蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化层析技术.pptx

蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化层析技术引言引言n层析法得发现与进化历史 思想思想层析法得基本原理层析法得基本原理n根据引言内容,就是否可以总结概括出层析法得基本原理？层析法得分类层析法得分类第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)引言1850年德国科学家朗格首先发现了色谱分离得现象,当她把一种有颜色得物质滴到一张滤纸上,观察到它们扩散成一圈圈得圆环。探索与发现 11906年俄国植物学家茨维特(Michael Tswett):将碳酸钙细粉装入玻璃瓶,石油醚抽提叶子得色素溶液倾入,接着倒入石油醚洗涤,柱上部出现了绿色得叶绿素,中间就是黄色得叶黄素叶黄素,而在下面则就是胡萝卜素橙黄色色带叫作“色谱”,方法叫色谱法(Chromatography),层析法。探索与发现 2概念:固定相,流动相,色谱柱现代色谱柱图有误Which is which?1905-1930、Who cares!Why？1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验,用氧化铝与碳酸钙分离了-,-,与-胡萝卜素,此后用这种方法分离了60多种这类色素,1938年她从维生素B中分离出B6、1938年得诺贝尔化学奖。探索与发现 3Why not Tswett?Why not Tswett?论文发表在不知名得期刊上相同时期发生在中国大地得事件相同时期发生在中国大地得事件1894年:中日甲午战争,侵占台湾。1897年:德国侵占胶州湾。1900年:八国联军侵略中国。1914年:占领青岛,夺取胶州湾。1931年:九一八事变,占领东北,建立满州国。1937年:卢沟桥事变。1941年生物化学家Martin(马丁)与Synge(辛格)把色谱法应用于氨基酸得分离。将淀粉作为色柱里得填料:淀粉色谱法滤纸作为载体:纸色谱法覆盖了吸附剂表面得并与流动相不发生混溶得固定液来代替以前得固体吸附剂:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC)、提出色谱塔板理论;预测气相色谱;提出用细小颗粒作填料,而两端可以加压(HPLC)、1952年:马丁,辛格对分配层析得研究与发现,诺贝尔化学奖羊毛中得氨基酸分离探索与发现 4塔板理论塔板理论n将色谱柱瞧作一个分馏塔,待分离组分在分馏塔得塔板间移动,在每一个塔板内不同组分分子在固定相与流动相之间形成平衡,随着流动相得流动,组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板,并不断形成新得平衡 大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点1952年，马丁同詹姆斯(James)，把LLC技术原理应用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合的气体通过后,在另一端出现时就分开了。气相色谱得产生(GC)探索与发现 5高效液相色谱(HPLC)得应用20世纪60年代以来,气相色谱作为分析方法已经不能满足对生物成分分析测试得要求。高效液相色谱采用了压力泵及填有很细得颗粒高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography、探索与发现 6液相色谱与气相色谱法比较 气相液相对象气体,沸点低液相,沸点高固定相固体,固体涂层液固体,固液流动相惰性气体,起运载作用液体,与组分可产生亲与力环境高温常温应用化工分析,环境生物分子,蛋白核酸,医药层析法得基本原理层析法得基本原理n层析法就是利用混合物中各组分物理、化学性质(如吸附力、分子形状及大小、分子亲与力、分配系数等)得差异使各组分在两相(固定相与流动相)中得分布程度不同,从而使各组分以不同得速度移动而达到分离得目得。物理、化学性质物理、化学性质(如吸附力、分子形状及大小、分子亲与力、分配系数等)(1)按流动相状态分类:液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析层析法得分类层析法得分类两种固定相:(固定相不一定就是固体)*固体吸附剂作为固定相*吸附在固体上得液体(硅胶吸附得水作固定相,以氯仿作流动相,分离羊毛中得氨基酸)(2)按层析原理分类:吸附层析:利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 得差异,达到分离鉴定得目得。分配层析:利用不同组分在流动相与固定相之间 得分配系数(或溶解度)不同。离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲与 力得不同。凝胶层析:利用某些凝胶对于不同分子大小得组 分阻滞作用得不同。