生物芯片技术【可编辑的PPT文档】.ppt

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物芯片技术生物芯片技术温州医学院检验医学院生命科学学院温州医学院检验医学院生命科学学院分子生物学检验技术分子生物学检验技术 第九章第九章免疫共沉淀（Co-IP）Pull down assay章节提要生物芯片始于上世纪90年代，随着人类基因组计划而诞生的一项新技术。它是由Southern印迹技术衍生而来，是一门多学个交叉的综合技术，这项技术涉及到了生命科学、计算机、微机械、微电子、物理、化学、数学等领域。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics定义：通过微加工和微电子技术，在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列，以实现对组织，细胞，核酸，蛋白质及其他生物分子进行有效、准确、高通量的检测。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics章节提要种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、缩微芯片实验室。各类芯片的定义。最终目标：把生物和化学等领域所涉及的样品制备，生化反应和检测分析的整个过程集成化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成缩微芯片实验室。章节提要章节提要芯片技术的优点：多样品并行处理、分析速度快、所需样品量少、污染少。应有的领域：基础研究、临床诊断、药物筛选，指导用药与治疗、农作物优育优选、环境检测、卫生监督、司法鉴定。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics以结构与工作机制可分为微阵列芯片与微流体芯片微阵列芯片：由生物材料微阵列构成的芯片，以分子间的亲和结合作为核心，以在固相载体表面固定一系列可寻址的识别分子阵列为结构特征，如碱基配对，抗原抗体结合，包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics章节提要微流体芯片：以微管道网络为结构特征，实现对各种生化组分的微流控操作和分析，包括毛细管电泳芯片，PCR反应芯片等缩微芯片实验室优势：将样品制备、生化反应、检测等过程集成在一个系统中。它是未来芯片发展的主流方向之一，也是生物芯片发展的最终目标。章节提要Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics本章节主要的学习内容本章节主要的学习内容基因芯片（gene chip）蛋白质芯片（protein chip）缩微芯片实验室（laboratory on a chip）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一节第一节 基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。DNA Microarray 的原理经过标记的待测样品DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后，经激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过检测杂交信号强度来获取样品分子的数量与序列信息，用计算机软件进行数据比较与分析，从而对基因序列及功能进行大规模，高通量的研究。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、基因芯片的原理基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种 高效、快速 核酸序列分析手段。同时也是最先发展，最为成熟，最先商品化的生物芯片 芯片分类载体不同：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、陶瓷芯片方法不同：原位合成、直接点样探针不同：寡核苷酸、cDNA、基因组芯片用途不同：表达谱、测序芯片、诊断芯片、SNP分型分析步骤为：分析步骤为：生物芯片的制作、样品处理及标记、杂交或反应、杂交检测及数据处理等。芯片设计芯片制作PCR扩增靶基因标记原位合成点样方法实际应用样品处理芯片杂交数据分析杂交检测放射显影光化学电化学酶促反应芯片技术发展的关键无孔的固相载体，如玻璃高密度寡核苷酸片段的原位合成技术Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics载体的定义与种类定义：用于连接、吸附或包埋各类生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料。玻片 固体片状 硅片 瓷片 硝酸纤维素膜 膜性材料 尼龙膜 聚丙烯膜 具有可以进行化学反应的活性基团，便于与生物分子进行偶联。要有惰性与稳定性：惰性（非特异吸附和其他性能不干扰生物分子的动能）稳定性（能承受一定的压力与酸碱条件的变化）良好的兼容性(便于制作其他类型的芯片)载体材料的要求载体材料的要求载体的表面处理原因：核苷酸片段无法直接连接到载体表面，故需要活化，便于固定生物分子。