生化大实验.pptx

生化大实验生化大实验实验课程简介实验课程简介 生生化化大大实实验验是是一一门门综综合合性性的的实实验验课课程程，教教学学的的目目的的在在于于通通过过对对生生命命物物质质的的分分离离制制备备，纯纯化化，分分析析等等综综合合性性实实验验，在在已已掌掌握握的的基基础础生生物物化化学学理理论论知知识识和和生生化化实实验验常常用用方方法法的的基基本本原原理理、基基本本操操作作技技术术（如如滴滴定定、比比色色、层层析析、电电泳泳等等）的的基基础础上上，训训练练学学生生的的综综合合实实践践动动手手能能力力，掌掌握握蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等等重重要要物物质质的的分分离离、纯纯化化等等的的测测定定技技术。术。目目录录实验一实验一 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定实验二实验二 离子交换法血清纯化离子交换法血清纯化IgG实验三实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白离子交换层析法分离血清白蛋白实验四实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量实验五实验五 等电聚焦法测定样品的等电点等电聚焦法测定样品的等电点实验六实验六 质粒的分离与纯化质粒的分离与纯化实验七实验七 PCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段实验八实验八 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验实验一实验一蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定（一）考马斯亮蓝法（一）考马斯亮蓝法【实验目的实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。法。【实验原理实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。灵敏的方法。考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250存存在在着着两两种种不不同同样样色色形形式式，红红色色-棕棕黑黑色色和和蓝蓝色色。染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合后后有有红红色色-棕棕黑黑色色和和蓝蓝色色形形式式，最最大大光光吸吸收收由由465nm变变成成595nm，测测定定595nm吸吸光光的的增增加加量量，可可以以测测定定与与其其结结合合的的蛋蛋白白质质的的量量。蛋蛋白白质质与与染染料料结结合合速速度度很很快快，2min就就可可以以反反应应完完全全，并并可可以以稳稳定定1h，蛋蛋白白质质-染染料料复复合合物物有有很很大大的的消消光光系系数数，使使得得测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度是是灵灵敏敏度度很很高高。测测定定范范围围为为10-100g蛋蛋白白质质，微微量量测测定定时时达达到到1-10g蛋蛋白白质质。此此反反应应反复性好精度高，线性关系好。反复性好精度高，线性关系好。【实验仪器及用品实验仪器及用品】1.标标准准蛋蛋白白液液（0.1mg/ml）0.2g结结晶晶牛牛血清白蛋白用血清白蛋白用0.9%NaCl稀释到稀释到2000ml。2.0.9%NaCl3.考考马马斯斯亮亮蓝蓝试试剂剂：100mg考考马马斯斯亮亮蓝蓝G250溶溶于于50ml5%乙乙醇醇中中，加加100ml85%磷磷酸，蒸馏水稀释酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。，滤纸过滤。4.待待测测蛋蛋白白：人人血血清清，用用前前用用0.9%NaCl稀释稀释200倍。倍。5.漩涡混合器漩涡混合器6.移液管移液管0.5ml（2），），1.0ml（2），），5ml（1）7.分光光度计分光光度计8.试管试管1.5cm15cm(8)9.量筒量筒100ml(1)10.电子分析天平电子分析天平11.试管架试管架(1)【实验内容及步骤实验内容及步骤】一、标准曲线线的绘制一、标准曲线线的绘制取取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线。试剂号试剂号试剂试剂1234561mg/ml标准蛋白液标准蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.15mol/LNaCl/ml10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝染液考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.0摇匀，摇匀，1小时内以小时内以1号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm处比色处比色A5952.