8.1 结果计算 鉴定结果使用正常个体数目（检测试样总数减去异品种数目）占检测试样总数的百分率表示。 8.2 容许差距 检测结果的容许差距应符合 GB/T 3543.5 的要求。对于在容许差距范围内且提出有异议的样品，可参照 GB/T 3543.5 的规定进行田间小区种植鉴定。 8.3 结果报告 8.3.1 检验报告 按照 GB/T 3543.1 的检验报告要求，可以选择下列方式之一进行品种纯度检测结果的填报： a) 通过编号为 的引物，检测 个个体，采用 PAGE 电泳方法，检测出杂株 个。 b) 通过编号为 的引物，检测 个个体，采用 PAGE 电泳方法，检测出杂株 个，品种纯度为 。 DB34/T 33082018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA提取试剂 A.1.1 0.5 mol/L EDTA 溶液 乙二胺四乙酸二钠 93.5 g 溶于 400 mL 蒸馏水中，调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。 A.1.2 1 mol/L Tris-HCl 溶液 三羟甲基氨基甲烷 60.55 g 溶于 400 mL 蒸馏水中，调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL，高压灭菌。 A.1.3 1.5CTAB 提取液 十六烷基三甲基溴化铵 15 g、氯化钠 61.4 g、1 mol/L Tris-HCl 溶液 75 mL 和 0.5 mol/L EDTA溶液 30 mL，加水溶解、定容至 1000 mL，室温贮存。 A.1.4 0.2 mol/L NaOH 提取液 固体氢氧化钠 4 g，加水定容至 500 mL。 A.1.5 TE缓冲液 1（DNA 溶解） 1 mol/L Tris-HCl 溶液 5 mL 和 0.5 mol/L EDTA 溶液 1 mL，调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL。 A.1.6 TE缓冲液 2（碱煮法 DNA 提取） 1 mol/L Tris-HCl 溶液 50 mL、盐酸 4 ml，加水定容至 300 mL。 A.2 PCR 扩增试剂 A.2.1 SSR 引物 用 TE 缓冲液 1（或超纯水）分别配制正向引物、反向引物终浓度均为 100 mol/L 的储存液，左右引物储存液与 TE 缓冲液 1（或超纯水）按 1:1:18 体积混合，稀释成 5 mol/L 的工作液。 A.2.2 6加样缓冲液 去离子甲酰胺 100 mL、0.5 mol/L EDTA 溶液 2 mL、溴酚兰 0.25 g 和二甲苯青 0.25 g 混合。 A.3 电泳试剂 A.3.1 40PAGE胶 DB34/T 33082018 7 丙烯酰胺 190 g 和甲叉双丙烯酰胺 10 g，加水定容至 500 mL。 A.3.2 4PAGE胶 尿素 400 g、5TBE 缓冲液 150 mL 和 40PAGE 胶 110 mL，加水定容至 1000 mL。 A.3.3 亲和硅烷工作液 95乙醇 199 mL，冰乙酸 1 mL，亲和硅烷 6 mL 混合。 A.3.4 10过硫酸铵溶液 10 g 过硫酸铵溶于 100 mL 蒸馏水中。 A.3.5 5TBE缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 54 g、硼酸 27.5 g 和 0.5 mol/L EDTA 溶液 20 mL，加水定容至 1000 mL。 A.3.6 0.5TBE缓冲液 5TBE 缓冲液 500 mL，加水定容至 5000 mL。 A.4 银染试剂 A.4.1 染色液 硝酸银 2 g，加水定容至 2000 mL。 A.4.2 显影液 氢氧化钠 40 g 和甲醛 10 mL，加水定容至 2000 mL。 DB34/T 33082018 8 B B 附 录 B （资料性附录） PCR 反应体系和 PAGE 电泳图 B.1 PCR 反应体系（总体积 10 L） 见表B.1。 表B.1 反应组分 溶液原浓度 体积 （L） 反应体系终浓度 ddH2O 4.5 10缓冲液 10 1 1 MgCl2 25 mmol/L 0.6 2.5 mmol/L dNTP 2.5 mmol/L 0.8 0.2 mmol/L Taq 酶 5 U/L 0.1 0.5 U 引物（F） 5 mol/L 0.5 0.25 mol/L 引物（R） 5 mol/L 0.5 0.25 mol/L DNA 25 ng/L 2 5 ng/L 注：检测 pms3 光温敏核不育基因时，加入左引物（F）0.1 L，中间引物（M）0.8 L，右引物（R）0.8 L，ddH2O 3.8 L，其它组分体积不变。 B.2 PAGE电泳图示例 见图B.1。 图B.1 _