试剂：碳二亚氨，N-羟基琥珀酰亚胺酯。活性基团：氨基、羟基、巯基、醛基处理依据：载体表面性质、生物分子的化学特征常见载体薄膜状载体 优点：与核酸亲和力强、技术成熟。膜结合玻璃片 优点：亲和性、刚性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics处理载体的基本要求修饰后表面要均匀且硬质有效固定各种类型生物材料在激发光下，荧光背景低高密度，大量，均匀的点阵，变异系数小Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探针固定到固相支持物上，方法有两种：探针固定到固相支持物上，方法有两种：光去保护并行合成法原位合成 分子印章原位合成法 喷印合成法（压电打印法）合成点样 通过特定的高速点样机器人直接将探针点在芯片上的技术。合成cDNA探针的原则设计于目的cDNA的3端。避免长片段重复序列长度为0.1-2.5kbZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics寡核苷酸探针长度16-26bp，G+C在40-60%探针内不用大于4bp的碱基互补配对序列，同一个碱基连续出现小于4个与非靶序列的同源性低于70%，小于8个碱基相同。设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics点突变检测核苷酸探针设计方法：等长移位设计法 按靶序列从头到尾依次去一定长度的互补的核苷酸序列组成的一套探针组合。这套探针是野生型探针，然后对每一野生型探针中间的某一碱基用其他三种碱基替代。主要目的：进行点突变扫描Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探针在载体表面的固定（一）合成点样法：通过PCR扩增或人工合成序列，通过计算机控制的三坐标工作平台，用针头和微喷头分别把探针溶液分配在固相载体表的位点上，通过物理或化学法固定探针。优点：技术成熟，灵活性大，适用于单位自行合成。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics在硬质表面上直接合成寡核苷酸探针序列原位光刻合成法、压电打印合成法，分子原位合成法。技术瓶颈：高空间分辨率的模板点位技术、高合成效率的DNA化学合成技术优点：标准化，规模化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探针在载体表面的固定（二）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics原位合成的原理原位合成的原理基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理。它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合的四聚体(44种)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics原位光刻合成法原位光刻合成法主要步骤为：1.首先用光敏保护支持物活化基团2.选择合适的蔽光膜保护不需要聚合的地方，暴露需要聚合的位点3.在激光点光源的照射下，去除光敏感保护基团，使该位点显露出活性的羟基或者氨基4.加入的单核苷酸，与活化端发生化学反应5.然后更换蔽光膜，重复上步骤，完成核苷酸的固定连接（见图）。优点：在较小的区域制造大量不同的探针。图9-2基因芯片原位合成原理示意图 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics喷印合成法（压电打印法）喷印合成法（压电打印法）原理：墨盒内所用的ATCG四种碱基而非碳粉。步骤：将特定的DNA碱基合成试剂喷洒到特定位置上，以固相合成的原理与支持物发生偶联，然后固定，冲洗，去保护，偶联，直至合成完所需长度的探针。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分子印章原位合成法分子印章原位合成法分子印章的制备和压印过程如见图Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（三）合成点样（三）合成点样 由具有多个微细加样孔的阵列复制器(arraying and replicating device，ARD)或阵列器及由电脑控制的机器人来完成。机器人准确、快速地将不同探针样品定量(0.251.0l)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100150m斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。合成点样法分类接触式点样喷墨式打印 定位准确，重复性好 斑点大，大小分布不均，密度低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、样品的制备二、样品的制备及标记及标记（一）样品的制备样品的扩增 在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度。