DB14∕T 630-2015 （代替 DB14∕T 630-2011）马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育技术规程.PDF

ICS65.020.20B 21DB14山西省地方标准DB 14/T 6302015代替 DB14/T 630-2011马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育技术规程2015 - 11 - 30 发布2015 - 12 - 30 实施山西省质量技术监督局发 布DB14/T 6302015I目次前言. II1范围. 12规范性引用文件.13术语、定义和缩略语.14生产设施、仪器设备、试剂和培养基.25MS 培养基和植物生长调节剂母液配制.36脱毒技术.47脱毒试管苗扩繁.68试管薯诱导.7DB14/T 6302015II前言本标准按GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准代替DB 14/T 6302011马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育技术规程，与DB 14/T 6302011相比差异如下：增加了脱毒核心试管苗、脱毒基础试管苗的定义，修改了脱毒试管苗的定义。增加了风淋室、臭氧消毒机等设施及仪器设备。增加了臭氧环境净化内容，并对6.5内容进行了调整。修改了病毒检测方法、种性鉴定方法、污染苗处理方法。本标准由山西省农业厅提出并归口。本标准起草单位：山西省薯类脱毒中心、山西省农业科学院高寒区作物研究所、山西汾水源薯业科技有限公司。本标准主要起草人：姬青云、杜珍、王拴福、田肉虎、穆艳娥、姚鹏、齐海英、柴生武、杜培兵、邓利爱、张东红、石维山、冀晓慧。本标准2011年12月首次发布，本次为第一次修订。DB14/T 63020151马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育技术规程1范围本标准规定了马铃薯脱毒试管苗（薯）繁育的术语、定义和缩略语，生产设施、仪器设备、试剂和培养基，MS 培养基和植物生长调节剂母液的配制，脱毒技术，试管苗扩繁和试管薯诱导等内容。本标准适用于山西省马铃薯脱毒试管苗（薯）的繁育。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 7331马铃薯种薯产地检疫规程GB 18133马铃薯种薯GB 20464农作物种子标签通则GB/T 28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记NY/T 401脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程NY/T 1962马铃薯纺锤块茎类病毒检测NY/T 1963马铃薯品种鉴定NY/T 2678马铃薯 6 种病毒的检测 RTPCRNY/T 2744马铃薯纺锤块茎类病毒检测技术 核酸斑点杂交法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1试管苗plantlet应用植物组织培养技术在封闭容器内繁殖的种苗。3.2脱毒核心试管苗core plantlet应用茎尖分生组织培养技术获得的，不带 PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV 和 PSTVd，经鉴定具有原品种特征特性的试管苗。3.3脱毒基础试管苗basic plantlet由脱毒核心试管苗繁殖的、用于保存和大量扩繁的无病毒试管苗。DB14/T 630201523.4脱毒试管苗in-vitro Virus free plantlet由脱毒基础试管苗大量扩繁的、用于繁育试管薯和原原种的无病毒试管苗。3.5脱毒试管薯Microtuber无菌条件下，在封闭培养容器内用脱毒试管苗诱导形成的小块茎。3.6原原种pre-elite用脱毒试管苗或脱毒试管薯在防虫网室（棚）等严格隔离条件下，采用无土栽培技术生产的、经质量检测达到GB 18133相应要求，用于原种生产的微型薯。