高中生物第4章现代生物技术4.3聚合酶链式反应技术讲义北师大版选修.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,第,3,节聚合酶链式反应技术,1,.,记住,PCR,技术的原理。,2,.,简述,PCR,技术的基本操作。,3,.,说出,PCR,技术的应用。,一,二,三,一、,DNA,片段的扩增,1,.,概念,PCR,技术是体外酶促合成,特定,DNA,片段,的一种方法。,2,.,扩增条件,按照,DNA,复制,所需条件,在体外酶促合成,DNA,时,必须具备待扩增的,目的,DNA,(DNA,合成的,模板,),、合成,DNA,时所需的特异,引物,和,原料,4,种三磷酸脱氧核苷酸,(,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,),、起酶促作用的,耐热,Taq,DNA,聚合,酶和作为反应介质的,缓冲溶液,。,四,一,二,三,3,.,原理,根据,DNA,的理化特性,在,高温,条件下,双链,DNA,解旋变为单链,DNA(,变性,);,低温,条件下单链,DNA,又可恢复为双链,DNA(,复性,);,中温,条件下能进行,DNA,合成,使,DNA,链,延伸,。由此,PCR,反应过程一般采取,“,高温变性,低温复性,中温延伸,”,三个步骤,促使,DNA,进行复制。以上述反应作为一个周期,循环,进行,使目的,DNA,得以迅速扩增,得到大量的目的,DNA,片段。,四,一,二,三,四,二、琼脂糖凝胶电泳检测,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化和,鉴定,DNA,的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量,负,电荷的,DNA,分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向,正,极泳动。,DNA,片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其,分子的大小,因此,大小一致,的,DNA,分子会在凝胶的一定位置形成,DNA,条带。,一,二,三,四,三、,DNA,片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳的方法步骤,1,.DNA,片段的,PCR,扩增,(1),把,PCR,反应体系的各种药品加入冰浴的,EP,管,中,混合均匀后,低速离心,。每管加入,30,L,无菌石蜡油。,(2),将,EP,管放入,PCR,热循环仪,中,输入并运行反应程序。,2,.,扩增产物的检测,制作电泳胶板,加样,电泳,观察。,一,二,三,四,四、,PCR,影响因素,在,PCR,实验中,需要扩增的,DNA,片段的大小决定延伸的时间,片段较大,中温延伸的时间就要相应,延长,;,引物的碱基,数量,和,组成,则决定着复性温度的选择,如果引物越短,A,、,T,含量越多,PCR,反应的复性温度就越,低,反之引物长度较长,G,、,C,含量较高,则需要设计较,高,的复性温度。,Taq,DNA,聚合酶在,PCR,扩增过程中也存在大约为,110,-5,的出错概率,而且随着循环数的增加,其活性也逐渐,降低,。因此,PCR,扩增循环次数并非越多越好,一般控制在,2535,个循环。,一,二,三,四,思考：,2014,年埃博拉疫情在非洲蔓延,随后生物科学研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒检测试剂盒,使得能够快速诊断出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒检测试剂盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎样获得的呢,?,提示,:,采用,PCR,技术对埃博拉病毒的基因迅速扩增产生的。,1,.,PCR,技术与,DNA,的复制,PCR,反应通过控制温度使,DNA,复制在体外反复进行。,PCR,反应的实质就是,DNA,复制,所以,PCR,反应与,DNA,复制的原理相同,计算方法也大体相同。例如,:PCR,反应中的目的片段一般以,2,n,的方式积累,其中,n,为反应循环次数。一个,DNA,片段在,30,次循环后反应物中大约有,10,亿个这样的片段。,2,.,PCR,的常见问题,PCR,实验很容易出现假阳性,(,检测出非目的片段的扩增,而未检测出目的片段的扩增,),或假阴性,(,未检测出任何片段的扩增,),的结果。,PCR,技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标,DNA,片段的大量扩增,因此模板,DNA,的污染是,PCR,出现假阳性结果的主要原因。此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR,操作时要注意做到隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。,出现假阴性结果的常见原因有,Taq,DNA,聚合酶活力不够或其活性受到抑制,;,引物设计不合理,;,提取的模板质量或数量不过关、,PCR,系统的建立欠妥当及循环次数不够,等等。当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入,Taq,DNA,聚合酶,并增加,510,次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用,Taq,DNA,聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。尽管,Taq,DNA,聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。所以,在提取,DNA,模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。,PCR,扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶,DNA,的互补情况,尤其需要保证引物的,3,端与靶基因互补。