蛋白质的一级结构.pptx

XiongYanfei1Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.6.1 一个氨基酸的一个氨基酸的-COOH与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的-NH2缩合脱去一分子水形成的酰胺键叫作肽缩合脱去一分子水形成的酰胺键叫作肽键；氨基酸以肽键结合形成的化合物称作肽。键；氨基酸以肽键结合形成的化合物称作肽。2.6 氨基酸彼此以肽键结合形成链状多肽氨基酸彼此以肽键结合形成链状多肽肽键肽键二二肽肽XiongYanfei2Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl这种缩合作用可这种缩合作用可反复进行反复进行，形成二肽、三，形成二肽、三肽、寡肽及多肽；肽、寡肽及多肽；l肽链中一个氨基酸单位称为一个肽链中一个氨基酸单位称为一个氨基酸残氨基酸残基基(residue)，一个氨基酸残基较游离氨基，一个氨基酸残基较游离氨基酸少一个水分子（末端除外）酸少一个水分子（末端除外）,平均分子量平均分子量110110；l肽链的大小可用所含氨基酸残基的总数表肽链的大小可用所含氨基酸残基的总数表示或相对分子质量表示，大多数天然多肽示或相对分子质量表示，大多数天然多肽含含50200个氨基酸残基，相对分子质量在个氨基酸残基，相对分子质量在5,500220,00之间；之间；XiongYanfei3Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.6.2 肽链是有肽链是有方向性方向性的的(directional)l肽链的一端有游离氨基，称肽链的一端有游离氨基，称氨基末端（或氨基末端（或N末端末端 N-terminal），另一端有游离羧基，称），另一端有游离羧基，称羧基末端羧基末端（或（或C末端末端 C-terminal)；l 肽链写法肽链写法：游离：游离-氨基在左，游离氨基在左，游离-羧基在右，羧基在右，氨基酸之间用氨基酸之间用“”表示肽键。表示肽键。如：如：H2N丝氨酰丝氨酰亮氨酰亮氨酰苯丙氨酸苯丙氨酸-COOH写为：写为：Ser-Leu-Phe（或（或 S-L-F）前述五肽：丝氨酰前述五肽：丝氨酰-甘氨酰甘氨酰-酪氨酰酪氨酰-丙氨酰丙氨酰-亮氨酸亮氨酸写为：写为：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或（或 S-G-Y-A-L）H2N-COOHXiongYanfei5Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.6.3 所有肽链的共价主链结构都是相同的所有肽链的共价主链结构都是相同的l肽链中的骨架结构是由肽链中的骨架结构是由 单位重复连接而成，称单位重复连接而成，称共价主链共价主链（main chain or backbone)；H HH HNCCNCCOOR Rl不同肽链的区别在于侧链不同肽链的区别在于侧链R基的排列顺序不基的排列顺序不同同；l相同的氨基酸组成可形成多种不同的多肽链相同的氨基酸组成可形成多种不同的多肽链XiongYanfei7Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry问题问题2：写出这一肽链的结构：写出这一肽链的结构和名称和名称,这四种氨基酸还可以这四种氨基酸还可以组成几种寡肽？组成几种寡肽？XiongYanfei8Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.6.4 肽链末端羧基、末端氨基及侧链基团肽链末端羧基、末端氨基及侧链基团可发生不同程度的解离，表现出重要的理可发生不同程度的解离，表现出重要的理化性质化性质l在在pH114范围内，主链上肽键氨基不发生解离，范围内，主链上肽键氨基不发生解离，游离末端的游离末端的-COOH和和-NH2以及侧链以及侧链R上的基团可上的基团可发生发生不同程度的解离；不同程度的解离；l各基团解离程度及肽所带的总电荷取决于所处溶液各基团解离程度及肽所带的总电荷取决于所处溶液的的pH值；值；l对于指定的基团，其对于指定的基团，其pHpKa时，不发生酸式解时，不发生酸式解离，离，pHpKa时，发生酸式解离，时，发生酸式解离，pH=pKa时，时，解离与不解离各占一半，由此可确定肽链所带净电解离与不解离各占一半，由此可确定肽链所带净电荷荷.XiongYanfei9Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry问题问题3：肽链中可解离基团的（：肽链中可解离基团的（-COOH，-NH2 及侧链可解离基及侧链可解离基团团）pKa与游离氨基酸中对应基团与游离氨基酸中对应基团的的pKa值有何不同？为什么？值有何不同？为什么？问题问题4：丛肽链的组成与结构分析：丛肽链的组成与结构分析多肽有哪些主要性质？多肽有哪些主要性质？XiongYanfei10Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl肽具有等电点，调节溶液肽具有等电点，调节溶液pH值可改变肽的带值可改变肽的带电状况，使肽不带电荷而处于等电状态时的电状况，使肽不带电荷而处于等电状态时的pH值为肽的等电点值为肽的等电点肽等电点的差别可不同程度反映其氨基酸组成上肽等电点的差别可不同程度反映其氨基酸组成上的差异；反之亦然。的差异；反之亦然。等电状态时，肽在电场中不向任何一方移动等电状态时，肽在电场中不向任何一方移动不同大小的肽片断可用双向凝胶电泳进行分离不同大小的肽片断可用双向凝胶电泳进行分离肽链中的解离基团可被滴定，但肽链中的解离基团可被滴定，但 肽的滴定曲线复肽的滴定曲线复杂杂短肽以离子晶体存在，具有较高的熔点短肽以离子晶体存在，具有较高的熔点肽键上的基团具有相应的化学反应活性。肽键上的基团具有相应的化学反应活性。