DB37∕T 3533-2019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法(山东省).pdf

ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35332019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性 PCR 法 Identification of donkey, mule/hinny and horse derived materials in leather Real-time fluorescent PCR method 2019 - 03 - 21 发布 2019 - 04 - 21 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 35332019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 试剂或材料 . 1 5.1 试剂 . 1 5.2 材料 . 2 5.3 配制溶液 . 2 6 仪器设备 . 3 7 检测用引物和探针 . 3 8 试验步骤 . 3 8.1 样本制备 . 3 8.2 DNA 提取 . 3 8.3 实时荧光 PCR 反应 . 3 9 试验数据处理 . 4 9.1 PCR 有效性判定 . 4 9.2 检测结果分析和表述 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 4 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 . 5 附 录 B （资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列 . 7 DB37/T 35332019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。 本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。 DB37/T 35332019 1 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性 PCR 法 1 范围 本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。 本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。 本方法检出限为0.5 %。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程， 对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct值 cycle threshold 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 根据核基因CKM(creatine kinase of muscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针， 采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增， 根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值， 判定动物皮张驴、马和骡3种动物源性成分。 5 试剂或材料 除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 DB37/T 35332019 2 5.1.1 氯化钠（NaCl）。 5.1.2 浓盐酸（HCl）。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris base）。 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）。 5.1.5 十二烷基硫酸钠（SDS）。 5.1.6 蛋白酶冻干品。 5.1.7 异硫氰酸胍（GuSCN）。 5.1.8 硅珠。 5.1.9 无水乙醇。 5.2 材料 5.2.1 驴、骡和马 3 种动物皮张源性成分实时荧光 PCR 定性检测试剂盒。 5.2.2 2TaqManMaster Mix：含有 Taq DNA 聚合酶（终浓度 1 U/20 L）、Mg2+（终浓度 2.0 mmol/L）、dNTPs（终浓度 0.2 mmol/L）。 5.3 配制溶液 5.3.1 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0）溶液：称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中，加入80 mL 水， 用浓盐酸调节 pH 至 8.0， 转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸汽压 （121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.2 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.4）溶液：称取 12.1 g Tris 置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用浓盐酸调节 pH 至 6.4，转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121 ）灭菌20 min，室温保存待用。 5.3.3 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液：称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用 10 %的氢氧化钠溶液调节 pH 至 8.0，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸气压（121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.4 10 % SDS：称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。 5.3.5 5 mol/L 氯化钠溶液：称取 29.22 g 氯化钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa 蒸汽压（121 ）条件下灭菌 20 min，室温保存待用。 5.3.6 细胞裂解液（Lysis Buffer）：取 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）20 mL，0.5 mol/L 二水乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）5 mL，5.0 mol/L 氯化钠 10 mL，10 %十二烷基硫酸钠 5 mL，转移至 100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。 5.3.7 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液：称取 0.2 g 蛋白酶冻干品，加水溶解，转移至 10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于-20 保存。 5.3.8 RNA 酶溶液：称取 1 g 冻干品 RNA 酶 A 溶解于 6 mL 无菌水中，于 100 加热 15 min，缓慢冷却至室温，转移至 10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，分装成小份存于-20 。 5.3.9 DNA 结合液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0），然后再加入 4 mL Trition X-100 溶液（温度 60 ），转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。 5.3.10 漂洗液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。 DB37/T 35332019 3 5.3.11 TE 缓冲液：量取 0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）加入到容量瓶中，调节 pH 至 8.0，转移至 50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 KPa蒸汽压（121 ）灭菌 20 min，降至室温，4 保存备用。 6 仪器设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪：4 通道以上。 6.2 电子分析天平：感量 0.1 mg 或 0.01 g。 6.3 离心机：最大离心力不小于 13 000 g。 6.4 振荡型恒温金属浴：0 100 。 6.5 高压灭菌锅。 6.6 低温冰箱：-20 4 。 6.7 超净工作台。 6.8 微量移液器：100 L1 000 L，10 L200 L，2 L20 L，0.5 L10 L。 6.9 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL。 