骨痨愈康丸通过JAK_STAT信号通路对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1475-1482杂志网址：http:/骨痨愈康丸通过JAK/STAT信号通路对类风湿关节炎大鼠滑膜组织的影响*李金益1，田杰祥2，宋敏1，2，王凯1，李凯1，胡阳1，刘路1（1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020）摘要 目的：观察骨痨愈康丸（GLYK）对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠滑膜组织的影响，探讨GLYK治疗类风湿关节炎的作用机制。方法：将70只Wistar大鼠，随机分为正常对照（control）组、CIA组、甲氨蝶呤（MTX）组、GLYK组、GLYK+Janus激酶（JAK）受体酪氨酸激酶抑制剂AG490（GLYK+AG490）组和AG490组。除control组外，其余5组建立CIA大鼠模型，每组10只。用药4周后，观察各组大鼠踝关节病理形态；ELISA法检测关节液中白细胞介素6（IL-6）、IL-17、IL-1、肿瘤坏死因子（TNF-）和基质金属蛋白酶3（MMP-3）水平；RT-qPCR与Western blot检测各组大鼠踝关节滑膜组织中JAK2、JAK3、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）和SOCS3的mRNA及蛋白表达。结果：CIA组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3的水平、滑膜组织中 JAK2、JAK3 和 STAT3 蛋白及相关 mRNA 的表达较 control 组显著升高（P0.01），SOCS1 和 SOCS3 蛋白及相关mRNA的表达较control组显著下降（P0.01）；MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组和AG490组关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3的水平、滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3蛋白及相关mRNA的表达较CIA组显著下降（P0.05）；MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组、AG490组SOCS1和SOCS3蛋白及相关mRNA的表达较CIA组显著升高（P0.05）。结论：GLYK能有效减轻CIA大鼠炎症反应，其机制可能与抑制JAK/STAT信号通路及调节相关蛋白表达有关。关键词 类风湿关节炎；骨痨愈康丸；滑膜；JAK/STAT信号通路中图分类号 R593.22；R684.3 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.016Effect of Gulao-Yukang pills on rheumatoid arthritis rat synovial tissue via JAK/STAT signaling pathwayLI Jinyi1，TIAN Jiexiang2，SONG Min1，2，WANG Kai1，LI Kai1，HU Yang1，LIU Lu1（1Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2The Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730020，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：This study aims to evaluate the therapeutic effects and regulatory mechanisms of Gulao-Yukang pills（GLYK）on collagen-induced arthritis（CIA）in rat models.METHODS：Seventy Wistar rats were randomly categorized into six groups：normal control，CIA，methotrexate（MTX），GLYK，GLYK supplemented with Janus kinase（JAK）receptor tyrosine kinase inhibitor AG490（GLYK+AG490），and AG490 alone groups.A CIA rat model was established in all groups except control group，each containing 10 rats.After a four-week pharmacological intervention，pathological alterations of the ankle joints were examined in all groups.ELISA was employed to quantify interleukin-6（IL-6），IL-17，IL-1，tumor necrosis