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172中国处方药 第 21 卷 第 9 期临床研究肝癌是临床上常见的一种发生在肝脏的恶性肿瘤，是指干细胞或者肝内胆管上皮细胞发生癌变，或者身体其他器官起源的恶性肿瘤扩散或转移至肝脏1。肝癌患者存在明显的胃肠道功能异常或障碍，导致营养物质的吸收不佳，降低了身体素质和抵抗力2。肠道中存在大量的菌群，当机体患肝癌后，肠道各菌群失衡，导致胃肠道响应应激反应，释放大量炎症因子，损伤胃肠功能，出现消化不良、腹胀、呕吐等症状3。嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia mucinphila，Akk）是肠道中常见的一种黏蛋白分解细菌，与肥胖、糖尿病、心血管疾病、低度炎症呈现明显的负相关性4。有研究指出，Akk 丰度变化情况与机体病情存在一定的联系。基于此，本文旨在探究肝癌患者肠道 Akk 各亚型丰度的变化及其临床价值，现报告如下。1 资料与方法1.1 一般资料选取巴彦淖尔市医院肿瘤内科 2021 年 1 月 2022 年8 月期间收治的 90 例肝癌患者作为此次研究的观察组，选取同期在我院体检的健康者 90 例作为此次研究的对照组。对照组男40例，女50例；年龄2373岁，平均（65.737.59）岁；体重指数 19 23 kg/m2，平均（20.111.04）kg/m2。观察组男 42 例，女 48 例；年龄 23 73 岁，平均（65.757.82）岁；体重指数 19 23 kg/m2，平均（20.141.07）kg/m2；病程1 5 年，平均（3.241.08）年。两组性别、年龄、体重指数经比较，差异无统计学意义（P 0.05），具有可比性。研究对象签署知情同意书，且研究通过伦理委员会审核批准。观察组患者纳入标准：经肝癌标志物检测均确诊为肝癌患者，且符合 中国肝癌一级预防专家共识（2018）5中诊断标准者；研究开始前 3 个月未进行任何治疗者；个人资料齐全者等。排除标准：精神类疾病、认知障碍等无法交流沟通者；凝血功能异常或者障碍者；近期服用过益生菌、抗生素等药物治疗者；血液或者粪便标本遗失者等。1.2 实验仪器、试剂以及引物序列实验仪器、试剂分别见表 1、2。引物由南京金斯瑞公司合成，见表 3。表 1 实验仪器仪器厂家及型号常温离心机Eppendorf Centrifuge 5424三温三控恒温水浴锅上海博迅实业有限公司 DK-8D超低温冷冻存储箱中科美菱低温科技有限责任公司 DW-HL388旋涡震荡仪华利达 WH-861 Vortex ShakerPCR 仪杭州朗基科学仪器有限公司 A200 基因扩增仪表 2 试剂试剂厂家及型号Pusion Hot start flex 2X Master Mix上海仪涛生物仪器有限公司 M0536LDL2000 DNA MakerTakara 3427AGene colour北京金博益 GBY-1Qubit dsDNA HS Assay Kit（500 次）Invitrogen，Life technologies Q32854Biowest Agarose G-10BIOWEST 111860生工 50TAE Buffer 上海生工 B548101-500AMPure XT beadsBeckman A638801.3 血清 UA、TC、TG 以及 Glu 水平检测采集所有参与者清晨空腹静脉血 5 ml，使用常温离心机离心分离血清，使用全自动生化分析仪分别检测血清肝癌患者肠道嗜黏蛋白阿克曼菌各亚型丰度的变化及其临床价值郭秀春1，陈利霞2，刘秀军3，邬婷1（1 巴彦淖尔市医院肿瘤内科，内蒙古巴彦淖尔 015000；2 内蒙古科技大学第一附属医院肿瘤内科，内蒙古包头 014000；3 巴彦淖尔市医院甲状腺乳腺外科，内蒙古巴彦淖尔 015000）【摘要】目的 探究肝癌患者肠道嗜黏蛋白阿克曼菌（Akk）各亚型丰度的变化及其临床价值。