基因工程中常用的酶.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 基因工程中常用的酶,第一节 限制性核酸内切酶(,Restriction enzyme),一.限制与修饰:,1962年,Arber,W,(,瑞士,).,等,提出,限制与修饰假说。,1968,Arber,等,发现型限制性酶。,1968,Smith,和,Wilcox K.W,.,发现了类限制性酶,并阐明其性质。,1971,Nathans,等首次制作酶切图谱。,因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。,1962,Arber,1968,Smith,发现,限制性酶,W.,Arber,(1929),H.O.Smith,(1931),Biozentrum der,Universit,t Basel,Johns Hopkins University School,Switzerland,of Medicine,USA,二.限制性内切酶的类型,基因工程中最常用的是,型酶,三.型酶的命名,书写与剪切方式：,限制酶,来源 剪切方式,Eco,R I,Escherichia coli,RY 13,G,AATTC,Pst,I,Providencia stuartii,164,CTGCA,G,Bse,Bacilus stearothermophilus,strain,822,(,Hpa,),GTT,AAC,四.,同裂酶,(,isoschizomers,):,切割同一靶序列而来源不同的酶。,Mbo,I :,GATC,GATC,CTAG,CTAG,Bam,HI:G,GATCC,CCTAG,G,G,GATCC,CCTAG G,第二节 分子克隆中常用的酶,一.连接酶,(,DNA,ligase,),在,E.,coli,和动植物细胞中都有此酶。能催化,DNA,中相邻的3-,OH,和5-,P,之间形成磷酸二脂键。,连接酶的功能：,(1)能封闭,DNA,双链或,RNA/DNA,杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链,RNA,中的单链缺口,(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；,用途：,(1)通过粘端连接,DNA,分子；,(2)连接平端双链,DNA,分子或平端,DNA,与人工接头的连接。,二.甲基化酶(,methylase,),可使,DNA,甲基化。有两种：,dam,甲基化酶,和,dcm,甲基化酶,N,6,A,甲基化 5,G,m,ATC,3,C,5,C,甲基化,C,m,CAGG,或,C,m,CTGG,用途,：保护待克隆的片断。,例如构建真核,DNA,文库时用,E.,coli,甲基化酶修饰,DNA,片断中的,Eco,RI,酶切位点，然后将修饰的片断与人工,Eco,RI,接头连接，接头用,Eco,RI,切割后，将,DNA,片断插入噬菌体,DNA,中。,三.,DNA,聚合酶,I(,DNA,lolymerase,I,),DNA,pol,I,单链多肽，,MW109kD,可被枯草杆菌蛋白酶切成两段；,C-,端大片断(,Klenow,酶,)，,MW76kD,具53聚合酶和3 5外切酶活性，,N-,端小片断,MW36kD,具53外切酶活性。,(一)聚合酶活性：,Mg,2+,DNA,ndNTP,DNA(,pdN,),n,+,nPPi,5,CCG,OH,Mg,2+,5,CCG,ATACC,3GGCTATGG,3GGCTATGG,(,二),外切酶活性,(2),53外切酶活性,:切补作用,从游离的5端降解,DNA，,对,DNA,双链部分的磷酸二脂键有切除功能，每次切10,nt,5 CGCATCT Mg,2+,5 CATCT,3GCGCGTAGA 3GCGCGTAGA,(3),3 5,外切酶活性,:校对作用,从游离的5端降解,dsDNA,和,ssDNA,5CGCATCT Mg,2+,5CGC,3GCG,3GCG,(,三)在基因操作中的应用,(1,)缺口平移(,nick translation),制备探针；,(2)填补由限制酶产生的3凹缺末端；,(3),DNA,片断的末端标记(用,32,P,dNTP,填补末端)；,(4)用,Klenow,酶消解由限制酶产生的3凸出末端；,5,5,klenow,四.末端转移酶(,terminal,transferase,),取自小牛胸腺,催化脱氧核苷酸与,DNA,的,3-,OH,结合,模板/引物或底物是带有3-,OH,基的,ssDNA,或带有突出的双链,DNA。,不要求模板。,Mn,2+,或,Mg,2+,ssDNA,OH,+,ndNTP,DNA-(,pdN,),n,+,nppi,Co,2+,dsDNA,OH,+,ndNTP,DNA-(,pdN,),n,+,nppi,用途：,(1)在载体和,cDNA,上加互补的同聚物接头(,Homopolymeric,tail),AAAAA,AAAAA,TTTTT,TTTTT,(2),用,32,P,进行3端同位素标记,五.逆转录酶(,reverse,transcriptase,),以,RNA,为模板的,DNA,聚合酶，来源于鼠和禽类的反转录病毒。由两条肽链组成，其中一条具有53聚合酶和5 3 外切酶活性。,用途：,(1)合成双链,cDNA,作为插入载体的目的基因；,(2)以,ssDNA,或,RNA,为模板合成杂交探针。,六.核酸酶,S1(nuclease S1),从米曲霉(,Aspergillus,oryzae,),中提纯得到的一种金属蛋白，是单链特异性核酸酶。,ssDNA,or,ssRNA,pH4.5 Zn,2+,5,pdN,5,prN,中等量的酶会在缺口或,small gaps,切断,dsDNA,pH4.5 Zn,2+,用途：,(1)分析,RNADNA,杂合结构；,(2)除去,DNA,的单链末端，生成平端；,(3)切断双链,DNA,的发夹结构。,七.核酸酶,Bal,31,具两种活性：,(1)双链特异,外切酶,活性；从,dsDNA,的3和5切除寡核苷酸或单核苷酸；,EGTA(,乙二胺四乙酸),可终止反应,(2)单链特异,内切酶,活性：专门从单链,DNA,切除带有5末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核酸酶,S1,的单链特异性核酸内切酶活性),Ca,2+,Ca,2+,Ca,2+,用途：,1.切除,dsDNA,的末端核苷酸，使,DNA,的分子变小，在,T,4,连接酶的作用下连接接头和载体。,2.绘制,DNA,的限制图谱。,Bal,31,与限制性内切酶协同作用可绘制物 理图谱.还可逐步缩短,DNA,片断，使之适合构建嵌合质粒。,Bal,31de,内切酶活性已用于检测致癌剂与突变剂引起的,DNA,双链损伤,八.核酸外切酶,(,Exonuclease,),活性：,(1)3外切酶；,Mg,2+,(2)3,磷酸酶,内切酶和,RNase,H,活性,用途：,(1)制备,DNA,聚合酶的模板；,(2)制备特异性探针。,Exo,R,酶切位点,DNA,pol,32,P,dNTP,限制性酶,(3)从,DNA,末端,内切,S1,酶,