(3)按操作形式不同分类:柱层析:将固定相装于柱内,使样品沿一个方 向移动而达到分离。纸层析:用滤纸做液体得载体,点样后,用流 动相展开,以达到分离鉴定得目得。薄层层析:将适当粒度得吸附剂铺成薄层,类 似纸层析。层析技术第一节第一节 吸附层析技术吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)第一节第一节 吸附层析技术吸附层析技术吸附柱层析吸附柱层析薄层层析薄层层析聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析疏水层析疏水层析吸附柱层析吸附柱层析吸附柱层析就是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状得一种层析方法。常用得吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石与活性炭等。这种层析方法已成为科研、医学、化工及发酵等部门常规使用得一种分离手段。吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语1、层析:以基质为固定相(柱状或薄层状),以液体或气体为流动相,有效成分与杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附、交换作用,最终结果就是使混合物得到分离。吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语2、洗脱体积(Ve):就是指某一成分从柱顶部到底部得洗脱液中出现浓度达到最大值时得流动相体积。第一节第一节 吸附层析技术吸附层析技术吸附柱层析吸附薄层层析聚酰胺薄膜层析疏水层析薄层层析薄层层析(TLC)薄层层析就是以涂布于玻板或涤纶片等载体上得基质为固定相,以液体为流动相得一种层析方法。薄层层析可根据固定相得种类分为吸附薄层层析(吸附剂为固定相)、分配薄层层析(固定在支持剂上得水溶液或有机溶剂为固定相)与离子交换薄层层析(离子交换剂为固定相)等。薄层层析薄层层析薄层层析得优点:1、展层时间短,薄层层析分离混合物一般 仅需15-60min;2、设备简单,操作方便,既适用于分析,也适用于制备;3、灵敏度高。薄层层析薄层层析纸色谱法(分配TLC,纤维结构,固定相就是纤维-水)吸附TLC固定相就是硅胶,氧化铝等,层析就是依据吸附力不同第三章第三章 层析技术层析技术第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)第二节分配层析技术第二节分配层析技术分配层析法(液-液层析法,LLC)原理:利用混合物在两种不相混溶得液相(固定相与流动相)之间得分配系数得不同而达到分离各组分得目得。固定相液体均匀覆盖于载体表面,流动相流过固定相。分配系数:当一种溶质分布在两个互不相溶得溶剂中时,它在流动相与固定相两相内得浓度之比就是个常数,称为分配系数。K=c1/c2v分配系数小得溶质在流动相中得分配得数量多,移动慢;分配系数大得溶质在固定相分配得数量多,移动快。因此可彼此分开。hH(分配TLC,纤维结构,固定相就是纤维-水)纸色谱法第四章第四章 层析技术层析技术第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)第三节第三节 凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析技术一、基本原理 概念:当生物大分子通过装有凝胶颗粒得层析柱时,因分子大小不同而分离。又名分子筛层析。原理原理:凝胶颗粒为多孔网状结构。混合物流过时,比凝胶孔径大得分子不能进入凝胶孔内,在凝胶颗粒之间得空隙向下移动,并最先被洗脱出来;比网孔小得分子能不同程度得自由出入凝胶孔内外,在柱内经过得路程较长移动速度较慢,最后被洗脱出来。吸收 洗脱体积 ml凝胶1.固定相与流动相:凝胶层析得固定相就是惰性得珠状凝胶颗粒,流动相就是流动得洗脱液。2.排阻极限:指不能进入凝胶颗粒孔穴内部得最小分子得分子量。排阻极限为30000表示30000Da得分子将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。3、凝胶颗粒大小常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示。分辨率与流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大,流速快,但分离效果差;颗粒小,分离效果较好,但流速慢。100目0、250毫米。二、常用概念三、凝胶得种类与性质 1、交联葡聚糖凝胶(Sephadex)1)Sephadex G(Sephadex G-25;Sephadex G-50)G后得数字为凝胶吸水率(单位就是ml/g干胶)得10倍。2)Sephadex LH-20,就是Sephadex G-25得羧丙基衍生物,溶于水与亲脂性溶剂,用于分离不溶于水得物质。交联葡聚糖凝胶就是由葡聚糖与甘油基通过醚桥交联而成得。