未知样液的测定未知样液的测定另取一干净试管，加入样品另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝及考马斯亮蓝染液染液4.0ml，混匀，室温静置，混匀，室温静置3min，于波长，于波长595nm处处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项注意事项】1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思考题思考题】1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。（1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。（2）要求在半天内测定60个样品。（3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋白质浓度。2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。二、紫外分光光度法测定蛋白质含量二、紫外分光光度法测定蛋白质含量【实验目的实验目的】1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法。技术和使用方法。【实验原理实验原理】蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。白质定量分析。利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定扰，此时必须同时测定260和和280nm吸光度，通过公吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。度。不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为浓度范围为0.11.0mg/mL。【仪器与试剂仪器与试剂】1.紫外分光光度计，比色管（紫外分光光度计，比色管（10ml的的5个），个），吸量管。吸量管。2.标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：0.9%NaCl溶液溶解溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。3.待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.0-2.5mg/ml4.0.9%NaCl溶液溶液5.试管试管1.5cm15cm（9）6.移液管移液管1ml（3），），2ml（2），），5ml（2）。）。【实验步骤实验步骤】1、标准曲线法、标准曲线法（1）标准曲线的制作：取）标准曲线的制作：取8只试管按表只试管按表2-5加入试剂，摇加入试剂，摇匀。选择光程匀。选择光程1cm石英比色皿，在石英比色皿，在280nm波长测定波长测定A280，以以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。项 目12345678标准蛋白液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/ml00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280表表1-2紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度-标准曲线的绘制标准曲线的绘制（2）样品测定：）样品测定：配制待测蛋白质溶液配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水，加入蒸馏水3ml，摇，摇匀，测定匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。，从标准曲线中查出蛋白质浓度。2.直接测定法直接测定法在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260(C为蛋白质浓度，为蛋白质浓度，mg/ml,A280和和A260分别为分别为蛋白质溶液在蛋白质溶液在280nm和和260nm处测得的吸光度值处测得的吸光度值)。本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用A2800.75来表示蛋白质大概浓度。来表示蛋白质大概浓度。【注意事项注意事项】由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题思考题】1.紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？2.影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？三、三、Folin-酚法测定蛋白质浓度酚法测定蛋白质浓度【实验目的实验目的】熟悉熟悉Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。酚法测定蛋白质浓度的方法。【实验原理实验原理】Folin-酚法又称酚法又称lowry法。