方法 选取巴彦淖尔市医院肿瘤内科2021 年 1 月 2022 年 8 月期间收治的 90 例肝癌患者作为此次研究的观察组，选取同期在我院体检的健康者 90 例作为此次研究的对照组，采集两组的血液、粪便标本，预处理后，使用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术对粪便中肠道嗜黏蛋白阿克曼菌各亚型丰度的变化进行检测，同时检测血清尿酸（UA）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及空腹血糖（Glu）水平。结果 观察组与对照组中 Akk 丰度均表现为最高，而 Akk 丰度最低；年龄 60 岁的肝癌患者的肠道中 Akk 的丰度呈现明显的下降趋势（P 0.05）；相比于对照组，观察组血清 UA 水平明显的降低（P 0.05）；在观察组中，肝癌患者肠道 Akk 的丰度与血清 UA 水平呈现明显的正相关性（P 0.05），而肝癌患者的病程与肠道 Akk 的丰度、血清 UA 水平呈现明显的负相关性（P 0.05）。结论 肝癌患者肠道中 Akk 的丰度与血清 UA 水平呈现明显的正相关性，而肝癌患者病程与肠道 Akk 的丰度、血清 UA 水平呈现明显的负相关性，说明肠道中Akk 的丰度、血清 UA 水平与肝癌患者联系密切。因此，临床上可通过联合肠道低 Akk 的丰度、低 UA 水平对肝癌患者进行早期诊断，肠道低 Akk 的丰度、低 UA 水平联合检测可作为诊断肝癌的标志物。【关键词】肝癌；肠道嗜黏蛋白阿克曼菌；各亚型丰度；变化；临床价值通信作者：陈利霞，Email：173Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9临床研究UA、TC、TG 以及 Glu 水平。1.4 提取粪便 DNA将提取的 100 mg 粪便样本放置在常温离心机的离心管中，向其中加入 1.2 ml 的 Buffer SSL，在最高漩涡状态下搅拌 1 min，使样本被充分打散。随后在三温三控恒温水浴锅进行 10 min 的水浴（温度为 70），15 s 涡旋。室温状态下，14 000 g 离心 10 min，分离上清液。提取 250 l上清液置于离心管中，向其中加入 Proteinase K 20 l 以及 Buffer AL 250 l，上下颠倒摇晃充分混匀，随后进行10 min 的水浴（温度为 70），然后向样品中加入 250 l无水乙醇，上下颠倒摇晃充分混匀。将 Hipure DNA Mini Column 放置在收集管中，并将混合液放置在柱子中。离心，将流出液弃去，向其中加入 Buffer GW1 和 GW2 500 l，操作 3 次。离心直至柱子被甩干，将事先预热至 70的Buffer AE 60 l 加入到柱子的膜中央的位置，室温条件下静置 2 min。13 000 g 离心 1 min，将 DNA 结合柱弃去，并将提取出来的 DNA 放置在-20的超低温冷冻存储箱中保存、备用。1.5 提取单菌 DNA将 0.5 ml 的细菌培养液放置在常温离心机的离心管中，10 000 g 离心 1 min，分离细菌，将培养液弃去。向细菌沉淀团中加入 Buffer STE 200 l 以及 Lysozyme 10 l，涡旋充分重悬细菌，随后在三温三控恒温水浴锅进行 10 min 的水浴（温度为 37）。向细菌重悬液中加入 Buffer DL 220 l 以及 Proteinnase K 10 l。涡旋搅拌充分混匀，水浴（温度为 60）消化 30 min。向细菌裂解液中加入 RNase Solution 5 l，使用旋涡震荡仪涡旋搅拌充分混匀，在室温条件下静置 20 min。向裂解液中加入无水乙醇 220 l，在最高漩涡状态下搅拌 30 s。将 Hipure gDNA Micro Column 放置在收集管中。然后将混合液放置在柱子中。