待测样品的标记 多采用荧光标记（cy3、cy5和FAM）方法，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法。荧光标记的优点激发光谱与发射光谱之间的STOCKs位移大，故分辨率强，灵敏度高可以进行定量检测避免放射性同位素好的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三 样品与基因芯片的杂交本质：DNA探针与靶基因碱基杂交形成DNA双链或DNA/RNA杂合链。影响因素：靶分子浓度 探针浓度 序列组成 盐浓度 杂交温度 反应时间基因表达检测低温，高盐，长时间突变检测高温，低盐，短时间Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics四、杂交结果的检测 检测方法很多，如荧光显影法荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。荧光检测器 激光共聚焦 快速传输 高质量图像，灵敏度高，分辨率好 价格昂贵 偶联装置照相机 扫描速度快，价格便宜 灵敏度低荧光显影法完全匹配产生的荧光强度比存在一两个错配的高5-35倍荧光强度与待测分子的含量呈线性关系问题 只要结合就会有阳性信号，无法确认是否完全匹配解决方法 使用多色荧光技术不同靶基因使用不同激发波长的荧光标记物。芯片激光光源电子束分裂器聚焦小孔检检测测器器滤光镜聚光镜物镜使用最广泛的是荧光显影法光纤DNA生物传感器微阵列原理：将合成的氰尿酰氯活化的探针固定在光纤的末端，集成含有不同探针的光纤，形成传感装置，探针伸入样品中，信号由另一端的CCD检测。优势 方便，可在没有confocal的实验室中开展实验。五、杂交结果的分析标准化：消除不同芯片，不同标记物的差异数据精简：去掉无显要意义的数据统计学分析：对数据进行分析归类，并进行统计学检验，保证器准确性生物学意义分析：基于统计结果，研究其代表的生物学意义，得出相应结论数据库：Genesist，AMADA，TIGR。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三、基因芯片技术在医学领域的应用三、基因芯片技术在医学领域的应用 基因芯片技术的基本应用可以分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）定性分析（主要指对基因表达的研究）。基因功能研究基因表达及调控的研究基因突变和多态性的检测DNA序列的测定基因组及基因研究基因表达及调控的研究基因芯片应用最广泛的领域从整体上分析细胞基因表达状况，为了解与某些生命现象相关的基因表达提供有力的证据，对于基因调控以及基因相互作用机理的探讨有重要的意义基因突变和多态性的检测利用基因芯片技术对一些突变点的定位、确认及分类是诊断基因疾病的基础。寡核苷酸芯片能够检出变异位点，被代替的核苷酸以及变异的特性。例如：HIV病毒RT与PRO的突变检测。DNA序列测定原理：任何线性DNA或RNA单链都可以被分解为一系列碱基数固定，错落重叠的寡核苷酸片段，或称为亚序列，只要测出莫伊核苷酸的全部亚序列，就可以还原原序列。优点 快速、成本低、易于自动化缺点 杂交条件不统一、易出现假性结果、重复序列无法测定。优势 测定已知序列、研究突变与SNP检测。基因组及基因研究研究酵母基因组的复制活动：发现其复制起点、复制叉在基因组的移动与S期复制和转录活动的关系优势：用量少、自动化、便于大量筛选新基因基因芯片应用于疾病诊断的优势 灵敏、准确、快速、简单、高通量（同时检测多种疾病）应用：感染性疾病诊断 出生缺陷检测遗传性疾病的诊断 HLA配型检测肿瘤诊断及分型 神经系统疾病检测耐药性检测疾病诊断感染性疾病诊断流程 将待测病原体的特征基因片段或寡核苷酸探针固定于玻片上制成芯片，从患者的血清中提取的病原DNA或RNA经扩增标记荧光后与芯片进行杂交，扫描杂交信号，计算机分析，得出定性或定量的结果。由于病原微生物的不同亚型，不同的突变株会导致患者的发病程度，患者对药物的敏感程度等的差异，故对病原微生物的分型，可以帮助医生了解患者的病情，确定最佳治疗方案。如HPV亚型123种，其中20种高危，提前诊断HPV感染，有利于防止宫颈癌变，降低死亡率。基因芯片上同时对21种不同类型的HPV诊断，3.5小时完成。感染性疾病诊断遗传性疾病的诊断现行诊断遗传学疾病方法（PCR，测序、RFLP）的共同缺点通量低。遗传性疾病中可能是由众多位点中的一个或多个位点突变引起的，因此对多位点检测尤为重要。如beta-地中海贫血，突变100种以上。应用于血友病，杜氏肌营养不良症、苯丙酮尿症，血红蛋白异常病。肿瘤诊断及分型获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式筛选出哪些分子起关键性的调控作用的基因肿瘤分型（乳腺癌）应用如p53基因突变检测耐药性检测病原微生物的表达谱检测突变分析多态性分析目的指导抑制靶分子的新药合成、临床用药基因芯片在药物研究中的应用 可直接在基因水平上寻找药物靶标，解释作用机理，检测药物的毒副作用，为药物开发与设计提供理论依据。作用体现：代替人体的靶组织分析代谢途径与信号通路确定药物作用的靶组织引导药物开发缩短周期，便捷基因芯片存在的问题探针合成中会插入杂质，降低特异性制备标记过程比较复杂。