高效液相色谱法测定苦参注射液中苦参碱的含量.pdf

刘素梅，方忠意，刘占通，等.高效液相色谱法测定苦参注射液中苦参碱的含量J.中兽医医药杂志，2023，42（5）：75-77苦参注射液为苦参提取物制成的灭菌水溶液，收载于 兽药质量标准（2017年版）中药卷中，具有清热燥湿的功能，主要用于畜禽湿热泻痢的治疗。苦参中主要有效成分为苦参碱型生物碱1，苦参碱为具有代表性的成分之一。现行兽药国家标准含量测定项下采用容量法测定苦参总碱的含量2，该方法操作较烦琐，使用三氯甲烷多次萃取和洗涤，危害检测人员健康，测得结果为苦参总碱和碱性物质的含量，专属性差，故拟采用高效液相色谱法对苦参碱含量进行测定。1仪器与试药1.1仪器设备Waters高效液相色谱系统，包括2695分离系统、2489 紫外检测器、Empower2 色谱工作站；METTLERXS205电子天平；MILIPORE超纯水处理器等。1.2试药苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱对照品均购自中国食品药品检定研究院，液相用甲醇、乙腈为色谱纯试剂，磷酸二氢钾、乙酸铵为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。2方法与结果2.1色谱条件的选择查阅相关文献3-10，在C18色谱柱条件下，分别考察乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（pH值6.8）、甲醇-乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH值8.1）和乙腈-磷酸溶液（pH值7.6）等系统，均不能同时将苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱3个组分完全分离开来。综合考虑，采用 兽药质量标准（2017年版）中药卷大蒜苦参注射液中含量测定方法测定苦参注射液中苦参碱的含量，最终色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（15 15 70，pH值6.8）为流动相，检测波长为220 nm。2.2样品的制备2.2.1标准工作液的制备精密称取苦参碱对照品50 mg，置 100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用甲醇分别稀释成质量浓度为 5 g/mL、10 g/mL、25 g/mL、50 g/mL、100 g/mL、200 g/mL和 500 g/mL 的标准工作液，过 0.22 m 微孔滤膜，即得。2.2.2供试品溶液的制备精密量取本品 5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。2.2.3样品处理方法的考察方法一：精密量取本品 5 mL，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；方法二：精密量取本品 5 mL，置分液漏斗中，加水 10 mL、浓氨试液 1 mL，用三氯甲烷振摇提取 5次DOI：10.13823/ki.jtcvm.2023.084中图分类号：S853.7文献标识码：A文章编号：1000-6354(2023)05-0075-03高效液相色谱法测定苦参注射液中苦参碱的含量刘素梅，方忠意，刘占通，韩立，邱天宝，张跃京，王丽（河南省农畜水产品检验技术研究院，河南郑州450008）摘要：建立苦参注射液中苦参碱含量的高效液相色谱测定方法。样品用甲醇稀释后加入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为XBridge C18柱（4.6 mm150.0 mm，5 m），流动相为乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（15 15 70，pH值6.8），检测波长220 nm。结果显示，线性回归方程为y=7 488x+7 515，相关系数r=0.999 9，即在5500 g/mL范围内，苦参碱峰面积与浓度有良好的线性关系，回收率为100.0%。该方法操作简便、重复性好、准确度高，可以用于苦参注射液的质量控制。关键词：苦参碱；苦参注射液；高效液相色谱法；含量测定收稿日期：2023-03-21；网络首发日期：2023-06-27网络首发链接：https：/ 75Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine2023年42卷第5期Vol.42 No.5 2023（30 mL、30 mL、20 mL、20 mL、20 mL），合并提取液，蒸干，加甲醇使溶解，转移至 50 mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。两种方法测得最终含量结果和色谱图无明显差别。用甲醇直接稀释，操作简单快速，故样品用甲醇直接稀释处理。2.3线性范围考察取“2.2.1”项下的标准工作液，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度与相应的峰面积计算回归方程和相关系数，回归方程为y=7 488x+7 515，相关系数r=0.999 9，即在5500 g/mL范围内，苦参碱具有良好的线性。2.4准确度试验精密量取批号为 21210114的苦参注射液 5 mL，置 100 mL 容量瓶中，共 9 份，分别加入质量浓度为4 mg/mL、5 mg/mL和6 mg/mL的苦参碱对照品溶液各1 mL，每个浓度做3份。按照“2.2.2”项下方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算，结果见表1。2.5精密度试验精密量取批号为 21210114的苦参注射液 5 mL，置50 mL容量瓶中，共6份，按照“2.2.2”项下方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算苦参碱平均含量为1.077 1%，RSD为0.4%。2.6专属性考察苦参注射液为苦参提取物加水溶解制成的灭菌水溶液，生产中可能会加入适当的吐温-80和苯甲酸，本研究模拟生产工艺，配制了含0.1%吐温-80和0.1%苯甲酸的水溶液，用氨试液调节pH值至5.5，作为空白样品。精密量取空白样品5 mL，按照“2.2.2”项下方法进行处理，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测结果见图1图3。结果显示，在该色谱条件下，苦参碱主峰能与其他杂质峰完全分离。2.7耐用性考察2.7.1样品溶液稳定性考察取“2.5”项下的1份样品，分别在0 h、6 h、10 h、12 h和15 h进样，记录相应的峰面积，结果峰面积的RSD为0.8%，表明供试品溶液在15 h内稳定。