干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响.pdf

第36卷第6期,2023年11月 宁 波 大 学 学 报（理 工 版）中国科技核心期刊 Vol.36 No.6,Nov.2023 JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY(NSEE)中国高校优秀科技期刊 DOI:10.20098/ki.1001-5132.2022.1103 干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响 戚杉杉1,2,3,史 策1,2,3*,王春琳1,2,3,叶央芳1,2,3,母昌考1,2,3,李荣华1,2,3,任志明1,2,3,吴清洋1,2,3（1.宁波大学 教育部水产生物技术重点实验室,浙江 宁波 315832;2.浙江省海洋高效健康养殖协同创新中心,浙江 宁波 315832;3.农业农村部绿色海水养殖重点实验室（部省共建）,浙江 宁波 315832）摘要:研究了 17、25 和 33 3 个干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响.结果发现,17组拟穴青蟹幼蟹存活率最高为 58.93%,且存活时间最长为 144h;33组存活率最低为 17.86%,且存活时间最短为 120h.17、25 和 33组的血蓝蛋白分别在 48、96、48h 达到峰值,25和 33组的皮质醇含量在 96h 时显著高于其他时间点(P0.01),而活性氧 ROS 含量随干露时间增加而上升.在基因表达方面,干露时间增加导致 bax 基因和 bcl-2 基因上调,其中17和33组在干露24h时的bax/bcl-2比值大于1,且显著高于其他时间点(P0.05),caspase-3基因表达量在17和33组干露24h时也显著高于其他时间点(P0.01).双因素方差分析表明,温度、干露及其两者的交互作用均显著影响了拟穴青蟹幼蟹的存活率(P5mgL1,氨氮和亚硝酸盐0.5 mgL1,暂养期间不投喂饲料.待暂养结束后,挑选体重相近、附肢完整的拟穴青蟹幼蟹 168 只;同时,将帆布池中水温调节到实验设计温度,将拟穴青蟹幼蟹随机分配到 3 个大帆布池中的 24 个干露容器内,每个容器放 7 只,每隔 12h 观察实验蟹存活状态,并统计记录各处理组实验蟹的存活数据.当实验蟹附肢运动能力下降、口器开口并伴有发泡现象等状况时,则判定为死亡个体.1.3 样本采集样本采集 各温度组在实验开始的 0、24、48、96h 进行取样,每个时间点在干露容器中各取1 只拟穴青蟹幼蟹,总共数量为 8 只,若数量不足 8 只,则至少取3只以上拟穴青蟹幼蟹.使用1.5mL一次性注射器在拟穴青蟹幼蟹的游泳足基部抽取血淋巴,并将迅速解剖采集的实验蟹肝胰腺置于 1.5mL 离心管中,液氮速冻后,转入-80 下保存,以备后续分析.血淋巴经抗凝处理后在 4冰箱中静置过夜,将静置后的血淋巴于4条件下,3000rmin1离心10min,取上层血清并进行分装,分装后于-80 超低温冰箱保存.1.4 存活率存活率 采用Kaplan-Meier生存曲线分析法,计算不同干露温度组各时间点拟穴青蟹幼蟹存活情况.1.5 血蓝蛋白血蓝蛋白、皮质醇和活性氧的测定皮质醇和活性氧的测定 血清血蓝蛋白、皮质醇和ROS检测采用ELISA试剂盒(上海桥杜生物科技有限公司)测定.往预先包被所测指标抗体的包被微孔中依次加入标本、标准品、HRP(过氧化物酶)标记的检测抗体,然后将微孔板在 37下孵育 60min,并用洗涤液彻底洗涤,在过氧化物酶和酸的作用下,用于显色的底物TMB(四甲基联苯胺)由蓝色变为黄色,反应最终溶液的黄色深度与所需测得的含量成正比,单位均为 ngmL1.1.6 基因表达分析基因表达分析 实验蟹肝胰腺样本在液氮环境下于研钵中充分研磨,然后取少量组织粉末(50100mg)放入加有 1mL Trizol 试剂(15596026,Invitrogen,USA)的无 RNase 的 EP 管中提取总 RNA.用 RNase-Free DNase(TaKaRa,中国)去除基因组DNA污染后,用30 cm 80 cm 100 cm 150 cm 第 6 期 戚杉杉,等:干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响 59 凝胶电泳法检测 RNA 的完整性和纯度.按照HiFiScript cDNA 试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,上海)说明书的操作步骤,将 RNA 反转录为cDNA.采用 SYBR 绿色荧光染料在荧光定量 PCR仪(LightCycler96,Roche 公司,瑞士)上进行实时PCR检测.本研究以-actin作为内参基因,分别测定了 bax、bcl-2、caspase-3 的表达情况.根据 2-Ct方法对所有定量数据进行分析.所用引物序列见表 118.1.7 数据分析数据分析 数据均以平均值标准误差表示,实验结果用SPSS 20.0 进行单因素方差分析(One-way ANOVA),采用 Tukey 多重比较事后检验分析,以 P0.05 作为差异显著水平.此外,温度与干露时间交互作用采用双因素方差(Two-way ANOVA)分析.2 结果与分析结果与分析 2.1 不不同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹存活率的影同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹存活率的影响响 不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹生存曲线如图 2 所示.由图可见,随着干露过程中温度的升高,拟穴青蟹幼蟹死亡率增加,并随干露时间的延长,死亡率也增加.