factor-（TNF-）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in the synovial fluid.Moreover，the expression levels of JAK2，JAK3，signal transducer and activator of transcription 3（STAT3），suppressor of cytokine signaling 1（SOCS1）and SOCS3 proteins and their respective mRNA were analyzed using RT-qPCR and Western blot.RESULTS：The rats in CIA group displayed significantly elevated levels of IL-6，IL-17，IL-1，TNF-and MMP-3 in synovial fluid（P0.01），and increased mRNA and protein levels of JAK2，JAK3 and STAT3 in the synovial tissue（P文章编号 1000-4718（2023）08-1475-08 收稿日期 2022-10-31 修回日期 2023-06-30*基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81960832）；甘肃中医药大学研究生创新基金资助项目（No.2022CX26）；省自然科学基金资助项目（No.22JR11RA131）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：14750.01）.Simultaneously，SOCS1 and SOCS3 proteins and related mRNA levels were considerably diminished（P0.05）.Conversely，the rats in MTX，GLYK，GLYK+AG490 and AG490 groups demonstrated a significant reduction in the aforementioned markers compared with CIA group（P0.05）.Moreover，the expression of SOCS1 and SOCS3 proteins and related mRNAs markedly increased in MTX，GLYK，GLYK+AG490 and AG490 groups compared with CIA group（P0.05）.CONCLUSION：Gulao-Yukang pills significantly attenuate the inflammatory response in CIA rat model.This beneficial effect appears to be correlated with the inhibition of the JAK/STAT signaling pathway and the regulation of associated protein expression.KEY WORDS rheumatoid arthritis；Gulao-Yukang pills；synovium；JAK/STAT signaling pathway类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以对称性多关节疼痛、肿胀、晨僵等为主要临床表现的自身免疫性疾病1。RA基本病理表现为滑膜炎性改变，渐进性关节软骨侵蚀和骨破坏，最终导致关节畸形，功能丧失，并累及关节以外的多个器官、系统，是我国常见的系统性风湿性疾病2。RA病程长，病情缠绵难愈，严重影响患者生理心理状态、降低生活质量，并给家庭和社会带来沉重的经济负担3。中医药在RA的防治中疗效确切、安全经济，具有良好的应用前景。遗传、感染、免疫、环境等因素与RA的发病有密切联系，但其发病机制复杂且尚不明确。Janus激酶/信号转导和转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路作为应激的炎症信号通路在RA炎症反应中有着重要的调控作用，是2018年来关于RA发病机制研究较多的细胞因子信号传导通路之一4。JAK、STAT和细胞因子信号抑制因子（suppressors of cytokine signaling，SOCS）在JAK/STAT信号通路调控中起重要作用的蛋白。骨痨愈康丸（Gulao-Yukang pills，GLYK）由鹿角霜、全蝎、肉桂、蜈蚣、龟板、黄芪、鸡血藤、三七、阿胶、炮姜、清风藤、甘草、大枣共同组成，具有补肾活血、通络止痛之功效。前期研究表明，GLYK能够缓解患者临床症状、抑制炎症反应、改善骨质破坏、延缓病情发展5-6，但其具体的作用机制尚未完全阐释。基于此，本项工作建立胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型，观察GLYK的作用及对JAK/STAT信号通路的影响，探讨GLYK治疗RA可能的机制，以期为GLYK防治RA的进一步研究提供参考资料。