2.7.2不同型号色谱柱考察取“2.5”项下的1份样图2苦参注射液样品HPLC色谱图Figure 2HPLC chromatogram of Kushen injection图1苦参碱对照品（100 g/mL）HPLC色谱图Figure 1HPLC chromatogram of matrine(100 g/mL)图3空白样品HPLC色谱图Figure 3HPLC chromatogram of blank sample表1苦参碱加样回收率试验结果Table 1Recovery test results of matrine编号1-11-21-32-12-22-33-13-23-3含量/mg5.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.4015.401添加量/mg4.146 44.146 44.146 44.146 44.146 44.146 45.102 85.102 85.102 85.102 85.102 85.102 86.071 06.071 06.071 06.071 06.071 06.071 0测得量/mg9.526 99.538 59.507 29.516 99.518 79.586 310.592 010.473 110.501 010.513 410.558 410.559 011.425 811.581 511.419 811.437 211.431 511.447 8回收率/%99.50699.78699.03099.26499.308100.938101.72899.39899.945100.188101.070101.08299.239101.80499.14099.42899.33399.60199.6599.15100.12100.56100.07101.08100.5299.2899.47平均回收率/%100.0RSD/%0.7 76刘素梅，方忠意，刘占通，等.高效液相色谱法测定苦参注射液中苦参碱的含量J.中兽医医药杂志，2023，42（5）：75-77品，采用不同的色谱柱进样，对该方法的耐用性进行考察。分别考察了Waters Xbridge C18（4.6 mm150.0 mm，5 m）、phenomenex Gemini C18（4.6 mm250.0 mm，5 m）和Universil C18（3.9 mm150.0 mm，5 m）3种色谱柱，柱效和分离度均能满足检测需求。2.8样品测定按照上述方法对9批苦参注射液中苦参碱含量进行测定，其含量为1.080 22.391 0 mg/mL。3讨论基于对环境友好的原则，本文直接用甲醇提取苦参碱，提取效果与三氯甲烷无明显差别，操作简便快速，可以更好地控制苦参注射液的质量。采用 中华人民共和国兽药典 2020年版二部苦参中含量测定色谱条件，利用氨基柱，在乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液系统下检测，对照品溶液中苦参碱、氧化苦参碱可以分离完全，但色谱峰前延严重。在流动相中加入磷酸二氢钾，色谱峰前延情况稍改善，柱效也有提升。但测定样品时槐定碱与氧化苦参碱无法完全分离，且由于氨基键合相容易流失，色谱柱耐用性差，在进样一定次数后柱效下降，峰形变差，出现肩峰，分离度变差，难以满足要求。查阅相关文献，在C18色谱柱条件下，分别考察了乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（pH值6.8）和甲醇-乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH值8.1）等系统，均不能同时将苦参碱和氧化苦参碱两个组分完全分离开来，综合考虑，采用文中方法，只测定了苦参碱的含量。参考文献1刘君如，张彦，杨黎燕，等.苦参本草考证道地性与现代研究 J.中医药导报，2021，27（7）：78-81.2中国兽药典委员会.兽药质量标准2017年版：中药卷 S.北京：中国农业出版社，2017：83-84.3李振兴，单雪梅，袁万瑞，等.HPLC法测定十味苦硝薰洗散中苦参碱和氧化苦参碱的含量 J.海峡药学，2020，32（11）：58-61.4徐云.HPLC法测定湿疹洗剂中苦参碱的含量 J.云南中医中药杂志，2019，40（3）：68-69.5邓开锋，吴俊伟，唐建华.HPLC法测定苦参注射液中苦参碱含量 J.中国兽药杂志，2010，44（11）：36-38.6季雪，李宪刚，崔韶婧，等.HPLC法测定喘嗽宁中苦参碱的含量 J.世界最新医学信息文摘，2019，19（85）：152-155.7门磊，张梦莹，胡文忠.高效液相色谱法同时测定复方木鸡颗粒中金雀花碱、苦参碱、槐果碱和槲皮苷的含量 J.沈阳药科大学学报，2020，37（2）：131-135.8李丰，胡春月，石延榜，等.HPLC法测定不同产地苦参饮片中苦参碱和氧化苦参碱的含量 J.中国中医药现代远程教育，2020，18（2）：102-104.9王璐，黄鲁，汪玥，等.抗敏颗粒质量标准提升研究 J.世界中医药，2020，15（16）：2364-2368.10中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：二部 S.北京：中国农业出版社，2020：296-297.Determination of matrine in Kushen injection by HPLCLIU Sumei,FANG Zhongyi,LIU Zhantong,HAN Li,QIU Tianbao,ZHANG Yuejing,WANG Li(Henan Institute of Agricultural,Animal and Aquatic Products Inspection Technology,Zhengzhou Henan 450008,China)Abstract:To establish a method of content determination for matrine in Kushen injection by HPLC.The sample wasdiluted with methanol and then detected by HPLC.The liquid chromatography was carried out on XBridge C18column(4.6 mm150.0 mm,5 m)with acetonitrile-methanol-PBS(15 15 70,pH 6.8)as mobile phase,and the detectionwavelength was 220 nm.The results showed that the equation was y=7 488x+7 515,r=0.999 9,the calibration curve waslinear in the range of 5-500 g/mL with the recovery rate of 100.0%.The method was simple,reproducible andaccurate to control the quality of Kushen injection.Keywords:matrine;Kushen injection;HPLC;content determination 77