离心，将流出液弃去，随后将柱子放回收集管。在柱子中加入 Buffer GW1 500 l。10 000 g 离心 1 min，将滤液弃去，随后将柱子放回收集管。在柱子中加入 Buffer GW2 650 l。10 000 g 离心 1 min，将滤液弃去，随后将柱子放回收集管。再次在柱子中加入 Buffer GW 2 650 l。10 000 g 离心 1 min，将滤液弃去，随后将柱子放回收集管。10 000 g 离心 2 min，将柱子放置在离心管中。将事先预热至 65的 Buffer TE 40 l 加入到柱子的膜中央的位置，室温条件下静置 3 min。10 000 g 离心 1 min，将 DNA 结合柱弃去，并将提取出来的 DNA 放置在-20的超低温冷冻存储箱中保存、备用。1.6 RT-qPCR使 用 RT-qPCR 技 术 对 肝 癌 患 者 粪 便 中 Akk、Akk、Akk 的相对丰度进行检测。首先，使用分光光度计对 DNA 的纯度、浓度进行测定，然后使用 RT-qPCR仪器对肝癌患者粪便中 Akk、Akk、Akk 的相对丰度进行检测。反应体系：Mix 10 l，正、反向引物均为0.80 l，2 l 粪便 DNA，6.40 l DEPC 水，合计 20 l。PCR 扩增：Denature 30 s 95，1 个循环；PCR 5 s 95，30 s 60，40 个循环；Melting 5 s 95，1 min 60，1 个循环；Cooling 30 s 40，1 个循环。每份样品重复操作 3 次。采用 2-Ct法对肝癌患者肠道 Akk各亚型相对丰度进行计算。1.7 统计学方法数据录入 SPSS 22.0 软件中分析，计数资料用 例（%）表示，采用2检验，计量资料用（s）表示，采用t检验，采用单因素方差分析多组间均数比较，采用Pearson 相关性分析进行连续变量相关性分析。P 0.05表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 肝癌患者肠道中 Akk 各亚型丰度变化观察组与对照组中均表现出 Akk 丰度最高，而Akk 丰度最低，见图 1A；观察组患者肠道 Akk 丰度低于 Akk （t 4.354，P 0.05），而对照组肠道 Akk 丰度与 Akk 比较，差异无统计学意义（t 0.435，P 0.05）。观察组肠道 Akk、Akk 丰度均明显减少，Akk 丰度明显增加，见图 1B、C、D。年龄 60 岁的肝癌患者的肠道中 Akk 的丰度呈现明显的下降趋势（t3.864，P 0.05），见图 1F，Akk、Akk 丰度均未发生明显变化（t 0.342、0.425，P 均 0.05），见图 1E、G。2.2 两组血清 UA、TC、TG、Glu 水平对比与对照组相比，观察组血清 UA、TC 水平偏低（t6.574、4.537，P均 0.05），见图 2A、B；观察组 TG、Glu 水平与对照组相比，差异无统计学意义（t 1.013、0.894，P均 0.05），见图 2C、D。去除血清 UA、TC 异常值后发现，与对照组相比，观察组血清 UA 水平偏低（t 3.689，P 0.05），见图 2E；而观察组 TC 水平与对照组相比，差异无统计学意义（t 0.893，P 0.05），见图 2F。2.3 肠道 Akk 各亚型丰度与血清 UA 水平之间的关系在观察组中，Akk 高丰度组的血清 UA 水平增加（t表 3 PCR 引物序列扩增片段引物序列16s rRNA V3-V4 区341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3）805R（5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3）古细菌F（5-GYGCASCAGKCGMGAAW-3）R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）16s