材料和方法1实验动物6周龄SPF级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重200220 g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号为 SCXK（甘）2020-0001。饲养于 2325，相对湿度（5010）%环境，自由摄食饮水。本实验通过甘肃中医药大学伦理委员会审批，文件批号：2021-002。2实验试剂与仪器设备骨痨愈康丸（甘肃中医药大学附属医院，60 g/480 丸，甘药制备字：Z20190001000）；甲氨蝶呤片（methotrexate，MTX；上海上药信谊药厂有限公司，每片2.5 mg，国药准字H31020644）；JAK受体酪氨酸激酶抑制剂AG490（MCE 批号：65923）；牛型胶原蛋白（bovine type collagen 批号：190078）；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-17、IL-1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-，TNF-）和基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）ELISA 试剂盒购自江苏麦沙实业有限公司；完全弗氏佐剂（Sigma，批号：LB29884）；SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒（Accurate Biotechnology，批号：A4A0500）；Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒（Accurate Biotechnology，批 号：A4A0765）；JAK2（ABCam，批 号：GR3253328-1）；JAK3（Bioss，批 号：Bs-1567R）；STAT3（ABCam，批号：GR3220487-9）；SOCS1（cohesion，批 号：LA7754L）；SOCS3（cohesion，批 号：CY2314A）。高速低温台式离心机（Eppendorf，型号：TGL-16）；超微量分光光度计【骋克仪器（上海）有限公司，型号：Aurora-900】；梯度 PCR 仪（Bio-Rad，型号：T100 Thermal Cycler）；实时定量PCR仪（Thermo，型号：StepOne Plus）；转膜仪（北京六一生物科技公司，型号：DYCZ-40G）；电泳仪（北京六一生物科技公司，型 号：DYCZ-25D）；酶 标 仪（Bio-Rad，型 号：iMark）；化学发光成像仪（北京赛智科技有限公司，型号：MiniChemi 610）。3主要方法3.1实验分组将70只Wistar大鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常对照组（n=10）和模型制备组（n=60），除正常对照组外，其余大鼠制备CIA模型7。将牛型胶原蛋白和完全弗氏佐剂按1 1比例在冰浴环境下混合，使用匀浆器充分摇匀，形成最终浓度为1 g/L的混合乳剂。对每只大鼠背部、尾根部多点皮1476下注射，每只大鼠共注射0.3 mL混合乳剂，发生致敏反应。初次注射后12周发生免疫反应后，再对每只大鼠尾根部、双后足的足垫部分别注射0.1 mL混合乳剂加强免疫反应，2周后大鼠模型制备完成。采用关节炎指数（arthritis index，AI）评分评估模型大鼠炎性反应情况8，观察模型大鼠踝关节及双后足肿胀情况，按04级进行评分，AI2提示造模成功。将制备成功的模型大鼠按照体重随机分为5组：CIA组、MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组和AG490组，每组10只。3.2干预方法AG490组与 GLYK+AG490组于足背静脉注射酪氨酸激酶抑制剂AG490（剂量为每只1 mL）。参考 中药药理研究方法学9，根据成人与大鼠剂量折算系数确定灌胃剂量。GLYK 组与GLYK+AG490 组每天给予骨痨愈康丸 506 mg/kg 等效剂量溶液灌胃；MTX组每周给予甲氨蝶呤片 0.9 mg/kg等效剂量溶液灌胃；Control组、CIA组和AG490组给予同体积生理盐水。灌胃4周后取材。3.3指标检测3.3.1关节液指标检测处死大鼠后，用生理盐水冲洗踝关节腔，抽取关节液，4、630 g 离心 20 min，取上清液按照ELISA试剂盒规范检测各组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3水平。3.3.2关节组织病理学观察取大鼠踝关节，用酒精棉球消毒关节区域，逐层分离皮肤、肌肉组织，暴露踝关节，解剖关节滑膜，4%多聚甲醛固定。应用苏木精-伊红染色法将滑膜组织进行常规石蜡包埋、切片、染色，光镜下观察滑膜病理变化。3.3.3 RT-qPCR 法 检 测 JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1、SOCS3 mRNA的表达取大鼠踝关节，消毒，逐层分离皮肤、肌肉、剥离出滑膜组织，80 保存。研磨滑膜组织提取总 RNA，应用 RT-qPCR 法检测，其引物序列如表1。结果采用2Ct法分析数据。