枸杞多糖对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中NLRP3炎症小体_细胞焦亡信号通路的影响.pdf

7期第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）07-0649-06论著收稿日期：2023-01-16基金项目：教育部“春晖计划”合作科研项目（Z2016056）；宁夏回族自治区重点研发项目（一般项目）（2020BEG03033）作者简介：梁念孩（1991），男，在读硕士研究生，主要从事糖尿病视网膜病变相关中医药基础研究。通信作者：摆茹（1979），博士，教授，硕士研究生导师，主要从事中医药免疫研究工作。E-mail：糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是常见的糖尿病微血管并发症，是 20耀75 岁糖尿病患者视力下降或失明的重要原因1-5。DR 发病机制复杂，目前尚未完全明确。视网膜色素上皮细胞不具有再生能力，但具有支持作用，可为视网膜提供营养6，细胞死亡后由相邻细胞补充空余位置。高糖刺激可使视网膜色素上皮细胞损伤并失去正常生理功能，长期高血糖可导致视网膜发生特征性病理改变，如视网膜微血管内膜增厚、血管通透性增加和新生血管化，最终导致视网膜病变，而视网膜色素上皮细胞屏障的破坏在DR 的发展中起着重要作用7-10。NLRP3 炎症小体是组织细胞调控炎性反应的重要信号分子，主要由 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD-like receptor protein 3，NL原RP3）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associatedspeck-like protein containing a CARD，ASC）及半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）组成11。NLRP3 炎症小体激活后，可诱导 Caspase-1 前体裂解和活化，活化的 Caspase-1 能裂解消皮素 D（gasderminD，GSDMD）并释放其 N 端结构域，该结构域转移到细胞膜并形成孔，介导细胞内容物的释放，包括炎性细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-1茁和IL-18，激活焦亡途径，诱导细胞焦亡12-14。研究15-16发现，NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的激活参与 DR 的发生与发展，高糖刺激 NL原RP3-Caspase-1-GSDMD 信号轴，可诱导人视网膜细胞以浓度和时间依赖性的方式在质膜中产生孔隙并分泌 IL-1茁 和 IL-18。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞子的主要活性成分，具有抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等多种生物活性，还具有抗衰老、细胞保护、神经保护和减缓炎性反应的作用17-19。枸杞多糖对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的影响梁念孩1，2，杜丽君1，马燕1，夏会东1，窦凯凯1，姚青1，摆茹1（1.宁夏医科大学基础医学院，银川750004；2.宁夏回族自治区第五人民医院，石嘴山753000）摘要：目的观察枸杞多糖（LBP）对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）中 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NLRP3）炎症小体/细胞焦亡信号通路的影响。方法将体外培养的 ARPE-19 细胞，随机分为 5 组，即正常组（5.5 mmol L-1葡萄糖）、高糖组（55.5 mmol L-1葡萄糖）、LBP 低浓度组（55.5 mmolL-1葡萄糖+100 滋g mL-1LBP）、LBP 中浓度组（55.5 mmol L-1葡萄糖+200 滋g mL-1LBP）和LBP 高浓度组（55.5 mmol L-1葡萄糖+400 滋g mL-1LBP）。采用免疫荧光观察各组细胞中 NLRP3 蛋白的表达，Western blot 检测炎症小体NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和其下游细胞焦亡蛋白消皮素 阅（GSD原MD）的相对表达量，ELISA 检测细胞上清液中白细胞介素（interleukm，IL）-1茁 和 IL-18 的表达水平。结果免疫荧光结果显示，NLRP3 蛋白主要在视网膜色素上皮细胞胞质中表达，且与正常组相比，高糖组 NLRP3 蛋白的表达水平升高（P约0.05）；而与高糖组相比，LBP 中、高浓度组 NLRP3 蛋白的表达水平降低（P约0.01）。West原ern blot 结果显示，与正常组相比，高糖组细胞中 NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD 蛋白的相对表达量升高（P均约0.05）；与高糖组相比，LBP 中、高浓度组中 NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD 蛋白的相对表达量降低（P均约0.05）。ELISA 结果显示，与正常组相比，高糖组细胞中 IL-1茁 和 IL-18 表达水平均升高（P均约0.05）；与高糖组相比，LBP 中、高浓度组中 IL-1茁、IL-18 表达水平均降低（P均约0.05）。