,PCR,的原理及应用,【例题,1,】,下列有关,PCR,的描述,不正确的是,(,),A.,是体外酶促合成特定,DNA,片段的一种技术,B.,引物一般采用人工合成的单链,DNA,片段,C.PCR,产物以指数方式增加,D.,扩增对象是氨基酸序列,解析,:,PCR,是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术,它能以极少量的,DNA,为模板,以四种三磷酸脱氧核苷酸为原料,在引物的作用下使,DNA,聚合酶从引物的,3,端连接脱氧核苷酸,短时间迅速复制上百万倍的,DNA,片段,其扩增产物以指数方式增加。,答案,:,D,题型一,题型二,【例题,2,】,标准的,PCR,过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是,(,),A.94,、,40,、,72,B.72,、,40,、,94,C.40,、,94,、,72,D.80,、,40,、,72,解析,:,当温度上升到,9498,时,双链,DNA,变性成单链,称之为变性,;,当温度迅速下降到,4060,时,引物通过碱基互补配对与单链,DNA,结合,;,当温度上升到,72,左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸,(A,、,T,、,C,、,G),在,Taq,DNA,聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的,DNA,链,称为延伸。,答案,:,A,题型一,题型二,题型一,题型二,解析,:,从土壤中分离微生物的一般流程是土壤取样,制备培养基,分装,制备土壤稀释液,接种培养,观察。该实验步骤没有问题,但在前五步操作中都没有进行无菌操作,因而无法说明分解纤维素的微生物一定来自于土壤。,答案,:,(1),取样工具应提前灭菌,;,不能用蒸馏水,应用无菌水,;,该操作应在火焰旁进行。,(3),培养基分装并加滤纸条后应灭菌。,(4),在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁。,(5),接种应在无菌条件下进行。,题型一,题型二,PCR,基本操作与产物测定,【例题,3,】,在,PCR,实验操作中,下列说法不正确的是,(,),A.,在扩增产物的检测中需配制质量分数为,10%,的琼脂糖凝胶,制成电泳胶板,B.,离心管的盖子一定要盖严,防止液体外溢,C.,在检测时,需将胶板浸入溴化乙锭溶液染色,510 min,D.,离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果,解析,:,在扩增产物的检测中,需配制质量分数为,1%,的琼脂糖凝胶,制作成电泳胶板。,答案,:,A,1,2,3,4,1.,有关,PCR,技术,下列叙述不正确的是,(,),A.,用于,PCR,的引物长度通常为,2030,个核苷酸,B.,在用,PCR,技术扩增,DNA,时,DNA,的复制过程与细胞内,DNA,的复制类似,C.PCR,反应只需一定的缓冲溶液和,DNA,模板以及四种三磷酸脱氧核苷酸,D.PCR,一般经历,2530,个循环,每个循环分为变性、复性、延伸,答案,:,C,解析,:,PCR,反应中需要的条件有模板,(DNA,分子,),、原料,(4,种三磷酸脱氧核苷酸,),、酶,(,耐高温,DNA,聚合酶,),、引物和一定的缓冲液等。,5,6,1,2,3,4,2.,引物的作用是,(,),A.,打开,DNA,双链,B.,催化合成,DNA,子链,C.,使,DNA,聚合酶能够从引物的,3,端开始复制,DNA,D.,提供模板,答案,:,C,解析,:,DNA,分子的复制具有方向性,即只能从引物的,3,端开始,从子链的,5,端向,3,端延伸。引物的作用是与,DNA,聚合酶结合促使,DNA,聚合酶能够从引物的,3,端开始复制,DNA,。,5,6,1,2,3,4,3.,使用,PCR,仪进行,DNA,扩增的具体实验操作顺序应为,(,),设计好,PCR,仪的循环程序,按配方准备好各组分,用微量移液器在离心管中依次加入各组分,进行,PCR,反应,离心使反应液集中在离心管底部,A.,B.,C.,D.,答案,:,C,解析,:,使用,PCR,仪进行,DNA,扩增前,首先按照,PCR,体系配方,依次将各组分加入离心管离心,使反应液集中于试管底部,然后再设计好,PCR,仪的循环程序进行,PCR,反应。,5,6,1,2,3,4,4.,利用,PCR,技术扩增目的基因的过程中,需加入,(,),A.,耐高温的解旋酶以保证,DNA,双链完全解开,B.2,种已知核苷酸序列的引物以保证核苷酸链的延伸,C.4,种足量的核糖核苷酸以保证目的基因的扩增,D.,一定量的盐酸和氢氧化钠溶液以维持,pH,的稳定,答案,:,B,解析,:,在,PCR,过程中,解旋是通过加热到,94,实现的,不需要加入解旋酶。,PCR,过程中以解开的,DNA,的两条链为模板,因此需要,2,种已知序列的引物分别与两条模板链结合,(,注意由于,DNA,分子的两条链是反向的,2,种引物会分别在,DNA,的两端与互补的模板链结合,),。,PCR,反应的原料是,4,种三磷酸脱氧核苷酸。反应溶液体系的,pH,依靠磷酸缓冲液维持稳定。,5,6,1,2,3,4,5,6,5.,要使,PCR,反应在体外条件下顺利地进行,需要严格地控制,(,),A.,氧气的浓度,B.,酸碱度,C.,温度,D.,大气的湿度,答案,:,C,1,2,3,4,5,6,6.,生物技术的迅速发展,给社会带来了较大的经济效益,受到社会广泛重视。请回答下列生物技术方面的问题。,(1),Taq,耐热菌的发现和分离为基因工程的发展作出了突出贡献。从培养液或自然环境分离,Taq,耐热菌需要在,条件下培养,;,从,Taq,耐热菌中分离的,酶是,PCR,技术的关键酶。,(2)1993,年,美国科学家,Mullis,因发明了,PCR,技术而获得了诺贝尔化学奖。,PCR,过程中必需的条件包括,DNA,聚合酶、模板,DNA,、能量、,4,种游离的三磷酸脱氧核苷酸、缓冲溶液和,;,在生物体内复制必需,而在,PCR,技术中不需要的成分是,。,答案,:,(1),高温热稳定,DNA,聚合,(2),引物解旋酶,