3.3.4 Western blot 法 检 测 JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1和 SOCS3蛋白的表达取大鼠踝关节，剥离出滑膜组织，加入RIPA组织裂解液，冰上充分裂解，4、10 010g离心15 min，提取上清液，BCA法检测蛋白浓度，30 L 5上样缓冲液与蛋白样本混合，煮沸 5 min 后立即冰浴静置；将变性蛋白置于 SDS-PAGE中进行凝胶电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶 室 温 摇 1.5 h，分 别 加 入 JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1、SOCS3和-actin抗稀释液4 孵育过夜，TBST洗膜56 min，抗室温孵育1 h，TBST洗膜56 min，将 ECL 发 光 夜 滴 加 到 PVDF 膜 上。采 用ImageJ对条带量化分析，统计各组蛋白相对表达量。4统计学处理使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计分析。计量资料以均数标准差（meanSD）形式表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P0.05为差异有统计学意义。结果1骨痨愈康丸对模型大鼠关节液中 IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3含量的影响采用ELISA法检测大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3的含量，结果显示：与control组相比较，CIA组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和 MMP-3的含量显著升高（P0.01）；与 CIA组相比较，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490 组和 AG490组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3含量有不同程度降低（P0.05），其中GLYK+AG490组降低最显著（P0.01）；与MTX组和GLYK组相比较，GLYK+AG490 组大鼠关节液中 IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和 MMP-3 含量显著降低（P0.05），见图1。2骨痨愈康丸对模型大鼠滑膜组织病理学的影响各组大鼠关节滑膜病理切片HE染色显示：control组滑膜表面光滑，无炎症及增生，组织结构完整，染色均一；CIA组滑膜明显增厚，滑膜细胞显著增多，体积增大，有明显炎症浸润，组织排列紊乱，出现缺损；MTX组滑膜增厚明显，滑膜细胞增多，有部分炎症浸润；GLYK组滑膜层增生较少，细胞排列较为整齐；GLYK+AG490组滑膜变薄，滑膜细胞减少，细胞表1RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCRNameGAPDHJAK2JAK3STAT3SOCS1SOCS3Primer sequence（5-3）Forward：AATGGTGAAGGTCGGTGTGAACReverse：AGGTCAATGAAGGGGTCGTTGForward：CCACCCAATCATGTCTTCCACAReverse：AGCTTCAGCCCCACGAGATAForward：CGCCTCCATCTCTGGAGTTTTCReverse：CCAGCAAGACAAGTCCTCGGForward：TAACCGGATCGCTGAGGTACAReverse：TGGCTCTCAATCCAAGGCGForward：TCTGATTACCGGCGCATCACReverse：TGGAAGTGCACACGAATGCTForward：CAGCTTTTCGCTGCAGAGTGReverse：CAAAGGAAGGTTCCGTCGGT1477排列趋于整齐，染色趋于一致；AG490组滑膜细胞较少，排列较为均匀，结构较为完整，无明显增生，见图2。Figure 1.Comparison of the levels of IL-6，IL-17，IL-1，TNF-and MMP-3 in the joint fluid of rats in each group.MeanSD.n=10.#P0.05，#P0.01 vs control group；*P0.05，*P0.01 vs CIA group；P0.05，P0.01 vs MTX group；P0.05，P0.01 vs GLYK group.图1各组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3含量的比较Figure 2.Histopathological changes in the synovial membrane of the rats in each group（HE staining，scale bar=50 m）.A：control group；B：CIA group；C：MTX group；D：GLYK group；E：GLYK+AG490 group；F：AG490 group.The synovial surface in control group was smooth，without inflammation or hyperplasia，with intact tissue structure.Significant synovial thickening，inflammatory infiltration and tissue loss were seen in CIA group.The number of synovial cells decreased to varied degrees in each treatment group，and the synovial layer grew thinner.