4水产品中红霉素残留检测液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS G ICS G 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 296842013 食品安全国家标准 水产品中红霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of Erythromycin residues in aquatic products by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric method （电子版本仅供参考，以标准正式出版物为准）2013-09-16 发布 2014-01-01 实施 中华人民共和国农业部 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 I 目目 次次 目 次.I 前 言.II 水产品中红霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.1 范围.2 规范性引用文件.3 原理.4 试剂和材料.5 仪器和设备.6 试料的制备与保存.6.1 试料的制备.6.2 试料的保存.7 测定步骤.7.1 提取.7.2 净化.7.3 标准曲线的制备.7.4 测定.7.5 空白试验.8 结果计算和表述.9 检测方法灵敏度、准确度、精密度.9.1 灵敏度.9.2 准确度.9.3 精密度.附录 A .II 前前 言言 本标准的附录 A 为资料性附录。本标准系国内首次发布的国家标准。水产品中红霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围范围 本标准规定了水产品中红霉素残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于水产品可食性组织中红霉素残留量的检测。2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 3016 水产品抽样方法。3 原理原理 试料中残留的红霉素，用乙腈提取，正己烷除脂，HLB 柱净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。4 试剂和材料试剂和材料 以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。4.1 红霉素标准品：含量97%。4.2 红霉素同位素内标物标准品：红霉素同位素（erythromycin A，N，N-Dimethyl-13C2）含量90%。4.3 乙腈：色谱纯。4.4 正己烷：色谱纯。4.5 甲醇：色谱纯。4.6 乙酸 4.7 氯化钠 4.8 十二水磷酸氢二钠 4.9 磷酸 4.10 HLB固相萃取柱：200 mg/6 mL，或相当者。4.11 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液：取十二水磷酸氢二钠 17.92 g，用水溶解并稀释至 500 mL，用磷酸调pH 值至 8.0，现配现用。4.12 40%甲醇溶液：取甲醇 40 mL，用水溶解并稀释至 100 mL。4.13 30%甲醇溶液：取甲醇 30 mL，用水溶解并稀释至 100 mL。4.14 0.01 乙酸水溶液：取乙酸 10 L，用水溶解并稀释至 1 000 mL。4.15 100 g/mL 红霉素标准贮备液：精密称取红霉素标准品 10 mg，于 100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 的红霉素标准贮备液。-18 以下避光保存，有效期 6 个月。4.16 5 g/mL 红霉素标准工作液：精密量取 100 g/m 红霉素标准贮备液 500 L，于 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为 5 g/mL 的红霉素标准工作液。-18 以下避光保存，有效期 3 个月。4.17 100 g/mL 红霉素同位素内标物标准贮备液：精密称取红霉素同位素内标物标准品 10 mg，于 100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100 g/mL 红霉素同位素内标物标准贮备液。-18 以下避光保存，有效期 6 个月。4.18 200 ng/mL 红霉素同位素内标物标准工作液：精密量取 100 g/mL 红霉素同位素内标物标准贮备液 200 L，于 100 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为 200 ng/mL 的红霉素同位素内标物标准工作液。-18 以下避光保存，有效期 3 个月。5 仪器和设备仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2 分析天平：感量 0.000 01 g。5.3 天平：感量 0.01 g。5.4 振荡器 5.5 均质机 5.6 离心机 5.7 酸度计 5.8 旋转蒸发仪 5.9 茄形瓶：100 mL。5.10 离心管：50 mL。5.11 滤膜：0.22 m。6 试料的制备与保存试料的制备与保存 6.1 试料的制备 取水产品空白或供试可食性组织，绞碎，并使均质。取均质后的供试样品，作为供试试料。取均质后的空白样品，作为空白试料。取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2 试料的保存-20以下保存，保存期3个月。7 测定步骤测定步骤 7.1 提取 称取试料（5 0.05）g，于50 mL离心管中，加200 ng/mL红霉素同位素内标物标准工作液50 L，加乙腈15 mL，立即搅拌使其分散，超声5 min，振荡5 min，4000 r/min离心10 min，取上清液，于另一离心管中，残渣中加乙腈5 mL，重复提取一次，合并两次上清液，加氯化钠2 g和正己烷15 mL，振荡5 min，4 000 r/min离心10 min，弃上层正己烷液，取下层液，于100 mL茄形瓶中，于40旋转蒸发至干，用磷酸盐缓冲溶液5 mL，溶解残余物，加正己烷5 mL，混合1 min，转至离心管中，6 000 r/min离心5 min，弃正己烷层，再加正己烷5 mL，重复操作一次，取下层溶液，备用。7.2 净化 HLB柱依次用甲醇5 mL、水5 mL和磷酸盐缓冲溶液5 mL活化，取备用液过柱，用磷酸盐缓冲液5 mL洗涤离心管，洗涤液过柱，流干，依次用水5 mL和40%甲醇溶液5 mL淋洗，抽干，用甲醇8 mL洗脱，收集洗脱液，于茄形瓶中，于40旋转蒸发至干，用30%甲醇溶液1.0 mL溶解残余物，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.3 标准曲线的制备 精密量取 5 g/mL 红霉素标准工作液和 200 ng/mL 红霉素同位素内标物标准工作液适量，用 30%甲醇溶液溶解并稀释，配制成红霉素同位素内标物浓度为 10 ng/mL 以及红霉素浓度为 1、5、10、25、50、100 和 500 ng/mL 的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。7.4 测定 7.4.1 液相色谱条件 色谱柱：C18（150 mm 2.1 mm，粒径5 m），或相当者；流动相：A：甲醇，B：0.01 乙酸水溶液；梯度洗脱：0.01.0 min，30A；1.017 min，95A；7.0117 min；30A；流速：0.3 mL/min；柱温：25；进样量：25 L。7.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：4 700 V；离子传输毛细管温度：300；源内碰撞诱导解离电压：8 V；雾化气流速：12.3 L/h；辅助气流速：1.7 L/h；定性、定量离子对和碰撞能量见表1。表1 定性、定量离子对和碰撞能量 目标化合物 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 碰撞能量 eV 红霉素 734.4157.9 734.4157.9 27 734.4576.0 20 红霉素同位 素内标物 736.5159.9 736.5159.9 30 7.4.3 测定法 7.4.3.1 定性测定 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过 20%，则可判断试样中存在相应的被测物。7.4.3.2 定量测定 取试样溶液和标准溶液，按外标法，以峰面积定量，标准溶液及试样溶液中的红霉素响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，红霉素标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图见附录A。7.5 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。8 结果计算和表述结果计算和表述 试料中对红霉素的残留量（g/kg）：按下式计算 mVCX 式中:X 供试试料中红霉素的残留量，g/kg；C 试样溶液中红霉素的浓度，ng/mL；V溶解残余物所用体积，mL；m 供试试料质量，g。注：计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 检测方法灵敏度、准确度、精密度检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1 灵敏度 本方法的检测限为0.5 g/kg，定量限为1 g/kg。9.2 准确度 本方法在1400 g/kg添加浓度水平上的回收率为70%120%。9.3 精密度 本方法的批内相对标准偏差15%，批间相对标准偏差15%。附 录 A（资料性附录）图 A1 红霉素及红霉素同位素内标物标准溶液特征离子质量色谱图（25 ng/mL）图 A2 草鱼可食性组织空白试样特征离子质量色谱图 图 A3 草鱼可食性组织空白添加红霉素试样特征离子质量色谱图（5 g/kg）1红霉素特征离子质量色谱图（734.4575.9）；2红霉素特征离子质量色谱图（734.4159.9）；3红霉素同位素特征离子质量色谱图（736.50159.9）。