首先在碱性溶液中形法。首先在碱性溶液中形成铜成铜-蛋白质复合物，后与磷钼酸蛋白质复合物，后与磷钼酸-磷钨酸作用，产生磷钨酸作用，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这中复合物在深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这中复合物在750nm和和660nm处有最大吸收峰，颜色与蛋白质浓度成正处有最大吸收峰，颜色与蛋白质浓度成正比，进而可以计算蛋白质浓度。比，进而可以计算蛋白质浓度。【材料、试剂、与器具材料、试剂、与器具】1.Folin-酚酚A（碱碱性性铜铜试试剂剂）：20g碳碳酸酸氢氢钠钠和和4g氢氢氧氧化化钠钠双双蒸蒸水水定定容容1000ml为为储储备备液液1；0.5g五五水水硫硫酸酸铜铜1gNa3C6H5O7，定容，定容100ml，为储备液，为储备液2。将将50ml储储备备液液1和和1ml储储备备液液2混混合合为为溶溶液液A,混混合合后后一一日有效。日有效。2.Folin-酚酚B：100g钨钨酸酸钠钠、25g钼钼酸酸钠钠、100g蒸蒸馏馏水水、50ml80%磷磷酸酸、100ml浓浓硫硫酸酸在在1500ml磨磨口口圆圆底底小小瓶瓶中中混混匀匀后后接接上上磨磨口口冷冷凝凝管管，回回流流10h再再加加入入硫硫酸酸锂锂150g、蒸蒸馏馏水水50ml及及液液溴溴数数滴滴，开开口口煮煮沸沸15min，冷冷却却，稀稀释释至至100ml过过滤滤，至至微微绿绿，储储存存于于棕棕色色瓶瓶。临临用用前前氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定，用用酚酚酞酞做做指指示示剂剂，据据滴滴定定结结果果，将将试试剂剂稀稀释释至至1mol/L的的酸酸，冰箱保存。冰箱保存。3、标准浓度牛血清蛋白溶液、标准浓度牛血清蛋白溶液200g/ml4、721分光光度计分光光度计5、刻度吸管、刻度吸管0.5ml（1），），1ml（2），），5ml（1）6、试管、试管1.5cmX15cm8只只7、恒温水浴、恒温水浴【操作步骤操作步骤】1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取6只试管，按下表加入试剂:试 剂 012345牛血清蛋白溶液 00.20.40.60.81.0蒸馏水 4.54.34.13.93.73.5Folin-酚A1.01.01.01.01.01.0酚第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积6.06.06.06.06.06.0OD660 加入试剂加入试剂A后，混匀，室温后，混匀，室温10min，在加，在加Folin-酚酚B3.0ml，混匀后，混匀后10min，再第二次加，再第二次加0.2ml，混，混匀放置匀放置30min。于。于660nm比色，做标准曲线。比色，做标准曲线。2、样品测定、样品测定取样品取样品1ml按上表加试剂，按上表加试剂，660nm处比色，对处比色，对照标准曲线求出蛋白质浓度。照标准曲线求出蛋白质浓度。【思考题思考题】1、Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理是什么？酚法测定蛋白质浓度的原理是什么？2、影响、影响Folin-酚法测定蛋白质浓度的准确性的酚法测定蛋白质浓度的准确性的因素有那些？因素有那些？四、双缩脲法四、双缩脲法 【实验目的实验目的】了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。【原理原理】蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物，在形成紫红色络合物，在540nm波长处有最大吸收。在一定浓度范围内，其颜波长处有最大吸收。在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法定量色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法定量测定测定双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确的测定。双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确的测定。【试试剂剂和和器器材材】1.2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白溶液2.容量瓶容量瓶10ml（6）3.试管试管1.5cm15cm（8）4.双缩脲试剂：溶解双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（硫酸铜（CuSO45H2O）溶于）溶于15ml水中，在水中，在100ml容量瓶中加入容量瓶中加入30ml浓氨水、浓氨水、30ml冷蒸馏水和冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀，饱和氢氧化钠，摇匀，室温室温1-2h定容定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入，摇匀备用。