高效表达人源可溶性转铁蛋白受体sTfR抗原及多克隆抗体制备和应用.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.05.111高效表达人源可溶性转铁蛋白受体 sTfR 抗原及多克隆抗体制备和应用卢振华1,2,吴振兴1,袁新松3,王 剑1,吴坚平2(1.宁波普瑞柏生物技术股份有限公司,宁波 315033;2.浙江大学 化学工程与生物工程学院,杭州 310027;3.合肥师范学院 化学与化学工程学院,合肥 230601)摘 要 通过多种策略构建人源可溶性转铁蛋白受体(sTfR)抗原的高效表达体系获得足量的 sTfR 抗原,并免疫得到稳定的兔多克隆抗体,以此制备高灵敏度的体外检测试剂盒。首先通过筛选表达体系,最终确定以人胚胎肾细胞293(HEK293)表达体系进行 sTfR 抗原的表达,表达量可达 0.52 mg/mL。为进一步增强 sTfR 表达量,优选 CMV 启动子及白蛋白信号肽,使抗原的表达量进一步增强至 0.86 mg/mL。随后优选 0.3 mg 的 sTfR 抗原为免疫剂量,持续 5 次免疫新西兰兔后可获得高效价的 sTfR 兔多克隆抗体,该抗体耦联胶乳微球制成试剂盒后进行样本检测,其检测效果准确稳定。sTfR 试剂盒及原料的开发显著降低生产成本,也为其他检测项目的试剂盒开发提供参考意义。关键词 可溶性转铁蛋白受体;重组表达;多克隆抗体;体外诊断;免疫中图分类号 Q78;R446.62文献标识码 B文章编号 2095-1736(2023)05-0111-05Efficient expression of human soluble transferrin receptor sTfR antigen and the preparation and application of its polyclonal antibodyLU Zhenhua1 2 WU Zhenxing1 YUAN Xinsong3 WANG jian1 WU Jianping2 1.Ningbo Purebio Biotechnology Co.Ltd.Ningbo 315033 China 2.College of Chemical and Biological Engineering Zhejiang University Hangzhou 310027 China 3.College of Chemistry and Chemical Engineering Hefei Normal University Hefei 230601 China Abstract An efficient expression system of human soluble transferrin sTfR antigen was constructed by various strategies and the stable rabbit polyclonal antibody was obtained by immunization.High sensitivity in vitro detection kit was developed using sTfR antigen and antibody.A suitable expression system was chosen to express sTfR in human embryonic kidney cells 293 HEK293 and the expres-sion amount of sTfR was 0.52 mg/mL.To further improve the expression level of sTfR the CMV promoter and the albumin signal pep-tide were added leading to a significant increase in the amount of sTfR 0.86 mg/mL.High titer of rabbit sTfR polyclonal antibody was obtained using 0.3 mg sTfR antigen for the fifth immunization.When using sTfR kit to analysis human serum samples the kit de-veloped in this work was credible and stable.The development of sTfR kit and raw materials had significantly reduced the production cost.This