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PVX：马铃薯X病毒（Potato virus X）PVY：马铃薯Y病毒（Potato virus Y）PVS：马铃薯S病毒（Potato virus S）PVM：马铃薯M病毒（Potato virus M）PVA：马铃薯A病毒（Potato virus A）PLRV：马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus）PSTVd：马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid）DAS-ELISA：双抗体夹心酶联免疫吸附测定（Double Antibody Sandwich ELISA）R-PAGE：双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Return Polyacrylamide Gel Electrophoresis）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-PCR）NASH：核酸斑点杂交（Nucleic Acid Spot Hybridization）MS：MS培养基（Murashige & Skoog(1962)）6-BA：6-苄胺基嘌呤（6-Benzylaminopurine）CCC：矮壮素（Chlormequat Chloride）IBA：吲哚丁酸（Indole-3-Butyric Acid）KT：激动素（Kinetin）IAA：吲哚乙酸（Indole-3-Acetic Acid）B9：丁酰肼（Daminozide）AR：分析纯 （Analytical Reagent）5生产设施、仪器设备、试剂和培养基5.1生产设施风淋室、更衣室、洗涤室、配制室、灭菌室、仪器室、接种室（无菌操作室）、组培室、检测室。DB14/T 630201535.2仪器设备配置5.2.1更衣室：紫外线灯、更衣柜、消毒柜、洗手池、工作服、接种服、工作帽、口罩、拖鞋或鞋套等。5.2.2洗涤室：紫外线灯、试验台、洗涤池、洗瓶机、晾瓶架、蒸馏水器、洗涤用具、周转箱等。5.2.3配制室：试验台、电子天平、pH 计、磁力搅拌器、电冰箱、蒸煮锅、培养基制备机、定量灌装机、紫外线灯、烧杯、量筒、移液管、玻璃搅拌棒、容量瓶、试剂瓶、分注器等。5.2.4灭菌室：鼓风干燥箱、压力蒸汽灭菌器、微波炉、紫外线灯等。5.2.5仪器室：光照培养箱、人工气候箱、冰箱等。5.2.6接种室：臭氧消毒机、移动式空气自净器、空调、超净工作台、体视显微镜（双筒解剖镜）、数显接种器械灭菌器、白瓷盘、酒精灯、培养皿、解剖刀（手术刀）、解剖针、接种针、长柄枪型镊、弯尖手术剪、手持喷雾器、过滤灭菌器、紫外线灯或紫外线消毒器、送物手推车、座椅等。5.2.7组培室：臭氧消毒机、紫外线灯、光照培养架、空调、照度计、自动控时器、温湿度计、试管、培养瓶等。5.2.8检测室：酶标仪、高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、PCR 仪、微量移液器、紫外线灯等。5.3试剂75%乙醇、95%乙醇、40%甲醛、HgCl2、漂白粉饱和溶液、KT、IAA、IBA、6-BA、B9、配制MS培养基的各种化合物（见表1）等化学试剂。5.4培养基试管苗扩繁选用MS培养基（Murashige & Skoog(1962)）。6MS 培养基和植物生长调节剂母液配制6.1MS 培养基配制MS培养基按表1配制。配制母液A时，最后加入氯化钙；配制母液B时，分别将两种试剂单独加热，待溶解后进行混合，再将混合溶液继续加热使其充分螯合至产生深黄色溶液，冷却后进行定容，装入棕色试剂瓶。各母液均放置在冰箱中于4条件下保存，使用时再根据需要浓度配成MS培养基，pH值用8.3 ml/L的HCl和4.0 g/L的NaOH调整到5.8。表 1MS 培养基配制表母液化合物数量（g）蒸馏水定容量（ml）配制1L培养基需母液量（ml）ANH4NO316.51 000100KNO319.0KH2PO41.7MgSO4.7H2O3.7CaCl2。2H2O4.4DB14/T 63020154BFeSO40.5571005Na2-EDTA0.754CKI0.0831001Na2MoO4.2H2O0.025CoCl2。6H2O0.002 5CuSO4.5H2O0.002 5MnSO4.4H2O2.23ZnSO4.7H2O0.86H3BO30.62DVB10.00410010EVB60.00510010F甘氨酸0.0210010G烟酸0.00510010H肌醇1.010010蔗糖30.0直接加入琼脂7.0注1：A为大量元素；B为铁盐；C为微量元素；DH为有机成分；注2：化学试剂规格选用AR。