在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。5.吸量管（吸量管（1ml，2ml，5ml）6.721型分光光度计型分光光度计【操作步骤操作步骤】1.绘制标准曲线绘制标准曲线取取6只试管编号，按下表加入试剂，即得只试管编号，按下表加入试剂，即得6种不同种不同浓度的蛋白质溶液。浓度的蛋白质溶液。另取试管另取试管7只，按只，按0、1、2、3、4、5、6编号，编号，1-6号分别加上述蛋白质溶液号分别加上述蛋白质溶液3.0ml0号为对照，加号为对照，加3.0ml蒸馏水分别加入，各试管中加双缩脲试剂蒸馏水分别加入，各试管中加双缩脲试剂2.0ml混混匀，紫色出现后，与匀，紫色出现后，与540nm测定吸光度，闭塞测定法测定吸光度，闭塞测定法务必在务必在30min内完成，绘制蛋白质浓度内完成，绘制蛋白质浓度吸光度曲线。吸光度曲线。容量瓶编号容量瓶编号牛血清蛋白溶液牛血清蛋白溶液蒸馏水蒸馏水蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml11.0稀释至刻度稀释至刻度0.222.0稀释至刻度稀释至刻度0.433.0稀释至刻度稀释至刻度0.644.0稀释至刻度稀释至刻度0.855.0稀释至刻度稀释至刻度1.066.0稀释至刻度稀释至刻度1.22.未知样品蛋白质浓度的测定未知样品蛋白质浓度的测定取样品取样品3.0ml于试管中，加双缩脲试剂于试管中，加双缩脲试剂2.0ml混混匀，于匀，于540nm处测定其吸光度，对照标准曲线，求处测定其吸光度，对照标准曲线，求出蛋白质浓度。出蛋白质浓度。【思考题思考题】1.本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较，有本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较，有那些优点？那些优点？2.若样品中有干扰测定的杂质，应该如何校正若样品中有干扰测定的杂质，应该如何校正实验结果？实验结果？实验二实验二离子交换法血清纯化离子交换法血清纯化IgG 【实验原理实验原理】DEAE-SephadexA-50（二乙氨基（二乙氨基-乙基乙基-葡葡萄糖凝胶萄糖凝胶A-50）为弱碱性阴离子交换剂。用）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将将Cl-型转变为型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清型后，可吸附酸性蛋白。血清中的中的球蛋白属于中性蛋白（等电点为球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.857.5），其余均属酸性蛋白。），其余均属酸性蛋白。pH7.27.4的环境的环境中。酸性蛋白均被中。酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只吸附，只有有球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。【试剂与器材试剂与器材】1.DEAE-SephadexA-502.0.5mol/LHCl和和NaOH3.0.1mol/LpH7.4PBS4.0.1mol/LTris-HCl(pH7.4)5.0.02NaN36.PEG7.无水乙醇无水乙醇8.紫外分光光度计紫外分光光度计9.1cm20cm玻璃层析柱玻璃层析柱10.自动部分收集器自动部分收集器【操作步骤操作步骤】1DEAE-SephadexA-50预预处处理理称称DEAE-SephadexA-50（下下称称A-50）5g，悬悬于于500ml蒸蒸馏馏水水内内，1h后后倾倾去去上上层层细细粒粒。按按每每克克A-50加加0.5mol/LNaOH15ml的的比比例例，将将浸浸泡泡于于0.5mol/LNaOH液液中中，搅搅匀匀，静静置置30min，装装入入布布氏氏漏漏斗斗（垫垫有有2层层滤滤纸纸）中中抽抽滤滤，并并反反复复用用蒸蒸馏馏水水抽抽洗洗至至pH呈呈中中性性；再再以以0.5mol/LHCl同同上上操操作作过过程程处处理理，最最后后以以0.5mol/LNaOH再再处处理理一一次次，处处理理完完后后，将将A-50浸泡于浸泡于0.1mol/LpH7.4PBS中过夜。中过夜。2装柱装柱 （1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。（2）将）将0.1mol/LTris-HCl(pH7.4)沿玻璃棒倒沿玻璃棒倒入柱中至入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的调成稀糊状的A-50。待。待A-50凝胶沉降凝胶沉降23cm高高时，开启出水口螺旋夹，控制流速时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连，同时连续倒入糊状续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。凝胶至所需高度。（3）关闭出水口，待）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。相连接。