2、琼脂糖凝胶(Sepharose;Bio-Gel)依靠糖链之间得次级键维持网状结构,琼脂糖密度 越大,网状结构越密集。3、Superdex 就是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成 得。分辨率非常高,化学物理稳定性也很好。4、聚丙烯酰胺凝胶 一种人工合成得凝胶,以丙烯酰胺为单位,由甲叉 双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多,孔隙度越小。商品名为生物胶-P(Bio-Gel P)。凝胶技术参数指标凝胶技术参数指标凝胶型号凝胶型号:如如SephadexG-10;G-25;SephadexG-10;G-25;粒度范围粒度范围:100-200mesh100-200mesh床体积床体积(ml/gml/g):每克干胶溶涨后得体积每克干胶溶涨后得体积有效分离范围有效分离范围:如如1x101x103 3 1x101x107 7工作工作pH:4-12pH:4-12最大流速最大流速:1 ml/min1 ml/min最大承受压力最大承受压力:2MPa:2MPa三、凝胶得选择与保存1、凝胶得选择凝胶得选择例如样品中各个组分差别较大,则可以选用大颗粒得凝胶,这样可以很快得达到分离得目得;如果有个别组分差别较小,则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。2 2、凝胶得保存凝胶得保存凝胶得保存一般就是反复洗涤去除蛋白等杂质,然后加入适当得抗菌剂,通常加入0、02得叠氮化钠,或20%酒精,4C下保存。四、凝胶过滤在试验室中得应用1)生物大分子物质得分离纯化2)分子量得测定3)脱盐及去除小分子杂质4)溶液浓缩5)去热源物质LogMABCLogM测Ve蛋白质通过凝胶柱得速度即洗脱体积与其分子量有关,LogM=(k1-k2)Ve(Ve为洗脱体积)先测得几种标准蛋白质得Ve,并以其分子量对数对Ve作图得一直线,再测出待测样品得Ve,查标准曲线即可确定分子量。第四章第四章 层析技术层析技术第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)一、原理:就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。n离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。第四节 离子交换层析法纤维素 O CH2 COO-Na+图 纤维素阳离子交换剂组成示意图n离子交换层析得基本原理示意图离子交换层析得基本原理示意图+二、离子交换基质得分类及常见种类:(一一)分类分类 阳离子交换剂阳离子交换剂:磺酸磺酸(-SO-SO3 3H H)、磷酸、磷酸(-PO-PO3 3H H2 2 )、羧酸羧酸(-COOH-COOH)、酚羟基、酚羟基(-OH-OH)等等 阴离子交换剂阴离子交换剂:伯胺伯胺(-NH-NH2 2OHOH)、仲胺、仲胺(-NHCH-NHCH3 3OH OH)、叔胺叔胺(-N-N(CHCH3 3)2 2OHOH)、季胺、季胺(-N-N(CHCH3 3)3 3OHOH)等等 (二二)种类种类 1 1)树脂型离子交换剂树脂型离子交换剂 2 2)纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂 3 3)交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂 4 4)琼脂糖离子交换剂琼脂糖离子交换剂三、离子交换剂得再生与保存离子交换剂可在柱上再生也可室内瓶装保存。离子交换剂可在柱上再生也可室内瓶装保存。如离子交换纤维素可用如离子交换纤维素可用2mol/LNaCl2mol/LNaCl淋洗柱淋洗柱,若有强吸附物则若有强吸附物则可用可用0 0、1mol/L NaOH1mol/L NaOH洗柱洗柱;若有脂溶性物质则可用非离子型若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤也可用乙醇洗涤,其顺序为其顺序为:0 0、5mol/L 5mol/L NaOH-NaOH-水水-乙醇乙醇-水水-20-20NaOH-NaOH-水。水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0 0、002002洗必泰洗必泰,阳离子交换剂可用阳离子交换剂可用0 0、0202叠氮钠。叠氮钠。四、离子交换层析得实验室应用n除去离子除去离子(纯净水纯净水)聚苯乙烯树脂广泛得应用于高纯水得制备、硬聚苯乙烯树脂广泛得应用于高纯水得制备、硬水软化以及污水处理等方面水软化以及污水处理等方面 n分离纯化分离纯化n改变成分改变成分(青霉素青霉素-Na-Na青霉素青霉素-K-K)n浓缩与提取浓缩与提取(抗生素、蛋白质、工业废液中微量抗生素、蛋白质、工业废液中微量金属得提取金属得提取)n离子型化合物分离离子型化合物分离n发展发展:自动化方向自动化方向与光谱技术结合专门用途得综合性自动分析与光谱技术结合专门用途得综合性自动分析仪与计算机相连进行自动分析与自动控制仪与计算机相连进行自动分析与自动控制第四章第四章 层析技术层析技术第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析(HPLC)原理:利用生物大分子间特异得亲与能力来纯化生物大分子,如:抗原与抗体;酶与底物或辅酶或抑制剂;激素与受体等。