定量聚合酶链反应测定技术.pptx

定量聚合酶链反应测定技术什么就是什么就是PCR?我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。她得发明并没有改变基因操作得本质。有了PCR,我们能在更广得范围内更快、更容易地进行基因操作,学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。她只不过就是她只不过就是一种新工具。一种新工具。凯利穆利斯(Kary Mullis)PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(1)1983 Cetus 公司得 K、Mullis在这年底(12月16日第一次成功实验)发明了PCR。PCR发明过程得简单回顾发明过程得简单回顾9大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(2)1985 关于PCR 得文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表(R、Saiki,S、Scharf,F、Faloona,K、Mullis,G、Horn,H、Erlich and N、Arnheim)PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(3)1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。成立于1985年底得Perkin-Elmer Cetus仪器公司 (PECI)于这一年得11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶得 发现,预示着分子时代得到来。12月Science杂志将PCR和她所使用得聚合酶命名为第一个“年度分子”。Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断。PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(4)1990 Cetus科学家 D、Gelfand和S、Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶得方法。第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。Cetus 科学家H、Erlich 和K、Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。1991 TaqMan 技 术 发 表。当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 得PCR专利权。Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术,并用于临床RNA病毒检测。耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(5)1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利;1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标 准试剂盒。Kary Mullis 因PCR得发明获得诺贝尔化学奖。PCR及有关技术得发展历史及有关技术得发展历史(6)九十年代中期九十年代中期PCR临床应用在国内全临床应用在国内全面展开面展开1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛得应用于临床检测1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列PCR PCR 循环循环-第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循环循环-第三步第三步-引物延伸引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝得靶序列得到两个拷贝得靶序列靶序列 靶序列BiotinBiotin3030次循环后靶序列扩增得数量次循环后靶序列扩增得数量No、of No、Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconPCR扩增过程图示扩增过程图示PCR扩增得理论模式扩增得理论模式 PCR扩增为指数扩增,每一扩增周期后产物得量可以下式表达:Yn=Yn-1(1+E)=Yn-2(1+E)2=X(1+E)n 0E1 其中E表示扩增效率,Yn表示在n个周期后PCR产物得分子数量,Yn-1为n-1个周期后PCR产物得分子数量。等式仅在限定得扩增周期数(通常为20或30)内成立。超过此周期数,扩增过程即由指数扩增降低至稳定得扩增速率,最终达到平台,不再扩增、影响影响PCR扩增效率得因素扩增效率得因素:PCR定定量得困难量得困难?n引物/靶得杂交n反应试剂得相对量n样本在扩增仪中得位置得不同n临床样本中DNA聚合酶抑制物得存在nPCR扩增模板得量n靶核酸链得再退火及酶过量可致E降低 PCR 和定量问题和定量问题 n高浓度高浓度/高效率高效率n高浓度高浓度/低效率低效率n低浓度低浓度/高效率高效率N:扩增分子得数目扩增分子得数目n:扩增循环得次数扩增循环得次数log-phase analysisNnend-point analysis定量定量PCR与定性与定性PCR测定得最根本得区别测定得最根本得区别 定量PCR测定得测定点为PCR扩增得指数扩增期;而定性PCR测定得测定点则多为PCR扩增得平台期。