3平平衡衡启启开开出出水水口口螺螺旋旋夹夹，控控制制流流速速4滴滴/min，使使约约2倍倍床床体体积积的的洗洗脱脱液液流流出出。并并以以pH计计与与电电导导仪仪分分别别测测定定洗洗脱脱液液及及流流出出液液之之PH值值与与离离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。4加加样样及及洗洗脱脱启启开开上上口口橡橡皮皮塞塞及及下下口口螺螺旋旋夹夹，使使柱柱中中液液体体缓缓慢慢滴滴出出，当当柱柱面面液液体体与与柱柱面面相相切切时时，立立即即关关闭闭出出水水口口，以以毛毛细细滴滴管管沿沿柱柱壁壁加加入入样样品品（0.5ml血血清清，体体积积应应小小于于床床体体积积的的2%，蛋蛋白白浓浓度度以以100mg为为宜宜）。松松开开出出水水口口螺螺旋旋夹夹使使面面样样品品缓缓慢慢进进入入柱柱内内，至至与与柱柱面面相相切切时时，立立即即关关闭闭下下口口，以以少少量量洗洗脱脱液液洗洗柱柱壁壁23次次；再再放放开开出出水水口口，使使洗洗液液进进入入床床柱柱，随随后后立立即即于于柱柱面面上上加加入入数数毫毫升升洗洗脱脱液液，紧紧塞塞柱柱上上口口，使使整整个个洗洗脱脱过过程程成成一一密密闭闭系系统统。并控制流速，并控制流速，4滴滴/min.5收集收集开始洗脱的同时就以试管进行收集；开始洗脱的同时就以试管进行收集；每管收集每管收集4ml.共收集共收集1015管。管。6测蛋白测蛋白以以751型紫外分光光度计分别测定型紫外分光光度计分别测定每管每管A260，按公式计算各管蛋白含量。并以，按公式计算各管蛋白含量。并以A280为纵坐标，绘制洗脱曲线。为纵坐标，绘制洗脱曲线。7合并、浓缩合并、浓缩将洗脱峰的上坡段与下坡段各将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以管收集液分别进行合并，以PEG（Mw6000）浓）浓缩至所需体积，加入缩至所需体积，加入0.02NaN3防腐，于防腐，于4保存备用。长期保存时应贮于保存备用。长期保存时应贮于-40冰箱。冰箱。8A-50凝胶的再生凝胶的再生在柱上先以在柱上先以2mol/LNaCl洗脱杂蛋白至流出液的洗脱杂蛋白至流出液的A2800.02，再以蒸馏水，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4保存；保存；近期不用时，以无水酒精洗近期不用时，以无水酒精洗2次，再置次，再置50温箱温箱烘干，装瓶内保存。烘干，装瓶内保存。实验三实验三离子交换层析法分离离子交换层析法分离血清白蛋白血清白蛋白【实验目的实验目的】通过对白蛋白纯化的实验，培养学生通过对白蛋白纯化的实验，培养学生综合运用离子交换层析手段分离蛋白质纯综合运用离子交换层析手段分离蛋白质纯品的技能。品的技能。【基本原理基本原理】离子交换是指液相中的离子与固定相上离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。外。再根据交换吸附于固定相的各组分解再根据交换吸附于固定相的各组分解离力度的差别，运用不同的离力度的差别，运用不同的pH值或不同盐值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。离子交换层析。【试剂与器材试剂与器材】1.20%磺酰水杨酸磺酰水杨酸2.DEAE32cellulose3.PBS（0.0175M pH6.7）：取）：取0.2M Na2HPO4 3.5mL、0.2M NaH2PO4 56.5ml混合，用酸度计检查混合，用酸度计检查pH值应为值应为6.7。取该混合液。取该混合液87.5ml用蒸馏水稀释至用蒸馏水稀释至1000mL。4.0.1N HCl和和0.1N NaOH5.Nessler试剂试剂6.1cm20cm层析柱层析柱7.黑、白比色板黑、白比色板【操作步骤操作步骤】1.DEAE32纤维素的活化处理：纤维素的活化处理：(1)取取DEAE32纤维素纤维素1.5g（DEAE32纤维纤维素的量（干重），一般按样品的蛋白质量计算，大素的量（干重），一般按样品的蛋白质量计算，大约是蛋白质量的约是蛋白质量的1015倍）悬于倍）悬于0.1NNaOH溶液中，溶液中，浸泡过夜，用浸泡过夜，用300ml锥形瓶盛装；锥形瓶盛装；(2)次日，在布氏漏斗上轻吸过滤，用蒸馏水洗，次日，在布氏漏斗上轻吸过滤，用蒸馏水洗，直至直至pH.8.0左右，抽干；左右，抽干；(3)用用0.1NHCl浸泡浸泡30min，用蒸馏水洗净，直至，用蒸馏水洗净，直至pH.6.0左右，抽干；左右，抽干；(4)PBS（0.0175MpH6.7）浸泡）浸泡3hr；(5)倾去微细颗粒（浮悬），加入倾去微细颗粒（浮悬），加入PBS（0.0175MpH6.7）使容积为沉淀体积的）使容积为沉淀体积的1.5倍；倍；2.关闭柱的出口，向柱内加入关闭柱的出口，向柱内加入1/3体积的体积的PBS（0.0175MpH6.7）,将将DEAE32cellulose悬浮液悬浮液用玻棒引流连续倒入柱内，当交换剂沉积到底部时用玻棒引流连续倒入柱内，当交换剂沉积到底部时，打开流出口，让缓冲液缓慢流出，再倒入更多的，打开流出口，让缓冲液缓慢流出，再倒入更多的悬液，直至整个用量加完为止；悬液，直至整个用量加完为止；3.将柱与储液瓶（内盛同样将柱与储液瓶（内盛同样PBS）连接，流洗几个柱）连接，流洗几个柱体积的缓冲液，使柱床稳定，并使得流出液体积的缓冲液，使柱床稳定，并使得流出液pH为为6.7；4.