食品中细菌菌落总数的测定课件.ppt

菌落菌落总数的数的测定定 (GB 4789.2 (GB 4789.22010)2010)1.一、一、目的目的 1 1、学学习并掌握食品中菌落并掌握食品中菌落总数数测定方法和原理。定方法和原理。22、了解菌落、了解菌落总数数测定在定在对被被样品品进行行卫生学生学评价中的意价中的意义 。2.二、原理二、原理 细菌数量的表示方法由于所采用的菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：数方法不同而有两种：菌落菌落总数数和和细菌菌总数数。3.1 1、菌落、菌落总数数 是指食品是指食品检样经过处理，在一理，在一定条件下培养后，所得定条件下培养后，所得1g1g或或1mL1mL检样中形中形成的成的细菌菌落菌菌落总数。以数。以 CFU/g CFU/g（mLmL）来表）来表示。示。一定条件包括培养基成分、培养一定条件包括培养基成分、培养温度和温度和时间、pHpH、是否需要氧气等。、是否需要氧气等。4.按国家按国家标准方法准方法规定，即在定，即在需氧需氧情况情况下，下，36 136 1培养培养482 h482 h，能在，能在平板平板计数数琼脂脂上生上生长发育的育的细菌菌落菌菌落总数。数。所以所以厌氧或微需氧菌、有特殊氧或微需氧菌、有特殊营养要求养要求的以及非嗜中温的的以及非嗜中温的细菌，由于菌，由于现有条件有条件不能不能满足其生理需求，故足其生理需求，故难以繁殖生以繁殖生长。5.菌落菌落总数数并不表示并不表示实际中的所有中的所有细菌菌总数，也不能区分其中数，也不能区分其中细菌的种菌的种类，只包括一群在只包括一群在计数平板数平板琼脂中生脂中生长发育、育、嗜中温的需氧和兼性嗜中温的需氧和兼性厌氧的氧的细菌菌落菌菌落总数，数，所以有所以有时被称被称为杂菌数菌数，需氧菌数需氧菌数等。等。6.2 2 菌落菌落总数数测定的定的卫生学意生学意义 （1 1）菌落）菌落总数主要作数主要作为判判别食食品被品被污染程度染程度的的标志，也可以志，也可以应用用这一一方法方法观察察细菌在食品中繁殖的菌在食品中繁殖的动态，以，以便便对被被检样品品进行行卫生学生学评价价时提供依提供依据。据。7.（2 2）食品中食品中细菌菌菌落菌落总数越多数越多，则食品食品含有致病菌含有致病菌的可能性越大，食品的可能性越大，食品质量越差量越差；菌落；菌落总数越小，数越小，则食品含有食品含有致病菌的可能性越小。致病菌的可能性越小。须配合配合大大肠菌群菌群和致病菌和致病菌的的检验，才能，才能对食品做出食品做出较全全面的面的评价。价。8.3 3、细菌菌总数数 指一定数量或面指一定数量或面积的食品的食品样品品经过适当的适当的处理后，在理后，在显微微镜下下对细菌菌进行直接行直接计数。其中包括各种数。其中包括各种活菌数活菌数和尚未消失的和尚未消失的死菌数死菌数。细菌菌总数也称数也称细菌直接菌直接显微微镜数。通常以数。通常以1 g1 g或或1 mL1 mL样品品中的中的细菌菌总数来表示。数来表示。9.三三、材料材料 1 1、食品食品检样 2 2、培养基培养基 平板平板计数培养基，无菌生理数培养基，无菌生理盐水或磷酸水或磷酸盐缓冲液冲液 3 3、其它其它 无菌培养皿，无菌吸管，无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培炉、恒温培养箱等。养箱等。10.四、四、流程流程 1 1、检样 2 2、做几个适当倍数的稀做几个适当倍数的稀释液液3 3、选择2323个适宜稀个适宜稀释度各度各1 mL,1 mL,分分别加入加入灭菌平皿内菌平皿内 4 4、平皿内、平皿内倾注注151520 mL20 mL琼脂培养基，混匀脂培养基，混匀 5 5、36 136 1培养培养482482小小时或（或（242242）小）小时6 6、记录稀稀释倍数和相倍数和相应的各平板菌落数量的各平板菌落数量7 7、计算菌落算菌落总数数 报告告 11.五、五、步步骤 (一一)取取样、稀、稀释和培养和培养 1 1、以无菌操作取以无菌操作取检样25g25g（mLmL），），放于放于225mL225mL灭菌生理菌生理盐水或磷酸水或磷酸盐缓冲液冲液 的的灭菌玻璃菌玻璃瓶内（瓶内瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或置适量的玻璃珠）或灭菌乳菌乳钵内，内，经充分振充分振荡或研磨制成或研磨制成1:101:10的均匀稀的均匀稀释液。液。固体和半固体固体和半固体检样在加入稀在加入稀释液后，最液后，最好置好置灭菌均菌均质器中以器中以8000800010000r/min10000r/min的速度的速度处理理1 12min2min，制成，制成1:101:10的均匀稀的均匀稀释液。