数据缺乏可比性，不利于芯片数据的共享产生原因：蛋白质的表达与其上游的mRNA的表达未显示出直接关系。蛋白质结构或构象的微小变化均能导致其活性与功能的改变定义：是指固定于支持介质上的多肽或蛋白质构成的微阵列第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、并行、高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。蛋白质芯片适用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子物质间相互作用的分析。是功能基因组、蛋白质组研究领域中一种新型的重要工具。蛋白质芯片原理：采用机械点样或共价结合等方法将多肽、蛋白质、酶、抗原或抗体固定于固相载体上形成分子点阵，并将待测蛋白质与该芯片进行孵育反应，再将荧光标记的蛋白质与芯片蛋白质复合物反应。通过扫描系统检测个点的荧光强度，分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用，由此达到测定蛋白功能的目的。蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类蛋白质功能芯片 天然蛋白质点在基片上，用于蛋白活性及分子亲和性的高通量平行分析。蛋白质检测芯片 将高度亲和特异性的探针分子（mAb）点在基片上，用以检测复杂样品中目的蛋白。蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类1.支持物表面高度密集排列探针蛋白点阵 微阵列 微孔板 测定时，特异性地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测系统对靶蛋白进行定性及定量分析。抗体为常用的探针蛋白。2.三维凝胶块芯片 实质是在基片上点布以10000个微小PAGE胶块，主要用于筛选抗体抗原，酶动力学反应的研究。优点：灵敏、蛋白结构天然蛋白质芯片的制备与分析载体探针蛋白的制备探针的固定检测载体要求：稳定性，兼容性种类：化学膜 尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜无需复杂的表面处理 背景高，灵敏度低PAGE胶 储水环境保持探针活性，除反应液困难微孔板 性能良好，探针分隔良好交叉污染程度低，液相保持探针活性玻片 为最佳载体 需表面修饰（醛基、BSA、poly-lysine）高通量 自动化 效率高 探针的制备种类：抗体、抗原、蛋白质、配体、受体、酶、核酸、多肽要求：亲和性强、特异性高。应用最广泛的探针：抗体，抗原，尤其是mAbZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探针蛋白的制备蛋白质芯片上的探针蛋白可选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的蛋白质。单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探针的固定体外合成的劣势 多肽长度不易控制、探针活性位置点加法：手工点样 接触式点样 喷墨点样法固定后，需用BSA溶液封闭提高特异性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（四）蛋白质芯片的检测 1.直接检测法 表面等离子体共振 分辨荧光光谱技术 表面增强激光解吸及电离飞行时间质谱2.蛋白质标记法预先标记待测物，常用标记物有荧光染料cy3,cy5，也可标记蛋白质的二抗优势：原理简单，使用安全，分辨率高Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics四、蛋白质芯片的应用四、蛋白质芯片的应用 优势 高通量 灵敏度高 用量少应用（一）疾病诊断与疗效判定（二）新药的研制与开发（三）蛋白质研究方面的应用 疾病诊断与疗效判定表型指纹同时测定样品中全部蛋白含量的变化优势不受单个标志物的特异性与灵敏度的限制应用肿瘤C12诊断系统 自免疫疾病 抗原检测新药的研制与开发 用芯片找到病理状态下表达异常或特异性表达的蛋白质及通路中关键蛋白，以这些蛋白为靶分子，合成芯片，研究药物对这些蛋白的作用。优势节约时间，减少动物实验，降低盲目性生物分子间的相互作用抗原-抗体相互作用蛋白质-蛋白质相互作用小分子-蛋白质相互作用蛋白质-核酸相互作用酶-底物相互作用蛋白质芯片蛋白质芯片应用应用蛋白芯片的缺陷制作繁琐，检测需专门的仪器，成本高载体表面修饰技术，探针固定技术需改进不能捕获全部蛋白质信息实验要求高，不易控制，重复性不足Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第三节第三节 缩微芯片实验室缩微芯片实验室 缩微芯片实验室就是将生命科学和医学研究中的许多不连续的分析过程，如样品制备、核酸标记、生化反应、分离检测及数据处理等，通过采用半导体光刻加工等缩微技术，集成到一块生物芯片上所形成的一种便携式生物化学分析系统。特点 集成实验单元 时间短 速度快 信息量大 缩微芯片实验室高度集成化 体积小自动化 重量轻高通量 便于携带分析速度快 污染小样品量少 成本低Lab on a chipLab on a chip