图2各组大鼠滑膜组织病理学变化14783骨痨愈康丸对模型大鼠滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1和SOCS3 mRNA表达的影响采用 RT-qPCR 法检测大鼠滑膜组织中 JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1 和 SOCS3 mRNA 表达水平，结果显示：与 control 组相比较，CIA 组 JAK2、JAK3 和STAT3 的 mRNA 表达水平显著升高（P0.01）；与CIA组相比较，MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组和AG490组JAK2、JAK3和STAT3的mRNA表达水平显著降低（P0.01），GLYK+AG490 组降低最显著（P0.01）；与 MTX 组和 GLYK 组相比较，GLYK+AG490组 JAK2、JAK3 的 mRNA 表 达 水 平 显 著 下 降（P0.05）；MTX组、GLYK组、AG490组之间比较无显著差异（P0.05）。与 control 组相比较，CIA 组 SOCS1和SOCS3的mRNA表达水平显著降低（P0.01）；与CIA组相比较，MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组和AG490组SOCS1和SOCS3的mRNA表达水平显著升高（P0.05），GLYK+AG490 组 升 高 最 显 著（P0.01）；与 MTX 组和 GLYK 组相比较，GLYK+AG490组 SOCS1、SOCS3 mRNA 表 达 水 平 显 著 升 高（P0.05）。见图3。4骨痨愈康丸对模型大鼠滑膜组织中 JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白表达的影响采用Western blot法检测大鼠滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1 和 SOCS3 的蛋白表达水平，结果显示：与 control 组相比较，CIA 组 JAK2、JAK3 和STAT3 的蛋白表达水平显著升高（P0.01）；与 CIA组 相 比 较，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490 组、AG490 组 JAK2、JAK3、STAT3 蛋白表达水平著降低（P0.01），GLYK+AG490 组降低最显著（P0.01）；与MTX组、GLYK组相比较，GLYK+AG490组JAK2、JAK3、STAT3 蛋白表达水平显著下降（P0.05）。与control组相比较，CIA组SOCS1和SOCS3蛋白表达水平显著降低（P0.01）；与CIA组相比较，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490 组、AG490 组SOCS1、SOCS3 蛋白表达水平显著升高（P0.05），GLYK+AG490 组升高最显著（P0.01）；与 MTX 组、GLYK 组相比较，GLYK+AG490 组 SOCS1、SOCS3 蛋白表达水平显著升高（P0.05）。见图4。讨论RA临床表现为关节疼痛、肿胀、晨僵等的症状属于中医学“痹证”范畴。素问痹论 曰：“风寒湿三Figure 3.Comparison of the mRNA expression of JAK2，JAK3，STAT3，SOCS1 and SOCS3 in the synovial tissue of rats in each group.MeanSD.n=10.#P0.05，#P0.01 vs control group；*P0.05，*P0.01 vs CIA group；P0.05，P0.01 vs MTX group；P0.05，P0.01 vs GLYK group.图3各组大鼠滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1和SOCS3 mRNA表达的比较1479气杂至，合而为痹也。”其中寒、湿二邪在RA的发病过程中起推动作用，寒性收引凝滞，湿性重浊黏滞，寒湿夹杂致 RA病情反复、缠绵难愈。济生方痹曰：“皆因体虚，腠理空虚，受风寒湿气而成痹也。”；叶天士 临证指南医案 曰：“经以风寒湿三气合而为痹，然经年累月，外邪留著，气血皆伤，其化为败瘀凝痰，混处经络。”指出正气虚弱是 RA发生的根本原因，瘀为关节破坏的重要因素10。骨痨愈康丸是甘肃中医药大学附属医院院内制剂，以补肾通络法研制而成，具有补肾活血、通络止痛之功效，针对肾虚血瘀而致RA具有良好的疗效。