XiongYanfei11Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.6.5 许多短肽具有重要的生物活性许多短肽具有重要的生物活性 天然存在的活性肽天然存在的活性肽l作为神经递质、神经激素或神经调节物；如作为神经递质、神经激素或神经调节物；如LHRH-LHRH-类类1010肽肽(蛙的一种神经递质蛙的一种神经递质)，促甲状腺促甲状腺素释放因子素释放因子，脑啡肽，内啡肽，强啡肽等，脑啡肽，内啡肽，强啡肽等l作为抗体：作为抗体：短杆菌肽短杆菌肽A A，短杆菌肽，短杆菌肽S S等；等；l作为激素：胰岛素、胰高血糖素、促肾上腺作为激素：胰岛素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等；皮质激素等；l作为防御性毒物：剧毒的鹅膏蕈碱、蛇毒、作为防御性毒物：剧毒的鹅膏蕈碱、蛇毒、蛛毒等蛛毒等XiongYanfei13Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry 谷胱甘肽（谷胱甘肽（glutathione，GSH）谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CC NH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH过氧化物酶过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+XiongYanfei14Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryL-天冬氨酰天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，称作：苯丙氨酰甲酯，称作：aspartameXiongYanfei15Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.7.1 多肽与蛋白质的概念不完全相同多肽与蛋白质的概念不完全相同lThe term protein broadly defines molecules composed of one or more polypeptide chains;lThe term polypeptide is used to define the chain exceeds several dozen amino acids in length(less than 50 amino acid residues);lThe terms polypeptide and protein are used interchangeably in discussing single polypeptide chain.问题问题5：试简述蛋白质的重要生物学功能？：试简述蛋白质的重要生物学功能？2.7 蛋白质是由一条或几条多肽链组成的具有蛋白质是由一条或几条多肽链组成的具有特定空间结构和功能的生物大分子特定空间结构和功能的生物大分子XiongYanfei16Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.7.2 根据蛋白质的组成、或含多肽链数目或根据蛋白质的组成、或含多肽链数目或形状可对蛋白质进行不同的分类形状可对蛋白质进行不同的分类单纯蛋白质单纯蛋白质(simple protein)(simple protein)结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质蛋白质 +非蛋白质非蛋白质(辅基)(prosthetic group)(conjugated protein)辅基种类很广，常见的有辅基种类很广，常见的有色素化合物、寡糖、脂类、色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至核酸磷酸、金属离子甚至核酸l根据组成不同蛋白质可分为根据组成不同蛋白质可分为XiongYanfei17Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl根据蛋白质形状可分为球状蛋白与纤维状蛋白：根据蛋白质形状可分为球状蛋白与纤维状蛋白：纤维状蛋白质纤维状蛋白质(fibrous protein)(fibrous protein)球状蛋白质球状蛋白质(globular protein)(globular protein)肌动蛋白肌动蛋白毛发中的角蛋白毛发中的角蛋白蚕丝丝心蛋白蚕丝丝心蛋白XiongYanfei18Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl根据含多肽链数目可分为单体蛋白和多体蛋白根据含多肽链数目可分为单体蛋白和多体蛋白寡聚蛋白寡聚蛋白(oligomeric protein)(oligomeric protein)或多体蛋白或多体蛋白(multimeric(multimeric protein)protein)单体蛋白单体蛋白(monomeric protein)(monomeric protein)异型多体蛋白异型多体蛋白(heteromultimeric(heteromultimeric protein)protein)同型多体蛋白同型多体蛋白(homomultimeric protein)(homomultimeric protein)寡聚蛋白中的每一个具三级结构的多肽链称寡聚蛋白中的每一个具三级结构的多肽链称亚亚基基(subunit)(subunit)XiongYanfei19Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry应用：应用：由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去;2.8.1 多数球状蛋白质溶于水形成胶体溶液多数球状蛋白质溶于水形成胶体溶液蛋白质溶胶性质：蛋白质溶胶性质：a.a.质点大小在胶体范围：质点大小在胶体范围：1 1100nm100nm b.b.丁达尔效应丁达尔效应c.c.布朗运动布朗运动d.d.不能透过半透膜不能透过半透膜2.8 根据蛋白质的结构和性质特点可对蛋白质根据蛋白质的结构和性质特点可对蛋白质进行分离鉴定进行分离鉴定XiongYanfei20Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。