work also offered an efficient approach for the development of other in vitro diagnostic reagents.Keywords serum transferrin receptor recombinant expression polyclonal antibody in vitro diagnosis immunity 转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是一种单次穿膜的糖蛋白,由两个对称的、以二硫键连接在一起的亚单元组成1-2,可以介导含有铁的铁蛋白以胞吞的形式进入细胞,在血红蛋白等含铁蛋白的合成中有着极其重要的作用3-5。可溶性转铁蛋白受体(serum transferrin receptor,sTfR)是转铁蛋白受体 TfR 通过细胞表面的蛋白水解作用而产生的,缺少完整转铁蛋白受体的前 100 个氨基酸,其可以和携带铁的转铁蛋白结合形成复合体,并进行铁的转运,与人体中红细胞生成和铁含量成正相关6-7。111第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023收稿日期:2022-07-11;最后修回日期:2022-09-05基金项目:安徽高校自然科学研究项目(KJ2021A0932)作者简介:卢振华,博士,研究方向为 IVD 原料开发,E-mail:11728005 通信作者:吴坚平,博士,教授,研究方向为生物催化与转化,E-mail:wjp sTfR 在血清中的浓度可以作为一些疾病判断以及治疗效果的重要指标,可以反映机体对铁的需求,在疾病诊断以及药物疗效监测方面有着重要的意义7-10。当机体铁缺乏时,会合成较多的 sTfR,使更多的铁蛋白进入细胞用于合成蛋白质,使铁的利用率升高11-12。sTfR 作为介导功能性铁的重要媒介,其浓度相较转铁蛋白的浓度更加稳定,不受急性时相反应的影响,更加适合作为诊断的指标。因此,测定 sTfR 的浓度可以鉴定如急性肝功能异常造成的缺铁性贫血等一些疾病13。在临床实践中,血清铁蛋白、sTfR 和血红蛋白联合检测能更加准确地判断患者的铁缺乏状态14。在怀孕时 sTfR 值也会升高,但此时不作为功能性铁缺乏的指标15-17。另外,sTfR 的浓度还可以作为促红细胞生成素药物治疗效果的重要指标参数18。sTfR 在糖尿病诊断中也有重要的诊断意义,体内如果有较高的铁含量则有患非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的可能,因为 NIDDM 是铁过多性疾病的并发症,如血色素沉着症等19。目前,sTfR 的主要检测手段有酶联免疫吸附法(ELISA)、自 动 免 疫 比 浊 法(IdeA STFE-IT assay)等20-22,其中以免疫比浊法的灵敏度以及准确性最高,操作最为简便。本研究通过 HEK293 细胞高效表达重组人 sTfR 抗原,并进行纯化,利用该抗原免疫新西兰兔获得高效价抗体后进行抗体纯化,纯化后的抗体进行胶乳耦联制成试剂后进行样本比对。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒及试剂HEK293 细胞购自珠海恺瑞生物科技有限公司;质粒 pCDNA3.4-TOPO 购自赛默飞世尔;表达质粒pCDNA3.4-sTfR(添加组氨酸标签及分泌信号肽)由安徽通用生物科技有限公司合成并构建。1.1.2 主要试剂大肠杆菌 E.coli DH5a 为本公司保藏;HEK293 细胞表达套装购自珠海恺瑞生物科技有限公司;CHO 细胞表达套装、蛋白 Marker 购自赛默飞世尔;sTfR 单克隆抗体 11F5 购自海肽生物科技(上海)有限公司;sTfR检测试剂盒为罗氏市售试剂盒,其他试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 sTfR 蛋白表达培养 HEK293 细胞至细胞密度 2106 mL-1,且镜检活细胞数大于98%进行转染操作:以细胞悬液的 1/20 准备试剂 KPM 并加入 1 g/mL(DNA/细胞培养液体积)的质粒,混匀后进行膜过滤除菌;另一支 1/20 的 KPM 中加入1 g/L 的转染试剂 TA-293,两者混匀并静置 10 min 后加入细胞悬液中进行转染,并于转染后第 2 天加入0.6%的 KE-293 进行补料,于转染后第 6 天收集细胞上清液,细胞样本送北京擎科生物科技有限公司进行mRNA 的相对转录水平检测(相对定量 qPCR 实验)。