n亲与层析包括三个共价结合得组分亲与层析包括三个共价结合得组分:不溶性不溶性得基质得基质(matrix matrix)、一个间隔臂、一个间隔臂(spacerspacer)及及特异得配基特异得配基(ligandsligands)第五节第五节 亲与层析法亲与层析法目前亲与层析技术主要运用在实验室中目前亲与层析技术主要运用在实验室中 FractionandmonitoringVolumeofeluentAbsorbanceFractions123456789Anactualexampleforgel-filtrationSDS-pageanalysis第四章第四章 层析技术层析技术第一节 吸附层析技术第二节 分配层析技术第三节 凝胶过滤层析技术第四节 离子交换层析法第五节 亲与层析法第六节 高压液相层析高压液相层析(HPLC)HPLC)第六节第六节 高压液相层析高压液相层析(HPLCHPLC)特点:使用得固相支持剂颗粒很细,表面积很大,因而分辨率很高、(颗粒细颗粒细,理论塔板数多理论塔板数多)溶剂系统采用高压,因此洗脱速度增大。(颗粒硬度大、流颗粒硬度大、流速快速快,耐高压耐高压)重复性好 色谱柱可以反复使用 自动化操作,分析精确度高许多类型得柱层析都可用HPLC来代替,如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。n分类分类 正相色谱法:共价结合到载体上得集团都就是极性得集团,流动相得极性比固定相得极性弱。在这种层析过程中非极性分子或极性小得分子比极性大得分子移动得速度 ,先从柱中流出来。反相色谱法 共价结合到载体上得集团就是一些直链碳氢化合物,流动相得极性比固定相得极性强。在这种层析过程中,极性大得分子比极性小得分子移动得速度 而先从柱中流出。快快快快n一般来说一般来说,分离纯化极性大得分子分离纯化极性大得分子(带电离子等带电离子等)采用正相色谱采用正相色谱(或正相柱或正相柱),),而分离纯化极性小得而分离纯化极性小得有机分子有机分子(有机酸、醇、酚等有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱多采用反相色谱(或反相柱或反相柱)。n实践中实践中,一种物质如蛋白得分离纯化往往不就是一种物质如蛋白得分离纯化往往不就是单一实验技术能够达到得。单一实验技术能够达到得。Whatdoesthismean？n层析基本原理n固相,流动相,色谱柱得概念n洗脱体积,洗脱曲线得概念n凝胶过滤层析 n高压液相层析n离子交换层析 n亲与层析 n吸附层析 n分配层析(薄层层析)吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语1、固定相:就是由层析基质组成得。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)与液体物质(如固定在纤维素或硅胶上得溶液),这些物质能与相关得化合物进行可逆得吸附、溶解与交换作用。2、流动相:在层析过程中推动固定相上得物质向一定方向移动得液体或气体称为流动相。在柱层析时,流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析时流动相又称展层剂。吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语2、操作容量:即在特定条件下,某成分与基质反应达到平衡时,存在于基质上得饱与容量。一般以每克(或毫升)基质结合某种成分得毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大,表明基质对某种成分得结合力强,否则反之。吸附柱层析吸附柱层析二、基本原理吸附层析法(液-固层析法,LSC)原理:利用固定相得固体吸附剂表面对不同组分吸附力得大小及洗脱液对它得溶解度得差异进行分离。成分得成分得极极性性决决定定于于其分子中所其分子中所含官能基含官能基团团得得极极性性与与分子分子结构结构,物物质质得得极极性越大性越大则则越容易越容易被被固体吸附剂固体吸附剂(硅胶硅胶或氧化或氧化铝铝)吸附吸附。特点:适合分离不同种类(例如分离醇与芳香烃)得化合物。三、吸附剂1、吸附剂得选择及预处理:活性多孔固体,表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强与成本低廉等性能。常用得吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。n羟基羟基磷灰石(HA)Ca10(PO4)6、(OH)2,可用于分离蛋白质、酶、核酸及病毒等生命物质。