在 24、48、96h 时,17存活率分别为 96.43%、89.29%、58.93%;25存活率分别为 91.07%、78.57%、32.14%;33存活率分别为 85.71%、50%、17.86%.17组存活时间最长为 144h,33组存活时间最短为 120h.2.2 不同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹血不同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹血淋巴指标淋巴指标的影响的影响 不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹血淋巴血蓝蛋白质量浓度变化如图3(a)所示,可见17在干露 48h 时显著高于其他时间点(P0.05),33组在干露48h时显著高于其他时间点(P0.01),而25组在干露 96h 时血蓝蛋白质量浓度达到顶峰(P 0.01).不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹血淋巴皮质醇质量浓度变化如图 3(b)所示,可见皮质醇质量浓度在 25和 33组均出现上升趋势,且在干露96h时显著高于其他时间点(P0.05).不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹血淋巴 ROS 质量浓度变化如图 3(c)所示,可见ROS浓度在33组96h时显著高于其他时间点(P0.05).2.3 不同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹的细胞凋亡不同温度下干露对拟穴青蟹幼蟹的细胞凋亡相关基因表达相关基因表达 不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹 bax 表达量如图4(a)所示,可见在17组bax表达量在干露24h 时达到最高(P0.05),33组 bax 表达量在干露96h时显著高于其他时间点(P0.05).不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹 bcl-2 表达量如图 4(b)所示,可见各温度组 bcl-2 表达量均在干露 48h 时达到顶峰(P0.01).不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹 bax/bcl-2 比率如图 4(c),17和 33组 bax/bcl-2 比值 图 4 不同温度干露对拟穴青蟹幼蟹各时间点 bax(a)、bcl-2(b)、bax/bcl-2(c)、caspase-3(d)基因表达量的影响 不同小写字母表示差异显著(P0.05),下图同.图 3 不同温度干露对拟穴青蟹幼蟹各时间点血淋巴血蓝蛋白(a)、皮质醇(b)和活性氧 ROS(c)质量浓度的影响 第 6 期 戚杉杉,等:干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响 61 在干露 24h 时均大于 1 且显著高于其他时间点(P 0.05).不同温度干露情况下拟穴青蟹幼蟹 caspase-3 表达量如图 4(d)所示,由图可见 17和 33组caspase-3 表达量在干露 24h 时也显著高于其他时间点(P0.05),干露时间对各指标都有显著性影响(P0.05),干露温度和干露时间对拟穴青蟹幼蟹存活率、血蓝蛋白、皮质醇和 bax 基因有交互作用.表 2 双因素方差分析结果 因素 指标 干露温度 干露时间 干露温度干露时间 存活率/%P0.01 P0.01 P0.01 血蓝蛋白/(ngmL1)P0.01 P0.01 P0.01 皮质醇/(ngmL1)P0.01 P0.01 P0.01 ROS/(ngmL1)P0.01 P0.01 NS bax NS P0.05 P0.01 bcl-2 P0.05 P0.01 NS bax/bcl-2 P0.05 P0.01 NS caspase-3 NS P0.01 NS 注:NS 代表无显著性差异.3 讨论讨论 本研究中,干露温度和干露时间对拟穴青蟹幼蟹存活率均存在影响,随着干露温度上升,拟穴青蟹幼蟹存活率下降;在 17 时,拟穴青蟹幼蟹在 96h 时存活率仍有 58.93%,而在 33时,拟穴青蟹幼蟹在 96h 时存活率仅为 17.86%.类似研究也同样表明温度升高也会导致三疣梭子蟹和菲律宾蛤仔在干露过程中存活率下降,在 5下,三疣梭子蟹在 48h 时的存活率有 93.3%,而在 10条件下存活率为 0%5;温度为 15时,菲律宾蛤仔在 72h 仍有 85.3%的存活率,但当温度为 25时,菲律宾蛤仔在72h时已经全部死亡19.与以上研究结果相似,随着干露时间增加和温度上升,拟穴青蟹幼蟹存活表现下降:幼蟹在 17 条件下存活时间能达到144h,但33条件下则仅为120h.本研究中,不同温度处理组是通过水浴方式达到,各处理均保持了一定湿度,因此即使在干露状态下的拟穴青蟹存活时间仍然较长.同时,由于温度与干露存在交互作用,因此高温和干露的共同胁迫会显著降低拟穴青蟹存活率.由于血蓝蛋白具有输氧功能,而干露胁迫会导致欧洲螯龙虾(Homarus Gammarus)和锯缘青蟹(Scylla serrata)20-21出现呼吸性酸中毒,进而降低氧气与血蓝蛋白的结合能力10.本研究中各处理组的拟穴青蟹幼蟹血淋巴血蓝蛋白浓度在干露过程中总体呈上升趋势,且 33 组血蓝蛋白含量显著高于其他温度组,其原因可能是因为高温加剧了低氧胁迫,hif-1 基因表达上调,从而增加血蓝蛋白合成22.此外,血蓝蛋白作为一种多功能蛋白,还具有免疫防御功能,因此另一种可能是温度和干露胁迫激活了拟穴青蟹的免疫系统,导致血蓝蛋白水平上调.不适宜的温度和缺氧等情况会引发水生动物的应激反应23,而皮质醇是应激反应指标之一24.本研究中25和33组的皮质醇浓度在干露过程中显著增加,而且 ROS 含量也随之上升,表明干露导致应激反应,并对机体造成了氧化损伤25.