1.2.2 sTfR 抗原抗体纯化sTfR 抗原纯化采用 Ni 柱亲和层析,上样之前先用10 倍柱体积超纯水冲洗层析柱,5 倍柱体积平衡液平衡;随后将细胞上清液进行上样,上样完成后再用 5 倍柱体积平衡液进行平衡;待杂蛋白流穿后用洗脱缓冲液进行蛋白洗脱并收集进行 SDS-PAGE,并置于 PBS缓冲液(pH 7.4)中进行透析,透析后加入 10%甘油并置于-20 保存。sTfR 抗体采用 Protein A 柱进行纯化,操作过程同 sTfR 抗原纯化。1.2.3 酶联免疫吸附测定sTfR 免疫原性 ELISA 试验方案:在 96 孔板用 CBS将捕获抗体稀释至合适浓度,每孔 100 L,封上胶条,4 包被过夜。第 2 天弃去液体并洗板,随后加入200 L 1%的明胶溶液,37 封闭 2 h;弃液洗板后加入100 L 稀释至 100 ng/L 的 sTfR 抗原,37 孵育 1 h;弃液洗板后加入 100 L 稀释一定倍数的一抗(兔血清),并逐级对半稀释,最后一排不加一抗设为阴性对照,37 孵育 1 h;弃液洗板后加入 14 000 比例稀释的HRP 标记的二抗(羊抗兔),每孔加入 100 L 二抗,37 孵育 0.5 h;弃液洗板后加入 100 L TMB,37 孵育 10 min 后加入 50 L 终止液并于 OD450 检测吸光度。免疫压制 ELISA 试验方案(竞争法):在 96 孔板用 CBS 包被 sTfR 抗原,每孔 100 ng,封上胶条,4 包被过夜。第 2 天弃液洗板后加入 200 L 1%的明胶溶液,37 封闭 2 h;弃液洗板后每两个孔为一组:其中一孔加入 100 L 人血清样本,另一孔加入等量的生理盐水,37 孵育 1 h;弃液洗板后各加入 100 L 稀释一定倍数的一抗(兔血清),37 孵育 1 h;弃液洗板后加入 14 000 比例稀释的 HRP 标记的二抗(羊抗兔),之后操作同 sTfR 免疫原性 ELISA 试验方案。1.2.4 sTfR 抗原抗体热稳定性sTfR 加速稳定性检测:将 sTfR 抗原平均分成若干份(1 mg/mL),置于 37 培养箱中,每隔 2 d 进行生化检测,共进行 14 d。sTfR 抗原长期稳定性检测:在纯化好的 sTfR 抗原中加入 30%的甘油,并平均分成若干份(1 mg/mL),置于-20 冰箱中冻存,每隔 1 个月取出 1 份进行生化检测。sTfR 抗体长期稳定性检测:抗体保存方法同抗原一致,并每月将 1 mg/mL 的抗体按照相同工艺制成检测试剂,测定 sTfR 抗原含量,并以首次测定的 sTfR 抗原含量作为 100%相对活性。1.2.5 sTfR 生化检测以人可溶性转铁蛋白标准品为校准品,在日立全自动生化分析仪 7180 上采用两点终点法进行测定,反应方向为上升反应,校准方式为 Spline,测定波长为211第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023570 nm,测定温度为37,取2 L 样本和120 L 试剂R1(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)加入反应杯,由仪器自动混匀并于 37 孵育 3 min,随后加入 120 L 的试剂R2(sTfR 和胶乳微球耦联后加入 R1 相近的缓冲液配置而成),由仪器自动混匀后在 570 nm 处读取第一读数点 A1和第二读数点 A2,通过软件计算A=A2-A1并根据校准曲线计算 sTfR 浓度。2 结果与分析2.1 sTfR 抗原表达体系筛选将 pCDNA3.4-sTfR 质粒转染入 HEK293 细胞和CHO 细胞中进行 sTfR 蛋白的表达,结果如图 1 所示,sTfR 表达条带明显,大小为 7090 ku(sTfR 分子质量理论大小为 75.5 ku)。通过 7180 生化分析仪测定纯化后的蛋白含量发现,CHO 细胞表达系统蛋白产量可达 0.68 mg/mL,而 HEK293 细胞表达系统蛋白产量可达 0.52 mg/mL。由于 HEK293 的单位蛋白生产成本更低且蛋白产量尚可,因此,优选 HEK293 作为表达宿主。1:CHO 细胞表达体系;M:蛋白 Marker;2:HEK293 细胞表达体系。图 1 不同系统表达 sTfR 蛋白电泳图(纯化后)Figure 1 SDS-PAGE of sTfR protein expressing using differentsystems(after purification)2.2 sTfR 抗原增强表达为提高 sTfR 蛋白的表达水平,通过筛选表达启动子以及分泌信号肽进行表达强化。在 pCDNA 3.4 的CMV 启动子基础上选择哺乳动物细胞表达常用的EF1a 以及 CAG 启动子,以 pCDNA 3.4 为骨架载体进行启动子替换并进行 sTfR 蛋白表达,如图 2(a)所示。