7 检测用引物和探针 内标质控引物探针序列和马属动物通用PCR引物、驴和马的特异性探针序列见附录A中表A.1，引物探针在序列中的位置参见附录B。 8 试验步骤 8.1 样本制备 盐干皮或鞣制皮张在平整处边缘取约5 g，去除毛、脂肪，将试样在无菌水中浸泡20 min，用无菌水清洗2次，剪成直径约5 mm左右小块，使用液氮充分研磨成粉末。 8.2 DNA 提取 8.2.1 称取试样 30 mg5 mg 于 2 mL 的离心管中，每个样品设立 2 个平行样，加入 400 L 的 DNA 提取细胞裂解液、10 L 蛋白酶 K 混匀，56 水浴 2 h，期间轻微混匀 35 次。 8.2.2 于 12 000 g 离心 5 min，吸取上清液转至新的 1.5 mL 离心管中，加入硅珠悬浮液 10 L、DNA结合液 800 L，充分混匀室温静置 5 min，8 000 g 离心 1 min，弃上清液。 8.2.3 加入 700 L 漂洗液，涡旋振荡悬浮 10 s，8 000 g 离心 1 min，弃上清液。加入 700 L 的 70 %乙醇洗涤，8 000 g 离心 1 min 弃上清液，重复此步骤 2 次。 8.2.4 于 8 000 g 离心 30 s，吸走残余液体，室温干燥 10 min，至残余乙醇挥发干。 8.2.5 加入 50 L TE 缓冲液溶解 DNA，加入 1 L RNA 酶溶液，55 水浴 5 min，8 000 g，离心 1 min，吸取上清液转移至新的离心管中，-20 保存备用。 8.2.6 紫外分光光度计检测提取的 DNA 浓度与纯度，测定 260 nm 和 280 nm 处吸光值 A260/A280，比值在1.71.9 之间，DNA 浓度约为 0.1 ng/L50 ng/L。 8.2.7 也可采用经验证等效的动物组织 DNA 提取试剂盒，按照使用说明书提取。 8.3 实时荧光 PCR 反应 DB37/T 35332019 4 8.3.1 试样实时荧光 PCR 检测 多重实时荧光PCR：将驴、马和骡进行多重实时荧光PCR，PCR反应体系中包括驴和马2种动物源性的特异探针，并加入内标质控体系。PCR反应体系见附录A中表A.2。 8.3.2 对照实时荧光 PCR 反应体系 每个PCR反应设置3次平行。在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照： a) 空白对照：以水作为空白对照； b) 阴性对照：以 3 种动物之外的动物基因组 DNA 为阴性对照； c) 阳性对照：将驴、马和骡 3 种动物基因组 DNA 等量混匀作为阳性对照。 8.3.3 实时荧光 PCR 反应体系配制 按照附录A中表A.2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入模板DNA，3 000 g离心1 min，取出PCR管，放入荧光定量PCR仪中。 8.3.4 实时荧光 PCR 反应程序 95 预变性3 min；95 变性10 s，62 退火延伸35 s，40个循环。 9 试验数据处理 9.1 PCR 有效性判定 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效： a) 空白对照：无 FAM 和 JOE 荧光信号，或 Ct 值40.0，有 CY5 质控探针的荧光信号，且 Ct 值35.0； b) 阴性对照：无 FAM 和 JOE 荧光的 S 型扩增曲线，或 Ct 值40.0，有 CY5 质控探针的荧光信号，且 Ct 值35.0； c) 阳性对照：有 FAM、JOE 和 CY5 荧光的 S 型扩增曲线，且 Ct 值35.0。 否则判定为PCR无效。 9.2 检测结果分析和表述 9.2.1 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、JOE 荧光扩增曲线出现，若 Ct 值35.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.2 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 FAM、JOE 荧光扩增曲线出现，但 35.0Ct 值40.0，则需要重新提取 DNA 进行 PCR 反应。若再次扩增后的 Ct 值40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.3 对样品检测结果的判定，见附录 A 中表 A.3。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 防治污染的措施按GB/T 27403规定执行。 DB37/T 35332019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.1。 表A.1 实时荧光定性 PCR 引物和探针序列 引物探针名称 缩写 序列（5-3） 扩增片段（bp） 通用引物-上游 CKMF TCATCGTAGCATCGAGGGG 228246 通用引物-下游 CKMR AGCAGAGCAGGAAGGGAGTT 内标引物-上游 IMF AGACCACCAAATGCCCCTATC 140 内标引物-下游 IMR CGAGATTGAGATCTTCTGCGAC 内标探针 IMP 5CY5-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3DAB 驴源性探针 Lv-P 5JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-3BHQ2 马源性探针 M-P 5FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-3DAB 内标序列 AGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCG 注：通用引物CKMF/CKMR用于驴、马和骡3种动物源性成分检测。 A.2 实时荧光PCR反应体系 实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.2。 表A.2 多重实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 组分名称 加量（L） 终浓度 2TaqManMaster Mix 10 1 10 Primer Mix CKMF/R 2 0.50 mol/L IMF/IMR 0.10 mol/L 10 Probe Mix Lv-P（JOE） 2 0.10 mol/L M-P（FAM） 0.20 mol/L IMP（CY5） 0.10 mol/L 内标质粒 1 10-3 ng/L 基因组 DNA 模板 2 1.0 ng100 ng ddH2O 补至 20L A.3 对各种样品检测结果的判定 对各种样品检测结果的判定见表A.3。 DB37/T 35332019 6 表A.3 实时荧光 PCR 定性检测方法各种实验结果的判定 FAM 荧光 JOE 荧光 CY5 荧光 结果判定 Ct35 Ct35 多重 PCR体系 检出马源性成份 未检出驴源性成分或含量低于检测界限 多重 PCR体系 检出驴源性成分 未检出马源性成分或含量低于检测界限 多重 PCR体系 检出骡源性成分 未检出驴、 马及骡源性成分或含量低于检测界限 多重 PCR体系 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时只有 CY5 荧光检出，无 FAM、JOE荧光检出，判定为未检出驴、马和骡 3 种动物源性成分。 多重 PCR体系 PCR 反应失败。注意以下几个方面后再次进行反应。 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品 DNA 制备有问题，如样品中可能存在抑制物等。 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。 DB37/T 35332019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列 B.1 马(Equus caballus) PCR产物序列（Genbank:JQ065978.1） 马(Equus caballus) PCR产物序列 （Genbank:JQ065978.1） TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAACAACCGGATCTTTCAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCATACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCC B.2 驴（Equus asinus）PCR产物序列(Genbank:HQ336263.1) 驴（Equus asinus）PCR产物序列(Genbank:HQ336263.1) TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAATAACTGGATCTTTTAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCGTACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCC B.3 内标质粒 内标质粒 TGCACTCCTCCTGCATATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACACATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACGGTACCTTGCTTTAATCCTAAATGGCAAACTCC 注：下划线为引物位置，阴影部分为探针位置。 _