纯纯化化-球球蛋蛋白白：取取实实验验3所所保保存存溶溶液液（-球球蛋蛋白白），再再对对PBS（0.0175M pH6.7）透透析析12-24hr，更更换换数数次次 PBS，使使 蛋蛋 白白 质质 溶溶 液液 中中 pH为为 6.7；5.将将透透析析后后的的粗粗提提IgG样样品品缓缓缓缓加加在在柱柱床床顶顶部部，打打开开出出水水口口，待待样样品品全全部部进进入入柱柱床床后后，缓缓慢慢流流入入PBS（0.0175M pH6.7），调调整整流流速速至至0.3ml/min，开开始始用用Eppendorf管管收收集集洗洗脱脱液液，每每管管1ml，先先用用磺磺酰酰水水杨杨酸酸检检测测有有无无蛋蛋白白质质流流出出（蛋蛋白白质质遇遇磺磺酰酰水水杨杨酸酸显显白白色色，故故用用黑黑色色比比色色板板），待待蛋蛋白白质质流流出出后后，迅迅速速收收集集蛋蛋白白液液（视视收收集集量量和和蛋蛋白白质质的的浓浓度度可可选选择择用用30%PEG浓缩）。此不被吸附的即为纯化的浓缩）。此不被吸附的即为纯化的-球蛋白；球蛋白；6.将收集到的蛋白液合并，紫外分光光度计将收集到的蛋白液合并，紫外分光光度计法法(见实验见实验1)测定蛋白质的含量，取部分溶液进行纯测定蛋白质的含量，取部分溶液进行纯度鉴定、分子量和等电点的测定实验；度鉴定、分子量和等电点的测定实验；7.用完的凝胶柱用用完的凝胶柱用1M NaCl流洗干净，再用流洗干净，再用0.02M NH4Ac缓冲液（缓冲液（pH6.5）流洗平衡后可重复）流洗平衡后可重复使用，但应将顶部吸去并新添，暂不用时可将其倒使用，但应将顶部吸去并新添，暂不用时可将其倒出，浸于出，浸于1%正丁醇的缓冲液中，以防霉变。正丁醇的缓冲液中，以防霉变。8.纯纯化化白白蛋蛋白白 取取上上一一实实验验所所保保存存溶溶液液（白白蛋蛋白白）,再再对对PBS（0.0175M pH6.7）透透析析24hr，更更换换数数次次PBS，使使蛋蛋白白质质溶溶液液中中pH为为6.7；透透析析后后白白蛋蛋白白样样品品上上柱柱后后，改改用用 0.06 mol/L NH4Ac 缓缓冲冲液液（pH6.5）洗洗涤涤，流流出出约约 30 ml（其其中中含含及及球球蛋蛋白白）后后，将将柱柱上上的的缓缓冲冲液液面面降降至至与与纤纤维维素素床床表表面面平平齐齐。然然后后改改用用0.3 mol/L NH4Ac 缓缓冲冲液液（pH6.5）洗洗脱脱，并并用用20%磺磺基基水水杨杨酸酸检检查查流流出出液液是是否否含含有有蛋蛋白白质质。由由于于纯纯化化的的白白蛋蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可眼可见见一一层层浅浅黄黄色色的的成成分分被被0.3 mol/L NH4Ac 缓缓冲冲液液洗洗脱脱下下来来，大大约约改改用用 0.3 mol/L NH4Ac 洗洗脱脱约约 4 ml时时，即即可可试试出出有有蛋蛋白白质质白白色色混混浊浊，立立即即连连续续收收集集3管管，每每管管10滴滴，此此即即为为纯纯化化的的白白蛋蛋白白液液，取取其其中中蛋蛋白白质质浓浓度度高高的的两两管管留留作作含含量量测测定定和和纯纯度度鉴鉴定定用用（视视收收集集量量和和蛋蛋白白质质的的浓浓度度可可选选择择用用30%PEG浓浓缩缩）。用用过过的的DEAEcellulose层层析析柱柱，应应重重新新再再生生平平衡衡，方方法法如如下下，先先用用20 ml 1.5 mol/L NaCl 0.3 mol/L NH4Ac流流洗洗，再再用用 40 ml 0.02 mol/L NH4Ac（pH6.5）流流洗洗平平衡衡即即可可。暂暂不不用用时时可可将将其其倒倒出出，浸浸于于1%正正丁丁醇醇的的缓缓冲液中，以防霉变。冲液中，以防霉变。【注意事项注意事项】1.1.装柱时柱子一定要垂直；装柱时柱子一定要垂直；2.2.装柱时应注意，柱床内不得产生界装柱时应注意，柱床内不得产生界面、气泡，表面要平整；面、气泡，表面要平整；3.3.柱子用完后一定要用高浓度的盐溶柱子用完后一定要用高浓度的盐溶液洗净液洗净。实验四实验四SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳测定蛋白质分子）凝胶电泳测定蛋白质分子量量【实验目的实验目的】1.学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。2.掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。3.运用运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴测定蛋白质分子量及染色鉴定。定。【基本原理基本原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，用它分聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白组分的离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。将已知相对分子质量的标准蛋白的泳迁移率的差别。将已知相对分子质量的标准蛋白的迁移率对分子量的对数作图，可得到一条标准曲线。