液。12.2 2、用、用1 mL1 mL灭菌吸管吸取菌吸管吸取1:101:10稀稀释液液1 mL1 mL，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9 mL9 mL灭菌生理菌生理盐水或磷酸水或磷酸盐缓冲液的冲液的试管管内，内，振振摇试管管或反复吹打混合均匀，或反复吹打混合均匀，制成制成1:1001:100的稀的稀释液。液。13.3 3、另取、另取1 mL1 mL灭菌吸管，按上菌吸管，按上项操作操作顺序，制序，制1010倍倍递增稀增稀释液，如液，如此每此每递增稀增稀释一次即一次即换用用1 1支支1 mL1 mL吸吸管。管。14.4 4、根据、根据标准要求或准要求或对污染情况染情况的估的估计，选择2 23 3个个适宜稀适宜稀释度，分度，分别在制作在制作1010倍倍递增稀增稀释的同的同时，以吸取，以吸取该稀稀释度的吸管移取度的吸管移取1ml1ml稀稀释液于液于灭菌平皿菌平皿中，每个稀中，每个稀释度做度做两个平皿两个平皿。同同时分分别取取1ml1ml稀稀释液（不含液（不含样品）加入两个品）加入两个灭菌平皿内作菌平皿内作空白空白对照照。15.5 5、稀、稀释液移入平皿后，将冷液移入平皿后，将冷却至却至4646琼脂培养基注入平皿脂培养基注入平皿约151520ml20ml，并，并转动平皿，平皿，混合均匀混合均匀。16.6 6、待待琼脂凝固后，翻脂凝固后，翻转平板，平板，置置361361温箱内培养温箱内培养482h482h，水，水产品品301301温箱内培养温箱内培养723h723h。如如样品中可能含有在品中可能含有在琼脂培养基脂培养基表面弥漫生表面弥漫生长的菌落的菌落时，可在凝固后的，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（脂培养基（约4 4毫升），毫升），凝固后培养。凝固后培养。17.18.（二）（二）菌落菌落记录方法方法 做平板菌落数做平板菌落数记录时，可用肉眼，可用肉眼观察，必要察，必要时用放大用放大镜检查，以防，以防遗漏。漏。在在记下各平皿的菌落下各平皿的菌落总数后，求出数后，求出同稀同稀释度度的各的各平板平均菌落数平板平均菌落数。到达到达规定培养定培养时间，应立即立即计数。如数。如果不能立即果不能立即计数，数，应将平板放置于将平板放置于0 044，但，但不要超不要超过24h24h。19.1 1、平皿菌落数的平皿菌落数的选择 选取菌落数在取菌落数在3030300300之之间的平板作的平板作为菌落菌落总数数测定定标准。每一个稀准。每一个稀释度度应采用采用两个平皿两个平皿，大于大于300300的可的可记为多不可多不可计。20.2 2、其中一个平板有、其中一个平板有较大大片状菌片状菌落落生生长时，则不宜采用，而不宜采用，而应以无片状以无片状菌落生菌落生长的平板作的平板作为该稀稀释度的菌落数；度的菌落数；若片状菌落若片状菌落不到平板的一半不到平板的一半，而，而其余一其余一半半中菌落分布又很中菌落分布又很均匀均匀，则可以可以计算算半半个平板后乘以个平板后乘以2 2，以代表一个平板的菌落，以代表一个平板的菌落数。数。21.3 3、当平板上有、当平板上有链状菌落生状菌落生长时，如呈，如呈链状生状生长的菌落之的菌落之间无任无任何明何明显界限，界限，则应作作为一个菌落一个菌落计，如存在有几条不同来源的如存在有几条不同来源的链，则每条每条链均均应按一个菌落按一个菌落计算，不要把算，不要把链上上生生长的每一个菌落分开的每一个菌落分开计数。数。22.（三）菌落（三）菌落总数的数的计算算 1 1、若只有一个稀、若只有一个稀释度平板上的菌落数度平板上的菌落数在适宜在适宜计数范数范围内，内，计算两个平板菌落数算两个平板菌落数的的平均平均值，再将平均，再将平均值乘以相乘以相应稀稀释倍数倍数，作作为每每g g（mLmL）中菌落）中菌落总数数结果。果。23.试样例次例次稀稀释度度选定定计数稀数稀释度度菌量菌量/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4 -4 （1.561.56）2.6x102.6x105 53 3271271606012121010-2 2 （2.22.2）2.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法无法计数数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 624.2 2、若有两个、若有两个连续稀稀释度的平板菌落数度的平板菌落数在适宜在适宜计数范数范围内内时，应应以两者比以两者比值决定。