CMV 启动子和 CAG 启动子的表达强度相差不大,EF1a启动子在这 3 种启动子中表达强度最弱。在转录水平mRNA 定量分析中,发现 CMV 启动子转录水平最高,CAG 启动子略低于 CMV 启动子,EF1a 启动子处于较低水平图 2(b),因此,优选 CMV 启动子表达 sTfR。选取人体中已知大量存在的蛋白信号肽,分别为Kappa 轻链信号肽、重链信号肽以及白蛋白信号肽,以pCDNA 3.4 为骨架构建质粒进行表达后,表达情况如图 2(c)所示,以白蛋白信号肽为分泌肽的表达体系sTfR 蛋白表达增强明显,从转录水平图 2(d)中也能明显看出白蛋白信号肽的效果较好。通过优选 CMV 启动子和白蛋白信号肽,sTfR 蛋白的表达水平可达到0.86 mg/mL。SDS-PAGE 图中杂带经 10 d 的 37 孵育较第 1 天无明显变化,为纯化残留图 2(e)。(a)1:CMV 启动子;M:蛋白 Marker;2:CAG 启动子;3:EF1a 启动子。(b)不同启动子下的 sTfR 相对转录水平。(c)1:Kappa 轻链信号肽;2:白蛋白信号肽;3:重链信号肽。(d)不同信号肽下的 sTfR 相对转录水平。(e)1:第 1 天;2:第 5 天;3:第 10 天;M:蛋白 Marker。图 2 利用启动子和分泌信号肽增强 sTfR 表达Figure 2 Enhanced sTfR expression using promoter and secretedsignal peptides2.3 sTfR 抗原免疫剂量确定通过优化后的表达体系对 sTfR 抗原进行表达和纯化,以不同的免疫剂量对新西兰兔进行免疫。免疫结果如表 1 所示(ELISA 夹心法,包被 11F5 外购单抗)。0.1 mg/只剂量组血清抗体滴度在1632 mIU/mL,其效价GMT 为21,相比第2、3、4 次免疫,抗体滴度上升趋势不明显;0.3 mg/只剂量组血清抗体滴度在64256 mIU/mL,其效价 GMT 为 128,相比第 2、3、4 次免疫血清抗体滴度均有不同程度的提高;0.5 mg/只剂量组血清效价和0.5 mg/只剂量整体效价无明显提高,效价 GMT 和0.3 mg 剂量组相同(图3)。因此,优选0.3 mg 抗原作为免疫剂量,5 次免疫后可取全血纯化制备多克隆抗体。311第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023表 1 sTfR 兔多克隆抗体滴度Table 1 Rabbit polyclonal antibody titer of sTfR 兔子编号Rabbit number抗体滴度 Antibody titer/(mIU/mL)第 2 次免疫Titer of secondimmunization第 3 次免疫Titer of thirdimmunization第 4 次免疫Titer of forthimmunization第 5 次免疫Titer of fifthimmunization效价 GMTTiter GMT18481624416323288164881616516816322168163264781632128824166498326425610163212825612811816321281281664641316326425614816641281581632128128图 3 不同免疫剂量下的效价 GMT 分析Figure 3 Analysis of titer GMT at different immune dose2.4 sTfR 抗体血清压制sTfR 抗体纯化并透析(PBS 缓冲液,pH 7.4)后,对抗体进行免疫压制试验观察抗体免疫效果,随机抽取 5个人血清样本进行 ELISA。免疫压制效果如图 4 所示(对应 OD450值见表 2),1 号、2 号、3 号人血清样本几乎能够完全压制,4 号、5 号血清压制效果也很明显,表明sTfR 兔抗血清能够很好地和人 sTfR 抗原结合。图 4 sTfR 兔抗体免疫压制试验Figure 4 Immunosuppression experiments of sTfR rabbit antibody表 2 免疫压制试验 OD450检测值Table 2 OD450 of immunosuppression experiments样本编号 Sample number吸光度 OD45013.711+sTfR antibody0.1223.432+sTfR antibody0.1733.683+sTfR antibody0.1143.723+sTfR antibody1.1353.575+sTfR antibody1.252.5 sTfR 抗原抗体稳定性sTfR 抗原加速稳定性如图 5(a)所示,表明 sTfR抗原在 PBS 缓冲液中(pH 7.4)较为稳定,37 孵育14 d 仍有 95%以上的活性蛋白。