迁移率对分子量的对数作图，可得到一条标准曲线。将未知相对分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进将未知相对分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子量。也可以用相关分析软件得出回归方程的相对分子量。也可以用相关分析软件得出回归方程并计算出结果。并计算出结果。【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】（一）仪器（一）仪器1.电泳仪电泳仪2垂直平板电泳槽垂直平板电泳槽3微量进样器微量进样器（二）材料（二）材料1.IgG：2.血清血清（三）试剂（三）试剂 1.凝胶贮液：丙稀酰胺（凝胶贮液：丙稀酰胺（Acr）30g、双丙稀、双丙稀酰胺（酰胺（Bis）0.8g，ddH2O溶解，定容至溶解，定容至100ml。2.0.05M pH8.0 Tris-HCl缓冲液：缓冲液：0.61 gTris加加入入 50ml ddH2O使之溶解，再加入使之溶解，再加入3ml 1M HCl溶溶液，混匀后在液，混匀后在pH计上调计上调pH至至8.0，最后加，最后加ddH2O定定容至容至100ml。3.分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：Tris 36.3g加入加入1M HCl溶液溶液48.0ml，再加，再加ddH2O到到100ml，pH8.9。4.电极缓冲液：电极缓冲液：3gTris、14.4g甘氨甘氨酸、酸、1gSDS，ddH2O定容至定容至1000ml。5.样品缓冲液：样品缓冲液：1.0ml甘油、甘油、0.1ml巯巯基乙醇、基乙醇、100mgSDS、2mg溴酚蓝、溴酚蓝、2mlTris-HCl（pH8.0）缓冲液，缓冲液，ddH2O定容至定容至10ml。6.过硫酸铵（过硫酸铵（AP）溶液：）溶液：1gAP溶于溶于10mlddH2O中（要求现用现配）。中（要求现用现配）。7.四甲基乙二铵（四甲基乙二铵（TEMED）。）。8.染色液：染色液：1.25 g 考马斯亮兰考马斯亮兰 R-250，溶，溶于于500ml固定液中，混匀。固定液中，混匀。9.脱染液：脱染液：75mL冰醋酸、冰醋酸、50mL甲醇、甲醇、875ml水，混匀。水，混匀。10.标准蛋白（次高分子量）。标准蛋白（次高分子量）。11.浓缩胶缓冲液：浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g加加1M HCl 溶液溶液48.0ml，加，加ddH2O到到100ml，pH6.7。12.固定液：取固定液：取50%甲醇甲醇454mL，冰醋酸，冰醋酸46ml混匀。混匀。【实验步骤实验步骤】1.将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好；用将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好；用1%的琼脂糖电泳缓冲液（的琼脂糖电泳缓冲液（1g琼脂糖溶于琼脂糖溶于100m l电泳电泳缓冲液）封严玻璃板的边和底（保证不漏胶缓冲液）封严玻璃板的边和底（保证不漏胶/新式电新式电泳槽此步免）；泳槽此步免）；2.配分离胶（配分离胶（2.5mlTris（pH8.9）3.3ml凝胶凝胶溶液溶液4.2ml蒸馏水，蒸馏水，50l-10%SDS溶解，混匀后再溶解，混匀后再加入加入50l AP和和10l TEMED，混匀），混匀）;3.将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加槽高三分之二处，加12cm高的蒸馏水密封。待胶凝高的蒸馏水密封。待胶凝固后（约需固后（约需30min）倒掉水，用吸水纸吸干；）倒掉水，用吸水纸吸干；配配 浓浓 缩缩 胶胶（1.25mlTris（pH6.7）0.85ml凝凝 胶胶 溶溶 液液 2.95ml蒸蒸 馏馏 水水，20l-10%SDS溶溶解解，混混匀匀后后再再加加入入25l AP和和10l TEMED，混混 匀匀），将将 配配 好好 的的 浓浓 缩缩 胶胶立立即即倒倒入入凝凝胶胶槽槽（插插入入梳梳子子不不溢溢出出为为宜宜），插入梳子；插入梳子；对于不同分子量样品建议使用的凝胶浓度对于不同分子量样品建议使用的凝胶浓度分分子子量量胶胶浓浓度（度（%）5105254.待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲液（淹没胶，但不高于电泳槽）；液（淹没胶，但不高于电泳槽）；5.样品处理：取标准蛋白或样品样品处理：取标准蛋白或样品10-20l，加入，加入10-20l样品缓冲液，混匀，样品缓冲液，混匀，100水浴水浴加热加热35min。6.进样：将处理好的样品进样：将处理好的样品10l加入到凝胶加入到凝胶孔中，连接电泳仪；孔中，连接电泳仪；7.电泳：打开电源，调整电压至电泳：打开电源，调整电压至100V，开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调至至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部 距离下缘距离下缘1cm时停止电泳，取下玻璃板，小心地把其时停止