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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,内 容 提 要,一.内毒素(LPS)的检测,二.肠道致病菌的分离培养,三.细菌在自然界的分布及理化因素对细菌生长的影响,(一)内毒素的检测,目的,1 掌握内毒素实验的原理和操作方法。,2 熟悉内毒素实验的意义。,检测内毒素的方法有家兔发热法和,鲎,(hu),实验,法,家兔发热法比较烦琐,且灵敏度不高,故现在多用鲎实验法,鲎实验法灵敏度高,可检测,小于10ng/ml,的内毒素,。,内毒素生物学活性:,致热作用,、,白细胞反应,、,感染性休克 和,DIC,等,。,原理:,鲎是一种海洋节肢动物,其血液中含有一种有核变形细胞,这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。,内毒素(LPS),激 活,凝固蛋白原 凝固蛋白,(溶解状态),(凝胶状态),凝固酶原,凝固酶,材料:,鲎试剂,内毒素试剂,鲎试剂专用溶解水,无菌无热源质吸管,方法:,(每4个人一组,两支鲎试剂,一支实验一支对照),1.取两支鲎试剂打开,分别加入0.1ml 鲎试剂溶解水,使之溶解,2.其中一支加入0.1ml内毒素,标记上实验组,另一支加入0.1ml溶解水,作为对照,3.垂直放入37温箱,20-30分钟观察结果,结果:,实验组出现凝固,对照组不出现凝固,内毒素检测的应用:,(1),检测输液用品或生物制品中是否,含有内毒素,(,2,),临床上检测患者是否有革兰氏阴性,菌感染引起的内毒素血症(内毒素,休克)等,二.肠道致病菌的分离培养,2学时,一.,常见培养基的特性及用途,二.,致病性肠道杆菌的生物学性状,三.分离培养方法,肠道细菌的分离培养,一、培养基,概念:,是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物,制品。,成分:,充足的营养物质(水分、碳源、氮源、无机,盐);合适的 PH,适宜的温度;适宜的气体,环境。,用途:,用于微生物的繁殖及分离接种,传代或保存,,鉴别微生的类属,研究微生物的生理及生化特,性,制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。,二、分类,主要用于增菌,用于检测动力及保存菌种,用于分离鉴定细菌,双糖铁培养基,S-S培养基,普通琼脂培养基,血液琼脂培养基,庖肉培养基,培养基的制备程序,调配 过滤 矫正pH(7.0-7.6)分装过滤 灭菌(121.3,20-30分钟)鉴定是否有菌 放入冰箱冷藏备用,因高压之后pH值会下降0.1左右,所以矫正pH时应比所需的pH高,鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养24小时,然后观察,肉汤培养基制作方法,1.将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉50克,加蒸馏水100ml,放入冰箱中过夜。,2.加热煮沸半小时至一小时后,用数层纱布或滤纸过滤,,滤液用蒸馏水补足其量为100 ml。,3.于滤液中加入氯化钠0.5克,蛋白胨1克,磷酸氢二钾0.1克,加热使之完全溶化。,4.测定酸碱度并,调至pH7.6,,必要时用滤纸过滤。,5.按需要分装于试管或烧瓶内,加棉塞,置高压蒸汽灭菌器内,,经121.3、20-30分钟灭菌。,6.灭菌后置37温箱孵育24小时,,无杂菌生长,,即可应用或放冰箱备用。,液体培养基加入1-2%的琼脂为固体培养基,加入0.5%琼脂为半固体培养基。固体培养基加入血液即为血平板(营养培养基)。,血液琼脂培养基(血平板,),在普通琼脂培养基的基础上,加入血液,制备而成,是最常用的营养培养基,可供营养要求较高的细菌生长.,常用于分离培养,和溶血现象观察,.,含有胆酸盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长.,含有中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红.,常用于培养肠道致病菌,.,SS培养基,(Salmonella-Shigella Mediun,),SS培养基,肠道杆菌的生物学性状,埃希菌属:大肠埃希菌,沙门菌属:伤寒沙门菌,甲型、乙型副伤寒沙门菌,志贺菌属:痢疾志贺菌,肠杆菌科重要菌属及代表菌种,1 大肠杆菌:,生物学性状:G-,镜下为杆状,,多数菌株有周鞭毛,菌毛,无芽孢,兼性厌氧,营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长,发酵葡萄糖等,产酸产气,最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,肠道杆菌的生物学性状,菌落特点:,圆形,凸起,灰白色,表面光滑,湿润,直径2-3mm,肠产毒型大肠杆菌(轻度腹泻,肠毒素,,定植因子),肠侵袭型大肠杆菌(与志贺菌相关,与菌痢相似,里急后重,不产生肠毒素),肠致病型大肠杆菌(最早发现的引起腹泻的,大肠杆菌,婴幼儿),肠出血型大肠杆菌(出血性结肠炎和溶血性,尿毒综合征的病原体,,轻 度水泻伴剧烈腹痛血便,,常见食品污染),肠集聚型大肠杆菌(婴儿和旅行者持续水样腹泻,偶有血便,不侵袭细胞,,在细胞表面自动聚集,形成,砖样排列),分类:(胃肠炎),(2)伤寒杆菌,生物学特性:,G-,镜下为,杆状,有菌毛,除个别外都有周鞭毛,一般无荚膜,均无芽孢。,兼性厌氧,,营养要求不高,不发酵乳糖或者蔗糖,对葡萄糖,麦芽糖,甘露糖发酵,产酸不产气,其他沙门菌产酸产气,可在普通琼脂培养基上生长,最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,菌落特点:,圆形,凸起,无色,细小,半透明,表面光滑,湿润,直径2-3mm.,1、相似的形态染色,从形态上无法区别,中等大小的,G,-,杆菌,多有鞭毛、菌毛,肠道杆菌的生物学性状,2、活泼的生化反应,肠道杆菌的生物学性状,乳糖发酵试验,初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌,肠道致病菌,肠道非致病菌,多数不发酵乳糖,多数发酵乳糖,肠道杆菌的生物学性状,-/+,-,+,伤寒杆菌,-,-,+,痢疾杆菌,-,大肠杆菌,硫化氢,乳糖,葡萄糖,菌名,将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。