结论LBP 可通过抑制 NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的激活，从而对高糖环境下的人视网膜色素上皮细胞产生保护作用。关键词：枸杞多糖；人视网膜色素上皮细胞；NLRP3 炎症小体；细胞焦亡；白细胞介素中图分类号：R285.5文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.07.001649窑窑宁夏医科大学学报4缘卷研究20发现，LBP 能够抑制糖尿病小鼠视网膜内的血管新生、氧化应激和炎性反应。本研究通过观察 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的影响，进一步探讨 LBP 对糖尿病视网膜色素上皮细胞产生保护作用的分子机制。1材料与方法1.1主要试剂人视网膜色素上皮细胞系 ARPE-19（北京协和细胞资源中心）、LBP（宁夏沃福百瑞枸杞产业股份有限公司，LBP 含量为 53.14%）、DMEM低糖培养基、胎牛血清（美国 Hyclone 公司）、0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）、全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物股份有限公司）、兔抗 NLRP3 抗体、兔抗 ASC 抗体、兔抗 Caspase-1 抗体、兔抗 GSDMD 抗体（美国 Pro原teintech Group 公司）、兔抗 茁-actin 抗体、羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司）、IL-1茁 和IL-18 ELISA 检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）、超敏 ECL 化学发光试剂盒（苏州新赛美生物科技有限公司）、甘氨酸（北京百奥莱博科技有限公司）、1伊无蛋白快速封闭液、10伊电泳液、抗体稀释液、快速配胶试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司）。1.2仪器二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司）、相差显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）、低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、超净水仪（四川优普超纯科技有限公司）、1510 型多功能酶标仪（美国 Thermo 公司）。1.3方法1.3.1ARPE-19 细胞培养和分组ARPE-19 细胞 培 养 于 含 10%胎 牛 血 清、1%青 链 霉 素 的DMEM 低糖培养液（5.5 mmol L-1葡萄糖）中，接种于 6 孔板，每孔 1.5伊105个细胞。随机分为正常组（5.5 mmol L-1葡萄糖）、高糖组（55.5 mmol L-1葡萄糖）、LBP 低浓度组（55.5 mmol L-1葡萄糖+100 滋g mL-1LBP）、LBP中浓度组（55.5mmol L-1葡萄糖+200滋g mL-1LBP）和 LBP高浓度组（55.5mmol L-1葡萄糖+400 滋g mL-1LBP）。正常组和高糖组细胞分别使用含 5.5 mmol L-1和 55.5 mmol L-1葡萄糖的 DMEM 完全培养液进行培养。LBP 低、中、高浓度组细胞在含 55.5 mmol L-1葡萄糖的 DMEM完全培养液中分别加入100、200、400滋g mL-1LBP 进行培养。作用 72 h 后，收集细胞和上清液进行后续实验。1.3.2免疫荧光检测细胞中 NLRP3 蛋白的表达取对数生长期细胞接种于 6 孔板，每孔 1.5伊105个细胞，按照细胞分组，分别进行干预，培养72 h 后取出细胞爬片，4%的多聚甲醛室温固定30 min，PBS 洗 3 次，0.2%TritonX-100 室温破膜20 min 后，山羊血清封闭 30 min。配制 NLRP3 一抗室温孵育 1 h，羊抗兔 IgG 二抗室温避光孵育1 h。DAPI 染核 5 min，封片。荧光显微镜下观察并采图。使用 Image J 软件进行平均荧光强度分析。1.3.3Western blot 检测细胞中 NLRP3/细胞焦亡信号通路相关蛋白的表达收集好 72 h 干预过的各组细胞，按照全蛋白提取试剂盒说明，提取蛋白并定量后，加入 Loading Buffer，变性 10 min备用。取 30 滋g 蛋白上样，10%的胶电泳后进行转膜（PVDF 膜、湿转、220 mA）。用无蛋白快速封闭液封闭 30 min 后，加入 NLRP3（1颐3 000）、ASC（1颐1 000）、Caspase-1（1颐1 000）、GSDMD（1颐5 000）、茁-actin（1颐1 000）一抗 4 益孵育过夜。二抗（1颐5 000）室温孵育 2 h，随后配制 ECL 发光液（A 液颐B 液=1颐1）进行曝光，采图并数据处理。使用 Image J 软件进行条带灰度值分析。1.3.4ELISA 检测细胞上清液中 IL-1茁 和 IL-18的表达水平收集好 72 h 干预过的各组细胞上清液，12 000 r min-1，4 益离心 10 min，取上清，分别设置标准品孔、空白孔和样品孔。各孔中加入相应试剂或样品，按 IL-1茁 和 IL-18 ELISA试剂盒说明书进行操作。酶标仪 450 nm 处测各孔吸光度 A。绘制标准曲线，并计算 IL-1茁 和 IL-18 浓度。