决定。若其比若其比值小于小于2 2，应报告两者的平均数；告两者的平均数；若大于等于若大于等于2 2，则报告稀告稀释度度较小的菌落小的菌落数。数。25.THANK YOUSUCCESS4/16/202426.试样例次例次稀稀释度度选定定计数稀数稀释度度菌量菌量/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 3271271606012121010-2 22.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法无法计数数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 627.3 3、若所有稀若所有稀释度的平板菌落度的平板菌落数数均均300300，则取取最高稀最高稀释度度的平均菌落的平均菌落数乘以稀数乘以稀释倍数倍数计算。算。28.试样例次例次稀稀释度度选定定计数稀数稀释度度菌量菌量/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 3271271606012121010-2 22.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法无法计数数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 629.4 4、若所有稀、若所有稀释度平板菌落数度平板菌落数均均3030，则以以最低稀最低稀释度度的平均菌落数乘稀的平均菌落数乘稀释倍数倍数计算。算。5 5、若所有稀、若所有稀释度平板均度平板均无菌落无菌落生生长，则应按按1300300，有的又，有的又3030，则应以以最接最接近近300300或或3030的平均菌落数乘以稀的平均菌落数乘以稀释倍数倍数计算。算。32.（四）（四）菌落菌落计数数报告方法告方法 1 1、菌落数在、菌落数在1 1100100时，按四舍，按四舍五入五入报告告两位有效数字。两位有效数字。2 2、菌落数菌落数 100100时，第三位数，第三位数字按四舍五入字按四舍五入计算，取算，取前面两位有效数字前面两位有效数字，为了了缩短数字后面的零数，也可以短数字后面的零数，也可以1010的指的指数表示。数表示。33.3 3、若所有平板上、若所有平板上为蔓延菌落而无蔓延菌落而无法法计数，数，则报告告菌落蔓延菌落蔓延。4 4、若空白若空白对照上有菌落生照上有菌落生长，则此次此次检测结果无效果无效。5 5、称重取、称重取样以以CFU/g CFU/g 为单位位报告，体告，体积取取样以以CFU/mLCFU/mL 为单位位报告。告。34.注意事注意事项 1 1、无菌操作、无菌操作 操作中必操作中必须有有“无菌操作无菌操作”的概念，的概念，所用玻璃器皿必所用玻璃器皿必须是完全是完全灭菌的。所用剪刀、菌的。所用剪刀、镊子等器具也必子等器具也必须进行消毒行消毒处理。理。样品如果有品如果有包装，包装，应用用75%75%乙醇乙醇在包装开口在包装开口处擦拭后取擦拭后取样。操作操作应当在当在超超净工作台工作台或或经过消毒消毒处理的理的无菌无菌室室进行。行。35.2 2、采、采样的代表性的代表性 如系固体如系固体样品，取品，取样时不不应集中一集中一点，宜多采几个部位。点，宜多采几个部位。固体固体样品品必必须经过均均质或研磨，或研磨，液体液体样品品须经过振振摇，以以获得均匀稀得均匀稀释液。液。36.3 3、稀、稀释液液 样品稀品稀释液主要是液主要是灭菌生理菌生理盐水水，或，或磷酸磷酸盐缓冲液冲液（或（或0.10.1蛋白蛋白胨水水），后），后者者对食品已受食品已受损伤的的细菌菌细胞有一定的保胞有一定的保护作用。如作用。如对含含盐量量较高的食品（如高的食品（如酱油）油）进行稀行稀释，可以采用，可以采用灭菌蒸菌蒸馏水水。37.4 4、每、每递增稀增稀释一次即一次即换用用1 1支支1ml1ml灭菌菌吸管。吸管。5 5、倾注用培养基注用培养基应在在4646水浴内保温水浴内保温，温度温度过高会影响高会影响细菌生菌生长，过低低琼脂易脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，浴，应以皮肤感受以皮肤感受较热而不而不烫为宜。宜。38.6 6、倾注培养基的量注培养基的量规定不一，从定不一，从121220ml20ml不等，一般以不等，一般以15ml15ml较为适宜，平适宜，平板板过厚可影响厚可影响观察，太薄又易于干裂。