rRNA V4 区515F（5-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3）806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）16s rRNA V4-V5 区F（5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3）R（5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3）174中国处方药 第 21 卷 第 9 期临床研究 9.576，P 0.05），见图 3A；在对照组中，Akk 高丰度组血清 UA 水平与 Akk 低丰度组相比，差异无统计学意义（t 0.475，P 0.05），见图 3A。Akk、Akk 丰度的高低不会直接影响血清 UA 水平（对照组：tAkk 高 vs.Akk 低 0.582，tAkk 高 vs.Akk 低 0.853，P均 0.05；观察组：tAkk 高 vs.Akk 低 0.615，tAkk 高 vs.Akk 低 0.463，P均 0.05），见图 3B、C。注：A：Akk 丰度高低对 UA 水平影响；B：Akk 丰度高低对 UA 水平影响；C：Akk 丰度高低对 UA 水平影响；L；低；H；高。aP 0.05。图 3 肠道 Akk 各亚型丰度与血清 UA 水平之间的关系2.4 肠道 Akk 丰度、血清 UA 水平对肝癌患者病程的影响在观察组中，肝癌患者肠道 Akk 的丰度与血清 UA水平呈现明显的正相关性（r 7.236，P 0.05），见图4A，而肝癌患者病程与肠道 Akk 的丰度、血清 UA 水平呈现明显的负相关性（r-4.132、-3.572，P均 0.05），见图 4B、C。3 讨论肝癌早期通常没有症状或者症状不典型，但随着肿瘤的恶化和扩散，出现肝区疼痛、发热、黄疸、腹水以及食欲减退、恶心呕吐、腹泻等缺乏特异性的消化道症状，对身体健康和生命安全造成严重的威胁。肝癌具有较高的发病率和死亡率，好发于中年男性，近年来其发病率、死亡率均呈现逐渐上升的趋势，对人们的生命安全造成严重的威胁6-7。肝癌的病因以及发病机制尚未完全明确，但根据相关调查研究发现，主要与饮酒、病毒性肝炎、食物以及饮水、毒物以及寄生虫、遗传因素等联系密切，此外，2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病、重度吸烟、饮酒等均易增加患肝癌的风险，对肝功能、胃肠功能等造成严重的影响，为患者的日常生活和工作带来诸多的不便8-9。肝癌患者发病较为隐匿，病情进展较快，临床确诊后若不加以有效的干预治疗，随着病情的恶化肿瘤细胞会持续侵袭胃肠道以及各脏器，导致胃肠道功能损伤，肠道菌群结构失衡，胃肠黏膜完整性遭到破坏，降低机体的抵抗力和免疫力。因此，临床上为肝癌患者实施针对性治疗时，也应及时关注胃肠道功能改善以及肠黏膜的损伤情况，以提高治疗效果，降低机体受到的损伤。Akk 是一种肠道有益菌，会随着肠道炎症的恶化而逐渐减少，导致注：A：各亚型 Akk 在观察组和对照组的相对丰度；B：观察组和对照组 Akk 丰度对比；C：观察组和对照组 Akk 丰度对比；D：观察组和对照组 Akk 丰度对比；E：60 岁观察组和对照组 Akk 丰度对比；F：60 岁观察组和对照组 Akk 丰度对比；G：60 岁观察组和对照组 Akk 丰度对比。aP 0.05，bP 0.01。图 1 肝癌患者肠道中 Akk 各亚型丰度变化注：A：Akk 丰度与 UA 水平相关性；B：UA 水平与肝癌患者病程相关性影响；C：Akk 丰度与肝癌患者病程相关性。