1.4统计学方法用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布和方差齐性的计量资料用均数依标准差（x依s）表示，两样本均数比较采用 t 检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1LBP 抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3 蛋白的表达免疫荧光图中可以看到，NLRP3 蛋白主要在视网膜色素上皮细胞胞质中表达，且与正常组相比，高糖组 NLRP3 蛋白的表达水平升高（P约0.05）；650窑窑7期2.3LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 GSDMD 蛋白表达的影响与正常组相比，高糖组人视网膜色素上皮细胞中焦亡蛋白 GSDMD 的表达上升（P约0.05）。与高糖组相比，LBP 中、高浓度组细胞中 GSDMD 蛋白的表达均下降（P 均约0.05），见图 3。2.4LBP 下调高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞上清液中 IL-1茁、IL-18 炎性因子的表达ELISA 检测结果显示，与正常组比较，高糖组人视网膜色素上皮细胞中 IL-1茁 和 IL-18 的A.NLRP3 炎症小体各蛋白条带图；B、C、D.NLRP3、Caspase-1、ASC 蛋白定量分析结果；与正常组相比*P0.05；与高糖组相比#P0.05。图 2Western blot 检测 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3、ASC、Caspase-1 表达的影响而与高糖组相比，LBP 中、高浓度组 NLRP3 蛋白的表达水平均降低（P 均约0.01），而 LBP 低浓度组中 NLRP3 蛋白的表达水平差异无统计学意义，见图 1。A.NLRP3 蛋白表达荧光图；B.NLRP3 蛋白半定量分析结果；与正常组相比*P0.05；与高糖组相比#P0.01，#P0.001。图 1免疫荧光检测 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3 蛋白表达的影响梁念孩，等.枸杞多糖对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的影响2.2LBP 降低高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白的表达Western blot 结果显示，与正常组相比，高糖刺激后，人视网膜色素上皮细胞中 NLRP3、Cas原pase-1、ASC 蛋白的表达均上升（P 均约0.05）。与高糖组相比，LBP 中、高浓度组细胞中 NLRP3、Caspase-1、ASC 蛋白的表达均降低（P 均约0.05），而 LBP 低浓度组中各蛋白的表达差异无统计学意义，见图 2。ABNLRP3DAPIMerge*#100806040200ABNLRP3Caspase-1ASC茁-actin*#CD118 kDa45 kDa22 kDa43 kDa1.51.00.50.01.51.00.50.0*#1.51.00.50.0651窑窑宁夏医科大学学报4缘卷A.GSDMD 蛋白条带图；B.GSDMD 蛋白定量分析结果；与正常组相比*P0.05；与高糖组相比#P0.05，#P0.001。图 3Western blot 检测 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中 GSDMD 蛋白表达的影响3讨论NLRP3 炎症小体的激活参与 DR 的发生与发展，抑制其活化，可发挥对视网膜的保护作用21。在糖尿病兔模型中，NLRP3 炎症小体识别激活信号后，活化 IL-1茁 和 IL-18，三者共同参与糖尿病诱发的非感染性炎性反应22。而下调 NLRP3/Cas原pase-1 通路表达，可抑制高糖诱导的视网膜组织炎症，减轻过氧化损伤，发挥对视网膜的保护作用，从而改善 DR 症状23-25。NLRP3 过度活化可导致细胞焦亡，经典的细胞焦亡通路特点包括 Caspase-1 依赖、DNA 片段化、细胞膜完整性的快速丧失和炎性细胞因子释放，而 GSDMD 蛋白是 Caspase-1 的主要底物，是细胞焦亡的最终执行者24，26。NLRP3 炎症小体在糖尿病大鼠视网膜病变模型中被过度激活，NL原RP3、ASC、Caspase-1 和 GSDMD 等蛋白的表达显著上调27-28。张敏等29也证实了 Caspase-1 依赖性的细胞焦亡促进了人视网膜色素上皮细胞的死亡。这表明 NLRP3 炎症小体诱导的细胞焦亡促进了 DR 的进展。本研究结果显示，与正常组比较，在高糖刺激的人视网膜色素上皮细胞中，NLRP3 炎症小体被过度激活，GSDMD 蛋白表达水平上升，也证实了 NLRP3 炎症小体/细胞焦亡信号通路的过度活化在 DR 的发病过程中具有重要作用。LBP 具有多种生物活性，对视网膜色素上皮细胞具有保护作用。Liang 等30研究表明，LBP 可能通过调节 H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡途径中所涉及的蛋白质的表达，并激活核因子红细胞2 相关因子 2（Nrf2）信号通路，减少氧化损伤和抑制细胞凋亡，从而对视网膜色素上皮细胞起到保护作用。本研究使用 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞进行干预，与高糖组比较，LBP 中、高浓度组中 NLRP3、ASC、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的表达下降，细胞上清液中 IL-1茁 和IL-18 的产生减少，表明 LBP 对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞的损伤具有保护作用。但低浓度 LBP 未显示其保护作用，可能与 LBP 浓度过低有关。也有研究31报道，LBP 在较低浓度时对人视网膜色素上皮细胞的生长无显著影响。