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技术大学课件PCRPCR技术产生得历史背景技术产生得历史背景19711971年年,KhoranaKhorana等人就提出了利用等人就提出了利用PCRPCR在体外扩增在体外扩增DNADNA得概念得概念;Saiki(1985)Saiki(1985)和和Mullis(1986)Mullis(1986)两家研究室分别用改两家研究室分别用改进得进得KleppeKleppe法获得了大量染色体法获得了大量染色体DNADNA单拷贝基因单拷贝基因;19881988年年,ChienChien从水生栖热菌从水生栖热菌(Thermus aquaticus)Thermus aquaticus)中分离出耐热中分离出耐热DNADNA聚合酶聚合酶,简称简称Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶;MullisMullis正式确定了体外扩增正式确定了体外扩增DNADNA技术技术,1987,1987年获得年获得专利专利,命名为命名为Polymerase Chain Reaction(PCR)。PCR反应得基本过程反应得基本过程 PCR PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步延伸三个基本反应步骤构成骤构成:变性变性(denaturation)(denaturation)将模板将模板DNADNA置于置于92929696处理处理,使使dsDNAdsDNA链链解开成为解开成为ssDNAssDNA,以便她与引物结合以便她与引物结合、PCR反应得基本过程反应得基本过程 退火退火(annealing)(annealing)模板模板DNADNA经加热变性成单链后经加热变性成单链后,温度降至温度降至5555左右左右,引物与模板引物与模板DNADNA单链得互补序列配单链得互补序列配对结合成局部双链对结合成局部双链;PCR反应得基本过程反应得基本过程 延伸延伸 DNA DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶得催化作用下得催化作用下,以以dNTPdNTP为反应原料为反应原料,按碱基配按碱基配对与半保留复制原理对与半保留复制原理,引物沿引物沿5353方向延方向延伸伸,最终合成一条新得与模板最终合成一条新得与模板DNADNA链互补得链互补得DNADNA链。链。PCR反应得基本要素反应得基本要素 模板模板DNADNATaqTaq酶酶dNTPdNTP引物引物MgMg2+2+Template DNA模模板板DNADNA得得数数量量与与纯纯度度,就就是是PCRPCR成成败败与与否否得得关关键键环环节节之之一一。但但不不同同类类型型PCRPCR反反应应对对模模板板DNADNA数量与纯度得要求不同。数量与纯度得要求不同。数量数量:3 310106 6个拷贝个拷贝 酵母菌酵母菌 10ng10ng 细菌细菌 1ng 1ng 质粒质粒 1pg1pg 纯度纯度:RAPD OD:RAPD OD260260/OD/OD280280=1=1、6 61 1、9 9 AFLP OD AFLP OD260260/OD/OD280280=1=1、7 71 1、8 8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 来源来源:古细菌嗜热水生菌古细菌嗜热水生菌(thermus aquaticusthermus aquaticus)特点特点:耐耐高高温温,在在7070下下反反应应2 2 h h后后其其残残留留活活性性大大于于90%,90%,在在9595下反应下反应2 2 h h后为后为40%;40%;在在热热变变性性时时不不会会被被钝钝化化,不不必必在在每每次次扩扩增增反反应应后后再加新酶再加新酶;大大大大提提高高了了扩扩增增片片段段特特异异性性和和扩扩增增效效率率,增增加加了了扩增长度扩增长度(2(2、0 0 kb);kb);具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但无无3535外外切切酶酶活性活性,因而对某些单核苷酸错配无校正功能。因而对某些单核苷酸错配无校正功能。大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点 pfu DNA Polymerase 来来源源:就就是是从从Pyrococcus Pyrococcus furiosisfuriosis 中中精精制制而而成成得得高保真耐高温高保真耐高温DNADNA聚合酶。聚合酶。特点特点:她她不不具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但具具有有3535外外切切酶酶活活性性,因因而而可可纠纠正正PCR PCR 过过程程中中产产生生得得错错误误,使产物得碱基错配率极低使产物得碱基错配率极低;PCRPCR产产物物为为平平端端,无无33端端突突出出得得单单A A核核苷苷酸酸,不不能能进行进行T-AT-A克隆。克隆。Vent DNA Polymerase 来来源源:从从嗜嗜热热高高温温球球菌菌(Thermococcus(Thermococcus LitoralisLitoralis)中分离出得。中分离出得。特点特点:不不具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但具具有有3535外外切切酶酶活活性性,可可以以去去除除33错错配配得得碱碱基基,具具有有校校对对功功能能;PCRPCR产产物物为为平平端端,无无33端端突突出出得得单单A A核核苷苷酸酸,不不能能进行进行T-AT-A克隆克隆;PCRPCR产物得扩增长度可达产物得扩增长度可达1010kbkb以上。以上。primers 随随机机引引物物:引引物物为为随随机机设设计计得得短短序序列列,通通常常为为1010bpbp左左右右,扩扩增增产产物物得得非非特特异异性性高高,易易受受扩增条件影响扩增条件影响;特特异异引引物物:引引物物根根据据特特定定得得DNADNA序序列列设设计计而而成成,扩增产物得特异性强扩增产物得特异性强;简简并并引引物物:就就是是根根据据密密码码子子得得简简并并性性原原则则,以以蛋蛋白白质质序序列列中中得得氨氨基基酸酸保保守守区区反反向向设设计计而成得而成得,扩增产物得特异性比较强。扩增产物得特异性比较强。InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3 InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中其中 Y=C/T N=A/T/C/G K=G/T R=A/G 简并引物简并引物 PCR反应体系得基本成分反应体系得基本成分 1010PCRPCR Buffer Buffer MgClMgCl2 2或或MgSOMgSO4 4 dNTPdNTP Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物引物(随机引物或特异引物随机引物或特异引物)模板模板DNA DNA Taq DNATaq DNA polymerase polymerase ddHddH2 2O O 常规常规PCR反应体系反应体系10PCR Buffer 2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul dNTP(10mM)0、2ul Forward primer(10uM)1、0ul Reverse primer(10uM)1、0ul 模板模板DNA 50ng Taq酶酶(5U/ul)0、2ul ddH2O to 25ulPCR引物设计得基本原则引物设计得基本原则 合理得设计可在扩增得特异性和有效性之间找到一个平衡点。1 引物长度通常1830bp;2 解链温度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3 GC含量以40%60%为宜,GC太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带;PCR引物设计得基本原则引物设计得基本原则 4 ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列;5 避免引物内部出现二级结构,以及避免两条引物间互补,特别就是3端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带;6 引物3端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;7 引物中有或能加上合适得酶切位点,被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;8 引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其她序列无明显同源性。