sTfR 抗原长期稳定性(-20)中,sTfR 抗原在一年的稳定性监测中均未出现明显下降图 5(b),sTfR 抗体在 PBS 缓冲液(pH 7.4),-20 的条件下,也可以保持稳定图 5(c)。综上,sTfR 抗原抗体均具有良好的稳定性,符合工业化生产需求。2.6 sTfR 兔多克隆抗体的应用将胶乳微球和所生产的 sTfR 兔抗进行共价耦联,并置于主要成分为 pH 7.4 的 0.05 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中,混匀作为 R2 试剂,同时将pH 7.4 的 0.05 mmol/L Tris 缓冲液作为 R1 试剂。利用该试剂测定人血清样本中 sTfR 的含量,同时,利用进口成品试剂对同一个样本进行测定,样本比对结果如图 6 所示。结果表明,所生产的 sTfR 检测灵敏度高且线性宽,满足临床检验的检测需求。411第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023(a)sTfR 抗原在 37,PBS 缓冲液(pH 7.4)环境下的稳定性;(b)sTfR 抗原(含甘油)在-20,PBS 缓冲液(pH 7.4)环境下的稳定性;(c)sTfR 兔抗(含甘油)在-20,PBS 缓冲液(pH 7.4)环境下的稳定性。图 5 sTfR 抗原抗体稳定性实验Figure 5 Stability experiments of sTfR antigen and antibody图 6 自研试剂和进口试剂样本比对实验Figure 6 Sample comparison experiments between self-developed reagent and imported reagent3 结论本文优选 HEK293 细胞搭配 pCDNA 3.4 质粒对sTfR 抗原进行表达,表达量可达 0.52 mg/mL,并筛选较优的 CMV-F 启动子及白蛋白信号肽,使表达量提升至 0.86 mg/mL。使用该抗原对新西兰兔进行免疫,以0.3 mg/只的剂量免疫 5 次,所产生的兔 sTfR 抗体可以达到最高的效价。利用该抗体进行人血清免疫压制试验能产生很好的压制效果。同时,所制备的 sTfR 抗原和抗体具有良好的稳定性。参考文献 1 SCHNEIDER C OWEN M J BANVILLE D et al.Primary struc-ture of human transferrin receptor deduced from the mRNA sequence J.Nature 1984 311 675-678.2 LAWRENCE C M RAY S BABYONYSHEV M et al.Crystal structure of the ectodomain of human transferrin receptor J.Sci-ence 1999 286 77-782.3 LAMBERT L A.Molecular evolution of the transferrin family and as-sociated receptors J.BBA-General Subjects 2012 1820 3 244-255.4 WANG J PANTOPOULOS K.Regulation of cellular iron metabo-lism J.Biochemical Journal 2011 434 365-381.5 PONKA P BEAUMONT C RICHARDSON D R et al.Function and regulation of transferring and ferritin J.Seminars in Hematolo-gy 1998 35 35-54.6 LAM Q T SCHNEIDER H G.Serum transferrin receptor J.Amer-ican Journal of Clinical Pathology 2001 116 3 446.7 RAY A NDUGWA C MMIRO F et al.Soluble transferrin receptor as an indicator of iron deficiency in HIV-infected infants J.Annals of Tropical Paediatrics 2007 27 1 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