前期研究表明，骨痨愈康丸对于缓解RA症状、延缓病情进展、改善患者的生活质量等方面，疗效确切，优势明显5-6。RA作为慢性自身免疫性疾病与炎性细胞因子和免疫细胞联系密切，其在RA发生发展中发挥着重要作用，能刺激关节滑膜组织炎性改变、激活多条信号通路参与炎症反应、促使滑膜增厚、血管翳的生成和关节的侵蚀与破坏11。JAK/STAT信号通路与多种免疫性疾病的发病机制有关，其广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应和免疫调节等重要生物学过程12，可能是揭示RA发病机制的新途径。本实验结果显示，经过 4 周的治疗，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490 组和 AG490 组的大鼠滑膜细胞增生、滑膜组织增厚均有不同程度的减轻，MTXFigure 4.Comparison of JAK2，JAK3，STAT3，SOCS1 and SOCS3 protein expression in the synovial tissue of rats in each group.MeanSD.n=10.#P0.05，#P0.01 vs control group；*P0.05，*P0.01 vs CIA group；P0.05，P0.01 vs MTX group；P0.05，P0.01 vs GLYK group.图4各组大鼠滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白表达的比较1480组和 GLYK 组、AG490 组治疗效果相当，GLYK+AG490组治疗效果最显著。说明GLYK能够有效的缓解RA症状、抑制滑膜细胞增生、减轻炎症改变和对关节的侵蚀。甲氨蝶呤是治疗RA的首选药物，疗效确切，骨痨愈康丸与甲氨蝶呤、JAK受体酪氨酸激酶抑制剂治疗效果相当，且联合应用能起到更好的疗效。细胞因子是调节免疫反应的重要介质，细胞因子的异常合成与释放可能诱发 RA，并且能影响RA的炎症反应和免疫过程13-14。IL-1通过激活单核细胞和巨噬细胞诱导炎症，诱导成纤维样滑膜细胞增殖，导致滑膜增生15。TNF-通过激活靶细胞诱导炎症反应，并且与 IL-6协同刺激 B细胞和 T细胞，促使分泌细胞免疫球蛋白，诱导 RA 的发生15。TNF-与IL-17的协同作用增加MMP-3的合成与释放，激活成纤维样滑膜细胞导致关节滑膜增生、炎症改变、血管翳的形成13。由此可见，控制细胞因子处于正常水平是抑制RA炎症反应的重要环节。本实验结果显示，CIA组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3水平显著升高。经治疗后，MTX组、GLYK组、GLYK+AG490组、AG490组大鼠关节液中IL-6、IL-17、IL-1、TNF-、MMP-3水平有不同程度降低，其中GLYK+AG490组下降更显著。说明骨痨愈康丸能抑制关节液中 IL-6、IL-17、IL-1、TNF-和MMP-3等细胞因子水平，来减轻关节炎症反应。JAK/STAT信号通路在RA的发病中有着关键的调控作用，JAK2、JAK3与STAT3是其重要组成部分。JAK2广泛分布在机体细胞和组织中，参与免疫调节和炎症反应；JAK3具有促进淋巴细胞增殖和抗炎功能，其功能紊乱或缺失会导致淋巴细胞免疫功能的减弱或丧失16-17。STAT3在炎症反应过程中重要调节因子，具有抑制成纤维样滑膜细胞的增殖的作用18。由细胞因子激活的JAK2、JAK3转向下游激活并磷酸化STAT3，活化的STAT3转移至细胞核内与相应的靶基因结合进行基因转录和表达，发生炎症反应。本实验结果显示，CIA 组大鼠滑膜组织中JAK2、JAK3、STAT3及其mRNA表达水平显著升高。经 治 疗 后，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490 组、AG490 组大鼠滑膜组织中 JAK2、JAK3、STAT3 及其mRNA 表达水平有不同程度降低，GLYK+AG490组降低最显著。可见，骨痨愈康丸能够降低 JAK2、JAK3、STAT3的活性来抑制JAK/STAT信号通路，减轻RA炎症反应、抑制滑膜增生。SOCS是 JAK/STAT 信号通路的重要组成部分，是其负反馈调节的重要环节，研究表明，SOCS参与RA的整个病理过程，对细胞的增殖、炎症反应有抑制作用19-20。SOCS 能抑制 JAK 与 STAT 活性，抑制JAK/STAT信号通路的传导，形成经典的负反馈调节通路。SOCS1和 SOCS3是 JAK/STAT 信号通路负反馈调节的主要抑制因子，生理情况下，SOCS1 和SOCS3活性不高，细胞因子激活相关信号通路其表达水平升高，而SOCS1和SOCS3反过来降低JAK与STAT活性来达到抑制JAK/STAT信号通路活性，从而达到治疗RA的目的21-22。本实验结果显示，CIA组大鼠滑膜组织中 SOCS1、SOCS3 及其 mRNA 表达水平显著降低。经治疗后，MTX 组、GLYK 组、GLYK+AG490组、AG490组大鼠滑膜组织中SOCS1、SOCS3 及 其 mRNA 表 达 水 平 有 不 同 程 度 升 高，GLYK+AG490组升高最显著。可见，骨痨愈康丸能上调 SOCS1、SOCS3 及其 mRNA 表达水平，来抑制JAK2、JAK3、STAT3及其mRNA的过表达，从而抑制JAK/STAT信号通路过度激活，达到降低RA滑膜炎症反应。