察，太薄又易于干裂。倾注注时，培基底部如有沉淀物，培基底部如有沉淀物，应将底将底部弃去，以免与菌落混淆而影响部弃去，以免与菌落混淆而影响计数数观察。察。39.7 7、为使菌落能在平板上均匀分使菌落能在平板上均匀分布，布，检液加入平皿后，液加入平皿后，应尽快尽快倾注培养注培养基并基并旋旋转混匀混匀，可正反两个方向旋，可正反两个方向旋转，检样从开始稀从开始稀释到到倾注最后一个平皿所注最后一个平皿所用用时间不宜超不宜超过20min20min，以防止，以防止细菌有所菌有所死亡或繁殖。死亡或繁殖。40.8 8、培养温度一般、培养温度一般为3737（水（水产品的培养温度，由于其生活品的培养温度，由于其生活环境水温境水温较低，故多采用低，故多采用3030）。培养）。培养时间一般一般为48h48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h24h的培养即可的培养即可计数。培养箱数。培养箱应保持一定的湿度，保持一定的湿度，琼脂平脂平板培养板培养48h48h后，培养基失重不后，培养基失重不应超超过1515。41.9 9、为了避免食品中的微小了避免食品中的微小颗粒或培粒或培基中的基中的杂质与与细菌菌落菌菌落发生混淆，不易生混淆，不易分辨，可同分辨，可同时作一稀作一稀释液与液与琼脂培基混脂培基混合的平板，不合的平板，不经培养，而于培养，而于44环境中放境中放置，以便置，以便计数数时作作对照照观察。察。42.六、六、结果果 1 1、将将实验测出的出的样品数据以表品数据以表格的方式格的方式报告。告。22、对样品菌落品菌落总数作出是否符数作出是否符合合卫生要求的生要求的结论。43.报告方式告方式样品品稀稀释液及液及菌落数菌落数选择稀稀释度度报告告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品品名称名称原始原始数据数据计算公式算公式报告告平均平均44.七、思考七、思考 1 1、什么是什么是细菌菌落菌菌落总数（数（cfucfu）？）？2 2、细菌菌落菌菌落总数数测定的定的卫生学意生学意义是什是什么？么？3 3、倒培养基后，、倒培养基后，为什么要倒置培养？什么要倒置培养？4 4、为什么什么营养养琼脂培养基在使用前要脂培养基在使用前要保持在保持在461461的温度？的温度？45.酱油（油（GB/T2717-2003GB/T2717-2003）：细菌菌落菌菌落总数：数：30000 CFU/mL 30000 CFU/mL大大肠菌群：菌群：30MPN/100mL 30MPN/100mL肠道致病菌：道致病菌：不得不得检出出46.全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999GB5410-1999）：特特级 一一级 二二级细菌菌落菌菌落总数：数：20000 30000 20000 30000 5000050000（CFU/mlCFU/ml）大大肠菌群菌群 40 90 40 90 9090（MPN/100gMPN/100g）肠道致病菌：道致病菌：不得不得检出出 不得不得检出出 不得不得检出出47.巴氏巴氏杀菌乳（菌乳（GB5408.1-1999GB5408.1-1999）细菌菌落菌菌落总数：数：30000 CFU/mL 30000 CFU/mL大大肠菌群：菌群：90 MPN/100mL 90 MPN/100mL肠道致病菌：道致病菌：不得不得检出出48.生活生活饮用水用水卫生生标准（准（GB5749-2006GB5749-2006）菌落菌落总数数cfu/mlcfu/ml：100100总大大肠菌群菌群cfu/100mlcfu/100ml或或MPN/100ml MPN/100ml：不得：不得检出出耐耐热大大肠菌群菌群cfu/100mlcfu/100ml或或MPN/100ml MPN/100ml：不得：不得检出出大大肠埃希氏菌埃希氏菌cfu/100mlcfu/100ml或或MPN/100ml MPN/100ml：不得：不得检出出49.瓶瓶(桶桶)装装饮用用纯净水水卫生生标准准(GB(GB 17324-2003)17324-2003)细菌菌落菌菌落总数数cfu/mlcfu/ml：20 20大大肠菌群菌群MPN/100mlMPN/100ml：3 3致病菌致病菌(肠道致病菌和致病性球菌道致病菌和致病性球菌)：不得：不得检出出霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌cfu/ml:cfu/ml:不得不得检出出50.THANK YOUSUCCESS4/16/202451.