DB41∕T 987-2014 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程(河南省).pdf

ICS 65.020 B 16 DB41 河南省地方标准 DB41/T 9872014 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 Technical criterion for virus detection of virus-free sweet potato seed tuber or seedling 2014-12-30 发布 2015-03-01 实施 河南省质量技术监督局 发 布 DB41/T 9872014 I 目 次 前言 . II1 范围 . 12 术语和定义 . 12.1 脱毒组培苗 . 12.2 扩繁苗 . 12.3 脱毒种薯（苗） . 12.4 原原种 . 12.5 原种 . 12.6 大田用种 . 12.7 允许带毒率 . 22.8 允许病毒显症率 . 23 检测对象 . 24 抽样 . 24.1 组培苗抽样 . 24.2 田间抽样 . 25 检测方法 . 25.1 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法 . 25.2 指示植物检测法 . 35.3 聚合酶链式反应（PCR）检测法 . 35.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法 . 36 脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求 . 36.1 脱毒组培苗 . 36.2 原原种 . 36.3 原种 . 36.4 大田用种 . 3附录A（规范性附录） 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法 . 4附录B（规范性附录） 指示植物检测法 . 6附录C（规范性附录） 聚合酶链式反应（PCR）检测法 . 7附录D（规范性附录） 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法 . 9 DB41/T 9872014 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省农业科学院提出。 本标准起草单位：河南省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：张振臣、乔奇、秦艳红、张德胜、王爽、田雨婷、王永江。 DB41/T 9872014 1 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了脱毒甘薯种薯 （苗） 病毒检测的术语定义、 检测对象、 抽样、 检测方法和脱毒种薯 （苗）的检测程序及质量要求。 本标准适用于脱毒甘薯种薯（苗）的病毒检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 脱毒组培苗 virus-free tissue culture seedling 利用茎尖分生组织培养技术获得的再生组培苗， 经检测， 确认不含甘薯羽状斑驳病毒 （Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV） 、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV） 、甘薯 G 病毒（Sweet potato virus G，SPVG） 、甘薯病毒 2（Sweet potato virus 2，SPV2） 、甘薯褪绿斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV） 、甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯卷叶病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）的种苗。 2.2 扩繁苗 propagation seedling 由脱毒组培苗在无菌条件下或者防虫温（网）室内快繁后得到的甘薯苗。 2.3 脱毒种薯（苗）virus-free seed tuber or seedling 由脱毒组培苗经逐代繁殖增加种薯（苗）数量的种薯（苗）生产体系生产出来的种薯（苗）。分原原种、原种、大田用种三个级别。 2.4 原原种 pre-elite 用脱毒组培苗或扩繁苗在防虫网室内生产出的符合质量要求的种薯（苗）。 2.5 原种 elite 用原原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。 2.6 大田用种 certified seed 用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。 2.7 允许带毒率 permission virus-carrying rate 各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许携带病毒植株的比率。 2.8 允许病毒显症率 permission virus-symptom rate DB41/T 9872014 2 各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许出现病毒病症状植株的比率。 3 检测对象 甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）； 甘薯潜隐病毒（SPLV）； 甘薯G病毒（SPVG）； 甘薯病毒2（SPV2）； 甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）； 甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）； 甘薯卷叶病毒（SPLCV）。 4 抽样 4.1 组培苗抽样 4.1.1 脱毒组培苗 每株均应检测。 