361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT 481 GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT 481 GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT 541 GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT 541 GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT 601 CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT 601 CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT 661 TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC 661 TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC 721 CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT 721 CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT dNTPs dNTP得质量、浓度与PCR扩增效率有密切关系,dNTP溶液得pH为7、07、5,小量分装,-20冰冻保存。反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50200umol/L,尤其就是注意4种dNTP得摩尔浓度要相等,如果其中任何一种浓度不同,就会引起错配。dNTP能与Mg2+结合,使游离得Mg2+浓度降低。Mg2+浓度 Mg2+就是激活DNA polymerase得活性中心。Mg2+对PCR得特异性和产量有显著得影响,在 一 般 得 PCR反 应 中,各 种 dNTP浓 度 为200umol/L时,Mg2+浓度以1、52、0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶得活性,使反应产物减少。常规常规PCR反应体系反应体系10PCR Buffer 2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul dNTP(10mM)0、2ul Forward primer(10uM)1、0ul Reverse primer(10uM)1、0ul 模板模板DNA 50ng Taq酶酶(5U/ul)0、2ul ddH2O to 25ul PCR反应得平台期效应 在反应初期,靶序列DNA片段得增加呈指数形式,随着PCR产物得逐渐积累,被扩增得DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期效应。PCR反应得平台期效应反应得平台期效应PCR反应得平台期效应影响因子:1 体系不适合(引物、dNTP得量)2 DNA聚合酶得种类和活性 3 非特异性产物得竞争 PCR反应程序优化得基本原则1 温度与时间得设置 在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在9095变性,再迅速冷却至4060,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至7075,在Taq DNA聚合酶得作用下,引物链沿模板延伸。较短靶序列(长度为100300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外,退火与延伸温度可合二为一,一般采用94变性,65左右退火与延伸。变性温度与时间 变性温度低,解链不完全就是导致PCR失败得最主要原因。一般情况下,9394 l min足以使模板DNA变性,但温度过高对酶得活性有影响。此步若不能使模板DNA完全变性,就会导致PCR失败。退火温度与时间 退火温度就是影响PCR特异性得较重要因素。退火温度与时间,取决于引物得长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列得长度:Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)延伸温度与时间 PCR反应得延伸温度常用72。PCR延伸反应得时间,可根据待扩增片段得长度而定:1 kb得靶序列 延伸时间1min;34kb得靶序列 延伸时间34min;10kb以上得靶序列 延伸时间15min。2 循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA得浓度。一般得循环次数选在2540次之间,循环次数越多,非特异性产物得量亦随之增多。加样加样加样加样扩增扩增扩增扩增电泳电泳电泳电泳观测观测观测观测结果分析结果分析结果分析结果分析PCR流程流程PCR得优点1 特异性强 PCR反应得特异性决定因素为:引物与模板DNA特异正确得结合;碱基配对原则;Taq DNA聚合酶合成反应得忠实性;靶基因得特异性与保守性。2 灵敏度高 能将pg级得起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒得检测中,PCR得灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。3 简便、快速 PCR反应用耐高温得Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在PCR仪上进行扩增反应,一般在24小时完成。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。4 对样本DNA得纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制得DNA样品进行PCR检测。PCR过程中常出现得问题假阴性:不出现扩增条带 原因:1、模板 2、酶 3、引物 4、Mg2+5、反应体积得改变 6、物理原因 7、靶序列变异 1 模板 模板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消化除净,特别就是染色体中得组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模板核酸变性不彻底。2 酶失活 需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。需注意得就是有时忘加Taq酶。3 引物 引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散得常见原因。有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:选定一个好得引物合成单位。引物得浓度不仅要看OD值,更要注重引物做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致。如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。对策为:引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。重新设计引物。4 Mg2+浓度 Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增得特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。5 反应体积得改变 通常进行PCR扩增采用得体积为20ul、30ul、50ul,应用多大体积进行PCR扩增,就是根据科研和临床检测不同目得而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。6 物理原因 变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板得结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准得温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内得变性、退火和延伸温度,这也就是PCR失败得原因之一。7 靶序列变异 如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功得。假阳性假阳性:出现得出现得PCRPCR扩增条带与目得靶序列条带一扩增条带与目得靶序列条带一致致,有时其条带更整齐有时其条带更整齐,亮度更高。亮度更高。原因原因:引物设计不合适引物设计不合适;靶序列或扩增产物得交叉污染。靶序列或扩增产物得交叉污染。1 引物设计不合适 选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出得PCR产物为非目得性得序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。2 靶序列或扩增产物得交叉污染 这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段得交叉污染,导致假阳性。解决措施:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温得物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在得核酸。