6.2植物生长调节剂母液配制植物生长调节剂通常配成浓度为1 mg/mL的母液。 IAA、 IBA用95%乙醇溶解， KT、 6-BA用82.5 ml/L的HCl溶解，配制母液时先用1 mL2 mL的相应溶剂溶解，再用无菌蒸馏水定容至所需浓度，摇匀后贮于棕色试剂瓶中，置于4 冰箱中保存。B9与CCC可以不配制母液，用时直接称取，再用热水溶解。7脱毒技术7.1取材及处理7.1.1品种生产推广选用通过国家农作物品种审定委员会或山西省农作物品种审定委员会审定的适宜本区域种植的品种。7.1.2材料选择在通过GB 7331检疫的产地选择脱毒材料，应在肥力中等或施肥量中等的地块上选择单株。生长期间，经苗期、花期和收获前三次田间检查，选择具有品种典型特征特性、生长势强、目测无类病毒和病毒病症状的优良单株做标记， 收获时结合块茎特征及产量情况进行复选， 获得相应植株的典型块茎单收单贮。7.1.3类病毒检测按照 NY/T 1962 、NY/T 2744 对所选块茎采用 R-PAGE、RT-PCR、NASH 方法进行检测，筛选出无 PSTVd 的块茎。7.1.4种芽培养DB14/T 63020155将所选的无PSTVd且芽眼萌动的块茎冲洗干净， 放置在光照培养箱或人工气候箱进行热处理和培养，温度36 ，光照时间16 h/d，经34周使种芽长至2 cm3 cm。7.2种芽灭菌从块茎上切取2 cm左右的芽若干个放入烧杯，用纱布封口，在自来水下冲洗30 min60 min，然后移到超净工作台上，先用75%乙醇浸润10 s30 s，在漂白粉饱和上清液或5%10%的NaClO溶液中浸泡10 min15 min，或在0.1%的HgCl2溶液中浸泡5 min10 min，之后用无菌水冲洗45次，再用无菌滤纸吸去表面水分，置于无菌培养皿中备用。7.3培养容器及接种器械的清洗7.3.1培养容器可选用 180 mm18 mm 试管或 50 mL 三角瓶。新容器使用时，直接放在加入洗洁剂的热水中浸泡，浸泡时间应不少于 6 h，一般过夜，之后用试管刷或瓶刷清洗培养容器内外，再用自来水冲洗 35 次，然后倒置在晾瓶架上沥水后备用。7.3.2使用过的培养容器要立即清除残留物，放在加入洗洁剂的热水中浸泡，按新培养容器清洗方法洗干净后晾干备用。7.3.3接种器械的清洗同培养容器。7.4茎尖组织培养基制备茎尖组织培养基可选用MS（其中蔗糖20 g/L，琼脂6 g/L）+IAA 1 mg/L30 mg/L+KT 0.05 mg/L1.0 mg/L，pH 5.8，配好后放入蒸煮锅或制备机内煮开，分装于试管或三角瓶中，每管（瓶）10 mL，用纱布棉球纸帽或封口膜 （盖） 封口， 放入高压蒸汽灭菌器内进行灭菌。 灭菌的工作压力应稳定在1.1 kg/cm2(0.105 MPa),温度为121 ，时间为20 min。灭菌后置于试管架或存放架上冷却待用。IAA应采用过滤灭菌器灭菌。7.5环境净化及器械灭菌7.5.1环境净化7.5.1.1所有人员需通过风淋室进入工作区域。7.5.1.2接种前 30 min 开启室内和超净工作台紫外线灯，照射消毒 20 min，关灯后 10 min 人员方可进入室内操作。7.5.1.3室内空气悬浮物和气体成份超标时，应根据情况通风、用 75%乙醇或 1%苯扎溴铵溶液喷雾降尘，开启空气自净器，使空气净化率达到 99.97%以上、空气质量达到相应要求。7.5.1.4每天工作结束后，清理地面，可用有效氯含量 5%6%的 NaClO 溶液 500 mg/L1 000 mg/L，或将 27 g/L33 g/L 苯扎溴铵溶液用无菌蒸馏水稀释 10 倍，或 50%多菌灵 400 倍等溶液交替进行地面消毒。7.5.1.5每天 20 时开启接种室臭氧消毒机 20 min，组培室等区域环境每周臭氧消毒一次。7.5.2器械灭菌7.5.2.1操作所用的镊子、解剖刀、解剖针、培养皿均需用纱布包裹后，经过高压蒸汽灭菌，培养皿以及滤纸可用纸包好置于鼓风干燥箱内 200 下灭菌 2 h。DB14/T 630201567.5.2.2接种服、工作帽、口罩、拖鞋在消毒柜中消毒或用紫外线灯照射消毒。7.6无菌操作工作人员进入接种室前， 用肥皂清洗手臂， 在更衣室穿戴好消毒的接种服、 工作帽、 口罩和拖鞋 （鞋套）。操作时用75%乙醇仔细擦拭双手、超净工作台台面。每人备23套剪刀、镊子等接种工具，将接种工具浸泡在95%乙醇中，使用前，在数显接种器械灭菌器或酒精灯外焰上灼烧灭菌，放在器具搁置架上冷却后待用，之后在每次操作中多套工具交替使用，重复进行灭菌。