4.1.2 扩繁苗 随机抽取1%2%的扩繁苗检测。 4.2 田间抽样 4.2.1 原原种田抽样 定植后30 d、60 d、收获前2周，在目测的基础上，采用五点取样法。面积0.1 hm2，抽取数量为200株；0.1 hm2面积1 hm2，抽取数量为500株；每超出1 hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片1 g5 g，-20 以下低温保存。 4.2.2 原种田和大田用种田抽样 定植后30 d、收获前两周，在目测的基础上，采用五点取样法。取样方法及样品保存同4.2.1。 5 检测方法 5.1 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法 用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录A。 5.2 指示植物检测法 用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录B。 5.3 聚合酶链式反应（PCR）检测法 用于检测SPLCV。检测法见附录C。 DB41/T 9872014 3 5.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法 用于检测SPCSV。检测法见附录D。 6 脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求 6.1 脱毒组培苗 样品同时利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4种方法进行检测，4种方法的检测结果均应为阴性，即允许带毒率为0。 6.2 原原种 先目测调查样品的病毒显症率， 然后利用NCM-ELISA或指示植物法进行检测， 至少其中10%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。允许带毒率为0，允许病毒显症率为0。 6.3 原种 先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中5%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率2.0%，SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0。允许病毒显症率1.0%。 6.4 大田用种 先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中1%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率10.0%，SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0，允许病毒显症率5.0%。 DB41/T 9872014 4 A A 附 录 A （规范性附录） 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法 A.1 溶液配制 除非另有规定仅使用分析试剂。水为无菌蒸馏水。 A.1.1 Tris-HCl溶液c(Tris-HCl)=1.0 mol/L：称取60.60 g的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于 300 mL无菌蒸馏水中，加入32.5 mL浓盐酸（HCl），调节pH值为7.5，定容至500 mL。4 保存备用。 A.1.2 氯化钠溶液c(NaCl)=5.0 mol/L：称取292.20 g氯化钠，在800 mL无菌蒸馏水中，溶解定容至1 L。4 保存备用。 A.1.3 三羟甲基氨基甲烷溶液（TBS） ：分别取1 mol/L Tris-HCl（A.1.1）20 mL和5 mol/L 氯化钠 （A.1.2）100 mL，混合后用无菌蒸馏水定容至1 L。 A.1.4 洗涤缓冲液（TBST） ：0.5 mL 吐温-20（Tween-20）溶于1 L TBS（A.1.3）中。 A.1.5 抽提缓冲液：称取亚硫酸钠（Na2SO3）0.20 g溶于TBS（A.1.3）中，定容至100 mL。 A.1.6 封闭缓冲液：称取脱脂奶粉 0.50 g，分别量取曲拉通（Triton）X-100 0.5 mL和TBS（A.1.3） 25 mL。先将脱脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25 mL，加入Triton X-100混合均匀，现配现用。 A.1.7 抗体缓冲液：称取脱脂奶粉 1.00 g，量取TBS（A.1.3） 50 mL。先将脱脂奶粉溶解于少量TBS （A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至50 mL。 A.1.8 底物缓冲液：分别称取三羟甲基氨基甲烷6.10 g、氯化钠2.90 g、氯化镁（MgCl26H2O） 0.50 g，溶于400 mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500 mL。 A.1.9 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）储备液：称取0.04 g NBT溶于1.2 mL 70% N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20 避光保存备用。 A.1.10 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储备液：称取0.02 g BCIP溶于1.2 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20 避光保存备用。 A.1.11 NBT/BCIP底物溶液：先后取100 L NBT贮备液（A.1.9）和100 L BCIP贮备液（A.1.10） ，加入25 mL底物缓冲液中，振摇混匀,现配现用。 