综上所述，适当浓度的 LBP 可对高糖刺激的人视网膜色素上皮细胞产生保护作用，其分子机与正常组相比*P0.05，与高糖组相比#P0.05，#P0.05），见图 4。ABGSDMD茁-actin50 kDa43 kDa*#0.60.40.20.0*#1 5001 00050006004002000652窑窑7期制可能为 LBP 通过抑制 NLRP3 炎症小体的活化，下调 GSDMD 而减轻细胞焦亡，同时抑制炎症因子 IL-1茁 和 IL-18 的释放。本研究为进一步深入研究 LBP 在 DR 中的作用及其分子机制奠定了理论基础。但本研究仅通过细胞实验进行体外单层次验证，存在一定的局限性。参考文献：1Hao Y，Gao XF.Diosgenin protects retinal pigmentepithelial cells from inflammatory damage and oxida原tive stress induced by high 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groups were cells cultured in 55.5 mmol L-1glucose medium andseparately treated with 100，200 and 400 滋g mL-1LBP.Immunofluorescence was used to detect the expressionof NLRP3 in each group.The proteins of NLRP3 inflammasome including NLRP3，Caspase-1，apoptosis-asso-ciated speck-like protein containing CARD（ASC）and gasdermin D（GSDMD）protein were determined byWestern blot.The level of interleukin IL-1茁 and IL-18 was measured by enzyme chain immunosorbentassay（ELISA）.ResultsImmunofluorescence results showed that NLRP3 protein was mainly expressed in the cyto-plasm of retinal pigment epithelial cells，and compared with the normal group，the expression level of NLRP3protein was increased in high glucose group（P0.05）；Compared with the high glucose group，the expressionlevel of NLRP3 protein was significantly decreased in LBP medium and high concentration groups（P0.01）.Western blot results showed that compared with the normal group，the relative expression levels of NLRP3，Cas-pase-1，ASC and GSDMD were increased in the high glucose group（P all0.05）；Compared with the highglucose group，the relative expression levels of NLRP3，Caspase-1，ASC and GSDMD were decreased in LBPmedium and high concentration groups（P all0.05）.ELISA results showed that compared with normal group，the expression levels of IL-1茁 and IL-18 were increased in high glucose group（P all0.05）；Compared with thehigh glucose group，the expression levels of IL-1茁 and IL-18 were decreased in LBP medium and high concen-tration groups（Pall0.05）.ConclusionLBP protect human retinal pigment epithelial cells with high glu-cose by inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome/pyroptosis pathway.Key words：lycium barbarum polysaccharide；human retinal pigment epithelial cells；NLRP3 inflammasome；pyroptosis；interleukinactivationandcelldeath J .CellMolImmunol，2021，18（9）：2114-2127.26 刘可欣，李志坚，刘翔宇.GSDMD 介导的细胞焦亡在眼科疾病中的研究进展 J.眼科新进展，2021，41（11）：1085-1088，1096.27 崔家霖，邢俊艳，王莺洁，等.糖眼宁调控 Nod 样受体蛋白 3 炎症小体通路对糖尿病大鼠视网膜细胞焦亡的影响 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