图 4 肠道 Akk 丰度、血清 UA 水平对肝癌患者病程的影响注：A：观察组和对照组 UA 水平对比；B：观察组和对照组 TC 水平对比；C：观察组和对照组 TG 水平对比；D：观察组和对照组 Glu 水平对比；E：去除异常值后，观察组和对照组 UA 水平对比；F：去除异常值后，观察组和对照组 TC 水平丰度对比。aP 0.05。图 2 两组血清 UA、TC、TG、Glu 水平对比175Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9临床研究胃肠道功能异常10。Akk 能够有效修复已经损伤的肠黏膜屏障，并维持肠黏膜屏障的稳定性，减轻肠道炎症反应，进而改善胃肠道功能11-12。有研究发现，Akk 在多种因代谢紊乱引发的疾病的治疗中具有非常重要的作用，Akk 的丰度在肥胖、糖尿病等疾病中明显降低13-15。临床上通过提高“渐冻症”小鼠模型的 Akk 菌浓度，可有效改善临床症状，延长生存期。由此可以，Akk 在机体肠道中具有非常重要的作用和意义。因此，本文旨在探究 Akk三种亚型丰度的变化与肝癌患者血清 UA、TC、TG、Glu水平以及病程之间的关系，为临床肝癌诊断治疗提供客观的参考依据。本研究结果发现，观察组与对照组中均表现出 Akk 丰度最高，而 Akk 丰度最低；年龄 60 岁的肝癌患者的肠道中 Akk 的丰度呈现明显的下降趋势（P 0.05）；相比于对照组，观察组血清 UA 水平明显的降低（P 0.05）；在观察组中，肝癌患者肠道 Akk 的丰度与血清 UA 水平呈现明显的正相关性（P 0.05），而肝癌患者的病程与肠道 Akk 的丰度、血清 UA 水平呈现明显的负相关性（P 0.05），分析其原因可能与血清 UA 水平与机体内氧化应激反应密切相关，也是体内天然的抗氧化剂，具有较好的清除自由基和抗氧化作用。肝癌患者体内炎性反应以及氧化应激反应相对较为强烈，致使体内血清UA 水平下降，而其肠道中 Akk 丰度明显下降。随着肝癌病程的持续进展，机体免疫功能下降，炎性因子大量积聚，致使肠道内 Akk 显著下降，血清 UA 水平也呈下降的趋势。肝癌的具体发病机制目前尚未完全明确，但是诸多学者将肝癌发病机制的研究重心放在肝脏代谢功能以及应激反应。血清 UA 水平与机体中应激反应的应答具有一定的联系，血清 UA 能够有效清除体内自由基，发挥抗氧化功效，抑制炎性反应。肝癌患者肠道中 Akk 的丰度发生进行性逐渐减少时，会促使血清 UA 水平明显下降，致使机体中应激反应发生响应，对胃肠功能、肝功能造成严重的损伤。综上，肝癌患者肠道中 Akk 的丰度与血清 UA 水平呈现明显的正相关性，而肝癌患者病程与肠道 Akk 的丰度、血清 UA 水平呈现明显的负相关性，说明肠道中Akk 的丰度、血清 UA 水平与肝癌患者联系密切。因此，临床上可通过联合肠道低 Akk 的丰度、低 UA 水平对肝癌患者进行早期诊断，肠道低 Akk 的丰度、低 UA 水平联合检测可作为诊断肝癌的标志物。参考文献1 皮丽娜，候艳莹，张维.肠道菌群失调，炎症因子变化，维生素缺乏与肝癌患者根治术后复发的关系 J.现代肿瘤医学，2019，27（17）：3078-3081.2 Xiao J，Liu Y，Wu F，et al.miR-639 Expression Is Silenced by DNMT3A-Mediated Hypermethylation and Functions as a Tumor Suppressor in Liver Cancer CellsJ.Mol Ther，2020，28（2）：587-598.3 于雷，孙超，张曼旭.灵芝多糖对 HepG2 细胞诱导的肝癌小鼠肠道菌群及其菌群代谢功能的调节作用 J.实用肝脏病杂志，2021，24（4）：476-479.4 卢雨，王昊，巴乾.肠道菌群在肝癌发生发展及治疗中的作用研究进展 J.上海交通大学学报：医学版，2022，42（7）：939-944.5 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