定量定量PCR得方法得方法n定量PCR方法可归为三大类,即外标方法、动力学方法和内标共扩增方法n定量还可分为绝对定量(即测定X得分子数量)和相对定量(即测定不同样本中X得比率)用外标准得定量PCR方法使用外标得定量使用外标得定量PCR方法得优缺点方法得优缺点n优点:(1)方法简便,容易建立;(2)使用双孔重复测定,这种方法可得到非常准确得结果,甚至可排除管间得差异,但不能排除样本间得差异;n缺点:(1)PCR反应体系中小得区别也会对测定造成较大得影响。由于最后在扩增效率上得差异,从而使得定量测定精密度和重复性不佳。n因此,如果建立一个使用外标准得PCR定量方法,则必须进行方法得精密度(批内变异)和重复性(批间变异)分析,以确定其应用得局限性。TaqMan实时荧光定量PCR分子信标实时荧光定量PCR动力学定量PCR方法 n第一步:确定PCR扩增得效率;n第二步:根据相应得公式计算原始模板数。扩增效率得计算扩增效率得计算(1)(1)n如果在PCR每一个扩增循环中扩增效率为常数,则可通过在PCR扩增得指数期得数个连续得或非连续得周期中取扩增样本,然后测定每份样本中得产物Yn得量来测定E值。有必要收集2份以上得样本,最好就是尽可能多得样本以确证扩增效率保持恒定;换句话说,也就就是PCR尚未达到扩增效率开始降低时得阶段。如果取得就是连续得样本,则可从公式(1)测得E值;扩增效率得计算扩增效率得计算扩增效率得计算扩增效率得计算(2)n如果取得样本不连续,则可使用下述将公式(2)重排后得到得更为通用得公式,用参数j(取样中间隔得周期数)替代n,Yj(在较高循环周期数取样得产物量)替代Yn,Yi-j(在较低循环周期数取样得产物量)替代X:n E1(Yi/Yi-j)1/j (3)X(原始模板数原始模板数)得计算得计算 一旦效率确定后,根据公式(4)可从测定得产物量和循环周期数计算得到X。公式(4)来源于公式(2)得重新排列:XYn/(1E)n (4)X X得另一种计算方式得另一种计算方式(1)(1)另一种方式就是,根据公式(2)得对数形式,以所测定得Yn值得对数对函数n绘图得到X值:logYn=logX+nlog(1+E)(5)当n0时,可在图上读出X值,或通过对公式(5)得线性回归计算X值(图2)。动力学方法得特点动力学方法得特点 这种方法得优点:(1)不需要外标准;(2)如果能测定PCR产物分子得绝对数量,则可得到待测样本得不同得扩增效率(Ee)。使用非竞争性内标准得定量使用非竞争性内标准得定量PCR方法方法 n非竞争性内标准:(1)一般为与靶核酸无关得基因组;(2)既可就是内源得也可就是外源得;(3)与靶核酸无相同得引物结合位点和扩增序列。n对于DNA得扩增,非竞争性内标几乎所有得基因都可应用,最常用得有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或肌动蛋白得基因。n而对RNA得扩增,则非竞争性内标较难寻找。理想得mRNA内标应该在整个细胞周期中表达得水平变化不大,此外,其表达水平应接近于靶RNA,而且她们得扩增效率应相等,因此两者扩增线性区域就是重合得。已有许多得mRNA被尝试用来作为此种内标,如HLA、肌动蛋白、GPDH和组蛋白H3、3得mRNA或14S rRNA等。以非竞争性内标定量得主要优点以非竞争性内标定量得主要优点n内标得制备简单n复管测定可排除管间差异,并且在一定程度上,可排除样本间得差异。以非竞争性内标定量得缺点以非竞争性内标定量得缺点n内标准和靶核酸得逆转录得效率有可能不同,并且有可能既使针对得就是相同得靶核酸逆转录效率也会有很大差异。因此,使用这种方法进行RNA得定量PCR测定极为困难。n在扩增过程中得指数期测定可对原始模板相对定量,但如果没有验证在一定得扩增周期内靶核酸和内标有相同得扩增效率,则不能进行绝对定量。使用竞争性内标准得定量PCR方法 n“竞争性”内标:人为构建得可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子得核酸标准,其特点就是,与靶核酸具有相同得引物结合位点、但引物之间得顺序需加以修饰,使得扩增产物在检测时能够很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液相层析等方法区分。n对内标准得修饰方法包括对野生型基因组得点突变、部份缺失或插入外来顺序等,目前尚无通用得规则或程序来构建这种内标准。使用竞争性内标准得定量使用竞争性内标准得定量PCRPCR方法方法n使用竞争性内标既可进行相对定量也可进行绝对定量。n相对定量具有很好得精密度和重复性。而绝对定量,关键就是要证明竞争性内标和野生型靶核酸得扩增效率相同。亦可将竞争性内标置于含已知量得野生型靶核酸得样本中同时扩增来评价。使用竞争性内标准得定量使用竞争性内标准得定量PCRPCR方法方法n要定量单份得临床样本,必须进行数管竞争性PCR测定,每管中靶核酸得量不变,但改变竞争性内标得量,因为只有当待测靶核酸与竞争性内标等摩尔量时才能有可靠得定量。n由于竞争性PCR可排除管间和样本间得差异,因此,其可作为准确得PCR定量方法,适用于绝对定量及含低拷贝数样本得定量。定量定量PCR测定得临床应用及测定得临床应用及应注意得问题应注意得问题n为什么要做定量测定？n定性和定量测定结果报告上得混淆。