综上所述，骨痨愈康丸能减轻CIA大鼠炎症反应，延缓病情进展，其机制可能是通过下调IL-6、IL-17、IL-1、TNF-、MMP-3、JAK2、JAK3和STAT3等因子过表达水平，上调SOCS1和SOCS3因子表达水平，来抑制JAK/STAT信号通路过度激活，减轻RA对关节的炎症反应、抑制滑膜增生，从而达到治疗目的。参考文献1Sparks JA.Rheumatoid arthritisJ.Ann Intern Med，2019，170（1）：C1-C16.2田新平，李梦涛，曾小峰.我国类风湿关节炎诊治现状与挑战：来自中国类风湿关节炎 2019 年年度报告J.中华内科杂志，2021，60（7）：593-598.Tian XP，Li MT，Zeng XF.The challenges and opportunities for the management of rheumatoid arthritis in China：anannual report of 2019 J.Chin J Intern Med，2021，60（7）：593-598.3耿研，谢希，王昱，等.类风湿关节炎诊疗规范 J.中华内科杂志，2022，61（1）：51-59.Geng Y，Xie X，Wang Y，et al.The standardized diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis J.Chin J Intern Med，2022，61（1）：51-59.4Mcgarry T，Orr C，Wade S，et al.JAK/STAT blockade alters synovial bioenergetics，mitochondrial function，and proinflammatory mediators in rheumatoid arthritis J.Arthritis Rheumatol，2018，70（12）：1959-1970.5田杰祥，王钢，王佳，等.骨痨愈康丸联合甲氨喋呤片治疗低活动度类风湿关节炎 60 例 J.中医研究，2017，30（12）：17-20.Tian JY，Wang G，Wang J，et al.Gulao Yukang Pills 1481combined with methotrexate tablets for 60 cases of hypermobile rheumatoid arthritisJ.Tradit Chin Med Res，2017，30（12）：17-20.6李平顺，王钢，周孟茹.基于RANKL-RANK-OPG环路探讨骨痨愈康丸改善肝肾亏虚型类风湿关节炎患者骨破坏机制研究 J.中华中医药杂志，2020，35（3）：1603-1607.Li PS，Wang G，Zhou MR.Effects of Gulao Yukang Pills on the bone destruction mechanism in rheumatoid arthritis patients with liver-kidney deficiency based on RANKL-RANK-OPG loopJ.China J Tradit Chin Med Pharm，2020，35（3）：1603-1607.7苏云龙，王雪梅.胶原诱导性类风湿关节炎大鼠模型制备及早期表现评价J.内蒙古医科大学学报，2020，42（1）：53-55.Su YL，Wang XM.Preparation of collagen-induced rheumatoid arthritis rat model and evaluation of early performanceJ.J Inner Mongolia Med Univ，2020，42（1）：53-55.8Zhao H，Xu H，Qiao S，et al.Boldine isolated from Litsea cubeba inhibits bone resorption by suppressing the osteoclast differentiation in collagen-induced arthritisJ.Int Immunopharmacol，2017，51：114-123.9陈奇.中药药理研究方法学 M.2版.北京：人民卫生出版社，2006Chen Q.Methodology of pharmacological research on traditional Chinese medicineM.2nd ed.Beijing：Peoples Health Press，2006.10 田杰祥，王钢，宋敏，等.基于“虚-瘀”理论探讨补肾通络法防治类风湿关节炎骨破坏的机理研究 J.时珍国医国药，2021，32（1）：146-147.Tian JY，Wang G，Song M，et al.A study on the mechanism of bone destruction in rheumatoid arthritis by the method of tonifying the kidneys and clearing the ligaments based on the theory of deficiency-stasis J.Lishizhen Med Mater Med Res，2021，32（1）：146-147.11 Tan S，