由于 ROS 能够抑制 DNA 聚合酶活性并阻碍 DNA 修复,进而可能导致细胞凋亡12,而细胞凋亡是一种由基因调控的程序性细胞死亡,在清除受损和坏死细胞以及维持动态平衡方面起着至关重要的作用26.Bcl-2 和 BAX 蛋白是调节内源性细胞凋亡的Bcl-2 蛋白家族的成员,Bcl-2 蛋白可以预防细胞凋亡,而 BAX 蛋白可以促进细胞凋亡27.在蛋白水平上,BAX/Bcl-2的比值大于1,代表线粒体途径被激活,细胞发生凋亡28.本研究中拟穴青蟹的 bax/bcl-2 比值在 17和 33干露胁迫 24h 时均大于1,同时其 caspase-3 基因表达量也达到顶峰,表明此时细胞凋亡可能处于较高水平.4 结论结论 本文探究了不同干露温度对拟穴青蟹幼蟹存活、血蓝蛋白水平、氧化应激和细胞凋亡相关基因表达的影响.研究结果发现不同温度下的干露均导致拟穴青蟹氧化应激、皮质醇水平上升,以及细 62 宁波大学学报（理工版）2023 胞凋亡相关基因表达变化,且温度和干露具有交互作用.高温和干露胁迫可能通过氧化应激和细胞凋亡途径降低拟穴青蟹存活表现,17 是拟穴青蟹幼蟹最适宜的运输温度.参考文献:1 Madenjian C P,Rogers G L,Fast A W.Predicting night time dissolved oxygen loss in prawn ponds of Hawaii:Part II.A new methodJ.Aquacultural Engineering,1987,6(3):209-225.2 姜令绪,刘群,王仁杰,等.三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼体不同干露温度下死亡率的研究J.海洋与湖沼,2012,43(1):127-131.3 Gu W,Zhou Y,Tu D,et al.Identification and characterization of apoptosis regulator Bax involved in air-exposure stress of the mud crab,Scylla paramamosain Estampador,1949J.Crustaceana,2017,90(11/12):1373-1390.4 许友卿,曹占旺,丁兆坤,等.高温对鱼类的影响及其预防研究J.水产科学,2010,29(4):235-242.5 谢佳彦,朱爱意.几种重要水产品活体运输技术研究J.水产科学,2010,29(9):532-536.6 陈水春,储霞玲,班庭辉,等.3 种龙虾的休眠温度及低温休眠技术研究J.海洋渔业,2018,40(4):489-494.7 Duan Y F,Zhang J S,Dong H B,et al.Effect of desiccation and resubmersion on the oxidative stress response of the kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus J.Fish&Shellfish Immunology,2016,49:91-99.8 姜娜,王芳,路允良,等.干露对三疣梭子蟹抗氧化和应激能力的影响J.水产学报,2014,38(12):1996-2004.9 Defur P L.Systemic respiratory adaptations to air exposure in intertidal decapod 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investigated.The results showed that the 17 group had the highest survival rate,while the 33 group had the lowest survival rate.Hemocyanin in 17,25 and 33 groups peaked at 48,96,and 48h,respectively.Cortisol content in 25 and 33 groups was the highest at 96h(P0.01);whereas reactive oxygen species(ROS)content increased with extending air-exposure duration.In terms of gene expression,bax and bcl-2 genes were significantly up-regulated with increasing air-exposure duration.Two-way analysis of variance showed that temperature,air-exposure and their interaction significantly affected the survival rate of juvenile mud crab(P0.01).Based on the above research results,the effects of temperature and air-exposure on the survival of juvenile mud crab may be mediated by stress response and apoptosis pathway.In addition,the optimum temperature for the transportation of juvenile mud crab was 17.Key words:mud crab Scylla paramamosain;air-exposure;temperature;oxidative stress（责任编辑 章践立）