7.7茎尖剥离将消过毒的种芽置于40倍体视显微镜下，用解剖针逐次去掉幼叶，直至露出光滑的茎尖，用解剖刀切取带12个叶原基(0.1 mm0.3 mm)的生长点，用接种针将生长点移至试管或三角瓶内培养，每个容器接种一个生长点，酒精灯上烘烤试管（瓶）口和纱布棉球纸帽或封口膜（盖）后封口，在管（瓶）壁上注明品种、编号和接种日期等内容。7.8茎尖苗培养把接种后的试管或三角瓶放置于组培室内的光照培养架上进行培养。 培养条件为温度23 2 、光照强度2 000 Lx3 000 Lx、光照时间16 h/d，一般培养3040d看到茎尖明显伸长且呈绿色，有小叶发生时将小茎芽转入装有普通MS培养基的试管内进行培养，继续生长并形成根系，经45个月可发育成45个叶片的小植株。随后将茎尖苗按单节切段，用MS培养基进行培养而形成株系。7.9病毒检测按株系随机抽取部分茎尖苗进行病毒检测。按 6.1.3 进行 PSTVd 复检，按照 NY/T 2678、NY/T 401采用 DAS-ELISA、RT-PCR 方法进行 PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV 检测；无阳性反应的再用指示植物方法鉴定，最后选留达到 GB 18133 要求，无 PSTVd、PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV的株系作为脱毒试管苗。7.10种性鉴定利用脱毒试管苗生产少量原原种，按NY/T 1963或GB/T 28660进行田间或室内品种鉴定。经鉴定，未发生变异的株系作为脱毒核心试管苗。7.11脱毒基础试管苗保存脱毒核心试管苗经扩繁后形成脱毒基础试管苗。 保存脱毒基础试管苗用MS培养基作为基础培养基，试管口用铝箔等材料封口， 保存条件为温度10、 光照强度500 Lx1 000 Lx。 在MS培养基中加入4%5%甘露醇，可保存11个月以上；在MS培养基中加入50 mg/L B9可保存近2年时间。基础苗保存时，标签应符合 GB 20464的要求。8脱毒试管苗扩繁8.1材料经病毒复检合格的脱毒基础试管苗。8.2培养基制备DB14/T 630201578.2.1固体培养基选用MS培养基。按5.1配方将配制好的MS培养基分装于培养瓶中，220 mL的培养瓶可装入20 mL,采用透气盖时可适当增量，然后按6.4的要求进行高压蒸汽灭菌。8.2.2液体培养基扩繁定植苗时，可采用不含琼脂的MS液体培养基，用量较固体培养基适当减少，瓶内放入方形滤纸架桥，然后按6.4的要求进行高压蒸汽灭菌。8.3扩繁准备操作环境净化消毒及器械灭菌按6.5的方法进行，无菌操作按6.6的规定执行。操作前，将基础苗瓶表面用75%乙醇纱布擦拭后，放置于超净工作台上。8.4试管苗扩繁打开脱毒基础试管苗瓶，用弯尖手术剪按单节（1个腋芽、1个叶节）切段，转移到培养瓶中，用长柄枪型镊扦插或平铺到培养基上，220 mL、直径（胴径）62 mm的培养瓶可扦插2025段。封口后，在瓶外壁上注明品种、日期及其它信息。将培养瓶放置于光照培养架上，培养条件按6.8执行，培养2030d即可。8.5污染苗处理经常检查组培室，发现污染苗应拧紧瓶盖，立即移出组培室外按6.4的规定进行高压蒸汽灭菌处理。灭菌后, 按6.3.2清洗培养容器。9试管薯诱导9.1生产条件仪器设备、试剂按第4章准备，MS液体培养基按7.2.2配制。9.2壮苗培养在超净工作台上，将试管苗的顶芽和基部剪去，剪成带有46个叶片（茎节）的茎段，平铺于培养容器中的MS液体培养基纸桥上，每瓶45个茎段。在昼间温度23 2 、夜间温度16 20 和光照强度2 000 Lx3 000 Lx、光照时间16 h/d的条件下静置培养，34周可长成壮苗。同时将剪去的顶芽转接到另外装有MS固体培养基的培养瓶中，培养成试管苗。9.3试管薯诱导在超净工作台上，将培养容器中多余的液体培养基用吸管吸出后，加入诱导结薯的液体培养基。选用MS液体培养基（其中蔗糖80 g/L）+6-BA 5 ml/L+CCC 500 mg/L+活性炭5 g/L，220 mL培养瓶可装入30 mL培养基，置于温度1820，光照强度2 000 Lx3 000 Lx、光照时间8 h/d或24 h/d黑暗条件下诱导结薯。12周后，植株上陆续形成小块茎。9.4收获及贮藏将诱导的小块茎继续培养56周后即可收获试管薯。试管薯用自来水冲洗干净，放在阴凉、通风处晾干，装入保鲜袋，在3 4 条件下贮藏，内外标签应符合 GB 20464的要求。