破坏蛋白质胶体的稳定因素，将促使蛋破坏蛋白质胶体的稳定因素，将促使蛋白质沉淀析出白质沉淀析出XiongYanfei21Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry蛋白质处于蛋白质处于PI时，净电荷为零。溶解度最低时，净电荷为零。溶解度最低不同蛋白质不同蛋白质等电点不同等电点不同 调节调节pH值值将蛋白质彼此分开将蛋白质彼此分开2.8.2等电点沉淀和等电点沉淀和pHpH控制控制:XiongYanfei22Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl随着盐浓度的升高随着盐浓度的升高，如饱和或半饱和时，蛋白质溶解度逐渐，如饱和或半饱和时，蛋白质溶解度逐渐降低，相互聚集而从水溶液中沉淀析出，这种现象叫降低，相互聚集而从水溶液中沉淀析出，这种现象叫盐析盐析。解释：解释：大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。化层。常用的中性盐常用的中性盐：（：（NH4)2SO4特点：特点：保持蛋白质的天然构象保持蛋白质的天然构象蛋白质分离、提纯常用蛋白质分离、提纯常用方法。方法。2.8.3 加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出l低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度，即低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度，即盐溶盐溶l原因：原因：蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，且与水分子相互作用加强；子彼此排斥，且与水分子相互作用加强；XiongYanfei23Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.8.4 有机溶剂分级分离法：有机溶剂分级分离法：作用原理：作用原理：有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体形成有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体形成并沉淀。并沉淀。XiongYanfei24Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.8.5 离子交换层析离子交换层析l原理：原理：样品中各蛋白质组分的净电荷、分子大小不样品中各蛋白质组分的净电荷、分子大小不同，与固定相间的作用力不同而被分离同，与固定相间的作用力不同而被分离l洗脱方法：改变洗脱剂的盐浓度、洗脱方法：改变洗脱剂的盐浓度、PHPH值依次洗脱值依次洗脱l结合力小的蛋白质先由层析柱中洗脱出来结合力小的蛋白质先由层析柱中洗脱出来l分离效果与溶液中的离子强度、分离效果与溶液中的离子强度、pHpH有关有关l常用固定相：常用固定相：离子化纤维素离子化纤维素羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（CMCM），二乙基氨基乙基），二乙基氨基乙基(DEAE)(DEAE)纤维素纤维素优点：优点：具有松散的亲水性网状结构，及较大的表面积，大具有松散的亲水性网状结构，及较大的表面积，大分子可以自由通过分子可以自由通过交换容量大交换容量大,洗脱条件温和洗脱条件温和,回收率高。回收率高。l离子化葡聚糖离子化葡聚糖交联葡聚糖作基质交联葡聚糖作基质优点：优点：交换容量比离子交换纤维素大交换容量比离子交换纤维素大3 34 4倍。倍。XiongYanfei25Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryCation-exchangecolumnpH=5.0时，基质带负时，基质带负电荷电荷蛋白组分带不同电荷蛋白组分带不同电荷逐渐提高洗脱液的逐渐提高洗脱液的pH值，各组分以值，各组分以此被洗脱下来此被洗脱下来问：洗脱顺序？问：洗脱顺序？XiongYanfei26Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry即即分子排阻层析分子排阻层析（也称（也称凝胶过滤层析，分子筛层析）凝胶过滤层析，分子筛层析）2.8.6 凝胶过滤：凝胶过滤：原理：原理：凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当不同分当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。不同分子大小路径不同自由出入凝胶珠的内外。不同分子大小路径不同洗洗脱：脱：大分子大分子-先洗脱出来先洗脱出来 小分子小分子-后洗脱出来后洗脱出来XiongYanfei28Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry2.8.7 亲和层析亲和层析基础：基础：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）一种称配基的分子能特异而非共价的结合）蛋白质样品加入到蛋白质样品加入到连有配基连有配基的基质中（固定相）的基质中（固定相）目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上 其它蛋白质先被洗脱下来其它蛋白质先被洗脱下来 结合在基质上的蛋白结合在基质上的蛋白 可用由配体溶液洗脱可用由配体溶液洗脱XiongYanfei30Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH时，它所带的正电时，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pHpH称蛋称蛋白质的白质的等电点等电点。pHpHpIpI时，蛋白质带净负电荷，电场中移向正极时，蛋白质带净负电荷，电场中移向正极pHpHpIpI时，蛋白质带净正电荷，电场中移向负极时，蛋白质带净正电荷，电场中移向负极 pH=pIpH=pI时，蛋白质不带静电荷，电场中不移动。时，蛋白质不带静电荷，电场中不移动。