A.2 样品制备 将待测叶片用清水清洗干净，从每一样品上中下部的叶片上各取一直径约1 cm圆片。放入研钵中，加入3 mL抽提缓冲液充分研磨，6000 r/min离心2 min，取上清液点膜。 A.3 操作步骤 A.3.1 点膜 将划好方格（1 cm1 cm）的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取15 L上清液滴在膜上方格的正中，室温干燥15 min30 min。同时设阳性、阴性和空白对照。根据需要设置重复。 DB41/T 9872014 5 A.3.2 封闭 将干燥后的膜浸入封闭缓冲液中，室温下摇床振荡1 h，转速为50 r/min。 A.3.3 与一抗反应 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的病毒特异性抗体溶液中，室温下摇床振荡10 h12 h，转速为50 r/min。 A.3.4 洗膜 用洗涤缓冲液洗膜4次，每次摇床振荡3 min，转速为80 r/min。 A.3.5 与二抗反应 用滤纸将膜表面的溶液吸干， 将膜放入用抗体缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酶标记的抗体溶液中，室温下摇床振荡1 h，转速为50 r/min。 A.3.6 洗膜 洗涤4次，方法同A.3.4。 A.3.7 显色 用滤纸将膜表面的溶液吸干，将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，避光缓慢摇动。 A.3.8 终止反应 弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡10 min，转速为50 r/min。 A.3.9 结果判断 晾干后观察颜色反应，阳性样品在膜上形成紫色沉淀，阴性样品则无颜色反应。 DB41/T 9872014 6 B B 附 录 B （规范性附录） 指示植物检测法 B.1 繁育指示植物 在防虫条件下盆栽巴西牵牛（Ipomoea setosa），至12片真叶时嫁接。 B.2 嫁接 以待测样品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部（子叶处）斜切，将待检样品底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置25 30 防虫网室内，嫁接15 d30 d后观察记载症状。每个样品重复至少3次（3株），同时设阳性和阴性对照。 B.3 结果判断 根据巴西牵牛是否表现花叶、叶片扭曲、明脉、黄化以及植株矮化等症状，确定是否带毒。所有嫁接的巴西牵牛植株均没有表现任何病毒病症状，样品为阴性；只要有1株表现病毒病症状，该样品判断为阳性。 DB41/T 9872014 7 C C 附 录 C （规范性附录） 聚合酶链式反应（PCR）检测法 该方法用于检测甘薯卷叶病毒（SPLCV）。 C.1 试剂及缓冲液配制 先用按C.1.1C.1.6 配方配置 50 倍的浓贮存液，使用时再用无菌蒸馏水稀释至工作浓度。 C.1.1 TAE电泳缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242.0 g、冰乙酸57.1 mL、Na2EDTA2H2O 37.2 g，用氢氧化钠调pH值至8.5，灭菌双蒸水定容至1 L。 C.1.2 溴化乙锭（EB）溶液：称取溴化乙锭20.00 mg溶于20 mL灭菌双蒸水中。 C.1.3 1.0%琼脂糖凝胶板：称取1.00 g琼脂糖加入100 mL TAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热至琼脂糖融化，温度降至50 60 时，加溴化乙锭溶液（EB）5 L，摇匀，倒入电泳槽中均匀铺板，凝固后取下梳子使用。 C.1.4 CTAB缓冲液：称取CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）20.00 g、NaCl 81.80 g、EDTA 5.80 g和 Tris 12.10 g，溶于1 L蒸馏水中，用HCl调pH值至8.0，高温灭菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30） 10.00 g。 C.1.5 TE缓冲液：称取EDTA 0.30 g和Tris 1.20 g，溶于1 L蒸馏水中，用HCl调pH值至8.0，高温灭菌。 C.1.6 加样缓冲液： 称取EDTA 0.88 g、溴酚蓝 0.05 g，量取丙三醇36 mL，溶于100 mL蒸馏水中，用氢氧化钠调pH值至7.0。 C.2 DNA提取-CTAB法 预热（60 ）CTAB缓冲液(C.1.4)。取0.5 g新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有预热的600 L CTAB 缓冲液(C.1.4)的1.5 ml的eppendorf管中，再加入20 L巯基乙醇，轻轻混匀； 60 保温1 h， 其间摇动几次； 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊 醇（25:24:1） ， 轻轻 混 匀， 室温 下 4500 r/min离心10 min；将上清液转入另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，小心混匀后-20 放置30 min以上，可见DNA絮状沉淀；10000 r/min离心10 min，弃去上清液；沉淀加清洗缓冲液（70%乙醇，100 mmol/L醋酸铵）漂洗23次，10000 r/min离心10 min，沉淀风干后溶于50 L TE 缓冲液(C.1.5)。开展后续试验或-20 保存备用。 C.3 PCR C.3.1 引物 上游引物BM-V：5-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC-3， 下游引物BM-C：5-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3。 