其表面有Ca2+与PO43-两种带电基团。n羟基磷灰石层析在实验室中最大得用途就是分离双链DNA与单链DNA。亦可除去混合物中得DNA。三、吸附剂硅胶(Silica gel):略带酸性,适用于酸性与中性样品之分离,碱性样品容易产生反应或拖尾。A、含水量活性硅胶就是多孔得、表面含有很多硅醇基团(-Si-OH)颗粒状极性吸附剂。含水量高时,则结合力小(或活性小)。B、粒度供层析用得氧化铝,用于拄层析得,其粒度要求在100160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与氧化铝得用量比,一般在1:2050之间层析柱得内径与柱长比例在1:10-20之向。三、吸附剂活性炭(Silica gel)：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。吸附原理吸附原理:吸附剂与被吸附物质之吸附剂与被吸附物质之间得吸引力就是范德华力间得吸引力就是范德华力,作用可逆作用可逆吸附层析得应用氨基酸、肽、糖类、脂类、苷氨基酸、肽、糖类、脂类、苷(皂苷皂苷)类物质得分离、鉴定类物质得分离、鉴定纯净水、医药用水得制备纯净水、医药用水得制备药液脱色药液脱色薄层层析薄层层析一、操作及注意事项:一般层析操作包括薄板制备、点样、展层、显色、Rf值测定与结果分析等步骤。1、薄层板得制备(1)硅胶得分类:硅胶G系含有10%15%锻石膏与5%淀粉得硅胶,黏性好;硅胶CMC系含有适量羧甲基纤维素得硅胶;硅胶HF254系含有荧光剂得硅胶H;薄层层析薄层层析(Thin layer chromatography)一、操作及注意事项:一般层析操作包括薄板制备、点样、展层、显色、Rf值测定与结果分析等步骤。1、薄层板得制备(2)硅胶薄层板得制备玻板:洗净;20cm20cm;6cm20cm制板:涂布方法(玻棒涂布法、有机玻璃尺涂布法、半机械涂布法);注意事项:颗粒均匀细小(200目);厚度均一适中(0、25mm-0、5mm-1mm);2、点样(2mm)3、展层 4、显色聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析1966年之后发展起来得一种层析方法;特别应该指出得就是,用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸时,具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速与操作简便等优点。可用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、环酮、维生素B与杀虫剂 等16类化合物。Gas ChromatographyUsedtodeterminethechemicalcompositionofunknown substances,such as the differentcompoundsingasolineshownbyeachseparatepeakinthegraphbelow.Liquid ChromatographyUsed to identify unknown plantpigments&otherpounds、Examples of ChromatographyPaper ChromatographyCanbeusedtoseparatetheponentsofinks,dyes,plantpounds(chlorophyll),make-up,and manyothersubstancesThin-Layer ChromatographyUsesthinplasticorglasstraysto identify the position ofpigments,chemicals,andotherunknownsubstances、聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析基本原理:聚酰胺对极性物质得吸附作用就是由于它能与被分离物之间形成氢键。这种氢键得强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力得大小。由己二酸与己二胺聚合而成CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺n样品上柱样品上柱分析用量分析用量:柱床体积得柱床体积得1 12%2%制备用量制备用量:柱床体积得柱床体积得202030%30%n洗脱收集洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪部分收集器、核酸蛋白检测仪2、凝胶得处理及装柱凝胶得处理及装柱凝胶干粉得溶胀凝胶干粉得溶胀(热溶胀或冷溶热溶胀或冷溶)、浮选、抽气、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查装柱、蓝色葡聚糖检查(有色物质有色物质)、平衡、平衡