2.8.8 利用蛋白质的带电性可对蛋白质进行电利用蛋白质的带电性可对蛋白质进行电泳分离泳分离l非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在蛋白质在(PAGE)(PAGE)介质中电泳时，其迁移率介质中电泳时，其迁移率 XiongYanfei31Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry聚丙烯酰胺凝胶系统中加入聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDSSDS和少量巯基乙醇和少量巯基乙醇lSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳法：则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量(q/r(q/r），而与电荷和分子形状无关。），而与电荷和分子形状无关。XiongYanfei32Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry SDS SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-SDS-蛋白质蛋白质复合物，电泳时均以同样的复合物，电泳时均以同样的电荷电荷/分子质量分子质量比向正极比向正极移动。移动。改变了蛋白质单体分子的构象。改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-SDS-蛋白质蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,1.8nm,长轴长长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。可用来测量蛋白质的分子量可用来测量蛋白质的分子量XiongYanfei34Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry测定蛋白质含量的常用方法测定蛋白质含量的常用方法：凯氏定氮法：凯氏定氮法：紫外吸收法紫外吸收法双缩脲法：双缩脲法：Folin-Folin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）：考马斯亮蓝法（现最常用的方法）考马斯亮蓝法（现最常用的方法）：胶体金法：胶体金法：带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高变蓝色，灵敏度最高XiongYanfei35Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl蛋白质具有多个结构层次：蛋白质具有多个结构层次：一级结构一级结构二级结构、三级结构、四级结构二级结构、三级结构、四级结构 生物功能生物功能蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序也称共价结构。也称共价结构。l共价肽键是一级结构的唯一连接方式共价肽键是一级结构的唯一连接方式l多肽链一级结构决定着蛋白质的高级结构和功能多肽链一级结构决定着蛋白质的高级结构和功能2.9 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定即蛋白质多即蛋白质多肽链中氨基酸序列的测定肽链中氨基酸序列的测定高级结构高级结构XiongYanfei36Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl测定蛋白质分子中多肽链的数目；测定蛋白质分子中多肽链的数目；l拆分蛋白质分子中的多肽链；拆分蛋白质分子中的多肽链；l测定多肽链的氨基酸组成；测定多肽链的氨基酸组成；l分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端末端（方法很多）（方法很多）l断裂多肽链内的二硫键断裂多肽链内的二硫键；l多肽链断裂成肽段多肽链断裂成肽段；l测定各个多肽段的氨基酸顺序测定各个多肽段的氨基酸顺序；l确定肽段在多肽链中的次序；确定肽段在多肽链中的次序；l确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置。蛋白质一级结构测定策略蛋白质一级结构测定策略XiongYanfei37Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl测得相对分子质量测得相对分子质量Mr 很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，l测定末端氨基酸测定末端氨基酸数数x X (m/Mr)=n(蛋白质分子中肽链数目蛋白质分子中肽链数目)（m为样品质量）为样品质量）l变性：变性：8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/LHCI6mol/LHCI，或高浓度盐溶液，或高浓度盐溶液l如有如有二硫键交联二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理：巯基乙醇，或过氧乙酸处理l凝胶过滤或电泳分离不同肽链凝胶过滤或电泳分离不同肽链蛋白质中多肽链的拆分蛋白质中多肽链的拆分蛋白质中多肽链数目的确定蛋白质中多肽链数目的确定XiongYanfei39Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry氨基酸组成分析氨基酸组成分析酸水解：酸水解：碱水解：碱水解：甲基磺酸水解：甲基磺酸水解：l优点：优点：不破坏色氨酸，不破坏色氨酸，经碱中和后可直接上机自动分析经碱中和后可直接上机自动分析l缺点：缺点：不能有碳水化合物存在不能有碳水化合物存在 中和点不易掌握中和点不易掌握计算出各种氨基酸分子比计算出各种氨基酸分子比多肽链分子量多肽链分子量确定氨基酸组成确定氨基酸组成XiongYanfei40Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry末端氨基酸分析末端氨基酸分析lN末端氨基酸分析末端氨基酸分析丹黄酰氯法丹黄酰氯法(DNS)：优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性定优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性定量；灵敏度高量；灵敏度高(较较二硝基氟苯二硝基氟苯 