C.3.2 PCR扩增 PCR反应体系为：灭菌重蒸水36.7 L，dNTPs（2.5 mmol/L）4 L，10Ex Taq Buffer(含MgCl2) DB41/T 9872014 8 5 L，上游引物BM-V（10 mol/L）和下游引物BM-C（10 mol/L）各1 L，Ex Taq DNA聚合酶 (5 U/L) 0.3 L，模板DNA 2 L。PCR反应条件为：94 3 min，接着进行35个循环，条件为94 1 min、 55 1 min和72 3 min，最后72 延伸10 min。 C.3.3 PCR产物的电泳检测 制备1.0%琼脂糖凝胶板（C.1.3）。在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液(C.1.1)。每个样品取10 L PCR产物与加样缓冲液混合后，加入凝胶孔进行电泳。恒压（120 V150 V）下电泳20 min30 min，经EB染色后，将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 C.3.4 试验成立的条件 PCR产物经电泳检测，阳性对照在预期大小（2800 bp）的位置出现特异性条带，同时，阴性对照和空白对照均没有出现预期大小的目的条带。 C.3.5 结果判定 应用本标准的检测方法对待检样品进行检测，如果在2800 bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为SPLCV病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。 DB41/T 9872014 9 D D 附 录 D （规范性附录） 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法 该方法用于检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）。 D.1 试剂及缓冲液配制 D.1.1 DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC) 50 L加至100 mL灭菌蒸溜水中，室温放置10 h12 h， 121 高温灭菌15 min，分装到DEPC（D.1.1）处理过的离心管中。 D.1.2 引物溶液：用DEPC水（D.1.1）将上、下游引物分别配制成浓度为10 mol/L的溶液。 D.1.3 TAE电泳缓冲液、1.0%琼脂糖凝胶板和溴化乙锭（EB）溶液：TAE电泳缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液和1.0%琼脂糖凝胶板配制方法分别同附录C.1.1、C.1.2和C.1.3。 D.2 RNA提取-Trizol法 称取0.1 g叶片放于研钵中，加液氮充分研磨成粉，将粉末迅速转入到无RNase的无菌1.5 mL 离心管中，加入1 mL Trizol迅速振荡混匀；4 12000 r/min，离心5 min；取上清液，加入200 L氯仿，混匀，室温放置15 min；4 ，12000 r/min，离心15 min；吸取上层水相至新的无菌1.5 mL 离心管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置10 min；4 ，12000 r/min，离心10 min，弃上清液，留沉淀；加入1 mL 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4 ，12000 r/min，离心5 min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌滤纸上，自然干燥；加入25-200 L DEPC水（D.1.1）溶解沉淀，即得到总RNA。 D.3 RT-PCR D.3.1 引物 上游引物CSV70P1：5-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3， 下游引物CSV70P2：5-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3。 D.3.2 反转录 反转录反应体系为：dNTPs（10 mmol/L）1 L，MgCl2（25 mmol/L）1 L，5AMV缓冲液 2 L，AMV（5 U/L）0.5 L，RNase抑制剂（40 U/L） 0.25 L，模板核酸5 L，下游引物CSV70P2（10 mol/L） 0.5 L。反转录反应条件为：42 50 min，99 5 min。 D.3.3 PCR扩增 PCR反应体系为：灭菌重蒸水33.7 L，dNTPs（2.5 mmol/L）4L，10Ex Taq Buffer (含MgCl2) 5 L，上游引物CSV70P1（10 mol/L）和下游引物CSV70P2（10 mol/L）各1 L，Ex Taq DNA聚合酶 (5 U/L) 0.3 L，cDNA 5 L。PCR反应条件为：94 3 min，接着进行35个循环，条件为94 30 s、55 30 s和72 50 s，最后72 延伸10 min。 D.3.4 PCR产物的电泳检测 DB41/T 9872014 10 制备1.0% 琼脂糖凝胶板（C.1.2）。在电泳槽中加入1TAE缓冲液。每个样品取10 L PCR产物与加样缓冲液混合后，加入凝胶孔进行电泳。恒压（120 V150 V）下电泳20 min30 min，经EB染色后，将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 D.3.5 试验成立的条件 PCR产物经电泳检测，阳性对照在预期大小（431 bp）的位置出现特异性条带，同时，阴性对照和空白对照均没有出现预期大小的目的条带。 D.3.6 结果判定 应用本标准的检测方法对待检样品进行检测，如果在431 bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为SPCSV病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。 _