法法高高100倍倍)二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB or FDNB)法法 氨肽酶法氨肽酶法XiongYanfei42Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry将肽链裂解成小片断将肽链裂解成小片断 要求：断裂点较少，专一性较强、产率高要求：断裂点较少，专一性较强、产率高酶裂解法：酶裂解法：常用的酶：常用的酶：胰蛋白酶：仅断裂胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键羧基形成的肽键（但）（但）糜蛋白酶：糜蛋白酶：位点：位点：Tyr、Phe、Trp羧基肽键羧基肽键 胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键 嗜热菌蛋白酶：专一性较差嗜热菌蛋白酶：专一性较差 金黄色葡萄球菌蛋白酶（金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：蛋白酶）：梭状芽孢杆菌蛋白酶（梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：蛋白酶）：化学裂解法：化学裂解法：溴化氰法：溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键XiongYanfei45Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry肽段氨基酸序列的测定Edman降解法降解法：一次可连续测定：一次可连续测定6070个氨基酸；个氨基酸；程序复杂，工作量大；程序复杂，工作量大；酶降解法：酶降解法：质谱法：质谱法：XiongYanfei46Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryEdman Edman 降解法测定降解法测定N-N-末端氨基酸末端氨基酸Edman reagentPTC-多肽多肽少一个少一个N-末端末端氨基酸的肽链氨基酸的肽链层析色谱鉴定层析色谱鉴定重复重复与与DNS法联合法联合XiongYanfei47Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry肽片断在多肽链中排列次序的确定 (见p179)XiongYanfei48Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry多肽链中二硫键位置的确定多肽链中二硫键位置的确定XiongYanfei49Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954年由英年由英国剑桥大学的国剑桥大学的Sanger实验室建立；现主要由编码蛋实验室建立；现主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导白质的基因的核苷酸顺序推导.l蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库美国生物医学基金会的美国生物医学基金会的PIR(Protein Information Resource or Protein Identification Resource);美国政府的美国政府的Gen Bank(Gene Sequence Data Bank)欧洲的欧洲的EMBL(European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（欧洲分子生物学实验室数据库）（欧洲分子生物学实验室数据库）可从可从“Altas of Protein Sequence and Structure”(蛋白蛋白质序列和结构图册）质序列和结构图册）中查找中查找XiongYanfei50Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryl同源蛋白质：生物体内行使相同或相似功能的蛋白同源蛋白质：生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如质。如脊椎动物的氧运载蛋白脊椎动物的氧运载蛋白，真核生物线粒体中，真核生物线粒体中的的电子传递蛋白电子传递蛋白等均为同源蛋白。等均为同源蛋白。l系列同源性系列同源性(sequence homology)(sequence homology)：同源蛋白的氨基：同源蛋白的氨基酸序列具有明显的相似性，即具有系列同源性。酸序列具有明显的相似性，即具有系列同源性。具有几乎相同的肽链长度；具有几乎相同的肽链长度；在许多对应位置具有相同的不变残基；在许多对应位置具有相同的不变残基；氨基酸残基差异数与物种亲缘关系远近成正比氨基酸残基差异数与物种亲缘关系远近成正比l可以同源氨基酸差异数反应物种亲缘关系可以同源氨基酸差异数反应物种亲缘关系l蛋白质的一结构是其形成特定三级结构和行使蛋白质的一结构是其形成特定三级结构和行使特定功能的基础特定功能的基础2.10 同源蛋白具有序列同源性同源蛋白具有序列同源性(sequence homology)XiongYanfei51Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistry高铁血红蛋白-链和-链肌红蛋白肌红蛋白XiongYanfei52Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryAncestral cytochrome c and Human cytochrome cXiongYanfei53Multimedia Presentation of Multimedia Presentation of BiochemistryBiochemistryCytc系统树系统树