,(每个实验室8个平板),(接种好后,做好标记,用胶布按班绑好),放入,37,温箱中培养24小时。取出放4冰 箱,中保存备用。,分离培养方法,三、消毒灭菌,(2学时),1.细菌在自然界的分布及理化因素,对细菌的影响,2.高压蒸汽灭菌法,空气中细菌的检查(,每个班1个平皿,),原理:,根据空气中携带有微生物气溶胶(以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶,其中的气体是分散介质)粒子在地心引力的作用下,以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。,方法:,在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖,皿盖扣置于皿底下,暴露放置15min,即盖上皿盖,放入37,培养24小时,观察结果。,1.1 细菌在自然界的分布,1.2.1紫外线对细菌的影响(,每个实验室1个培养皿),原理:,紫外线主要作用于DNA,使一条DNA链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体,从而干扰DNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。,对病毒也有破坏作用。,紫外线杀菌作用,强,,而穿透能力,弱,。,普通玻璃,、,纸张,、,水蒸气,、,尘埃等均能阻挡。,紫外线中波长为240-300nm者具有杀菌能力,其中,265-266nm,的杀菌作用最强。,常用于消毒物体表面,手术室无菌实验室,传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。,1.2,理化因素对细菌的影响,紫外线对细菌的影响,取一个平皿,用密涂法将细菌涂布于培养皿中,然后按图所示揭开平皿盖,置于紫外线下照射30分钟,然后盖好盖子,置37培养24h后取出观察结果。,1 促进菌体蛋白质变性或凝固。,2 干扰细菌酶系统和代谢。,3 损伤细菌的细胞膜,影响细菌的化学组成,物理,结构和生理活动,从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。,1.2.2化学消毒剂对细菌的影响,有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物,,称为,化学消毒剂,;,浓度低时能抑制细菌生长,称为,防腐剂,;,(只能外用,对细菌的敏感性不同),化学消毒剂对细菌的影响,化学消毒剂分类,1 高效消毒剂:杀灭细菌芽孢在内的所有微生物,适用于不,耐热力灭菌但要进入人体内部的物品,如内,窥镜等。,次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等,2 中效消毒剂:不能杀灭芽孢,但能杀灭繁殖体(包括结核,杆菌),真菌和大多病毒,如喉镜,麻醉器材,碘酊、乙醇等,3 低效消毒剂:能杀灭大多细菌繁殖体,但不能杀灭芽孢,,结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。,新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等,影响消毒灭菌的因素,1 微生物的种类,2 微生物的污染程度,3 环境中的有机物,4 消毒剂的性质、浓度与作用时间,5 温度、湿度、酸碱度,6 化学拮抗物,化学消毒剂对细菌的影响,方法,:,取一普通平皿培养基,,一部分写上,“,前,”,,另一部分,写上,“,后,”,,然后将手指在写,有,“,前,”,的部分沾一下,再将,手指用酒精进行消毒,在写,有,“,后,”,的部分沾一下。放入,37,温箱培养,24小时,后观察。,(,每个实验室2个平皿,),方法:,用,“,打咳法,”,进行检查。,取一个血琼脂平皿培养基(咽喉部多为葡萄球菌),打开平皿盖,对着平皿咳嗽几次(口腔前约10厘米),然后放入,37,温箱培养,24小时,后观察菌落数量及特征。,咽喉部细菌的检查,2 高压蒸气灭菌法,原理:蒸汽被限制在密闭容器内,随着热力的作用压力不断升高,蒸汽的温度也相应升高,在103.4kPa蒸汽压力下时,温度可达121.3。维持1520分钟后,可杀死细菌包括芽孢在内的所有微生物。,高压蒸气灭菌器,1)构造,高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒,两层之间盛水,外层坚厚,其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋,借以紧闭盖门,使蒸气不能外溢。,高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀,以调节器内压力,装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。,器内装有带孔的金属搁板,用以放置欲灭菌对象。,高压蒸汽灭菌法,压力:,1.05kg/,或103.425KPa,温度:,121.3,时间:,15-20min,完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢,用途:适用于耐高温、高压,不怕潮湿的物品,,如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等,全自动高压蒸汽灭菌锅,Systec D-200 2D 双门高压灭菌器,电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器(型号YXQ-WY21-600),台式蒸汽灭菌器 BA-30,全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅,电脑全自动水浴式串联杀菌锅,2)使用方法,加水至锅内达规定的水平面,放人欲灭菌物品,把锅盖按对称的螺旋先后对称用力(切勿单个依次)扭紧,使锅盖确实均匀密闭。,用电炉加热,同时打开排气阀门,使器内冷空气逸出,保证器内温度和压力表所示一致。待空气全部排出后,关闭排气阀。,继续加热注视压力表,器内压力又逐渐升高,直到压力表指在所需数字(例如15磅)即调节热源,维持2030min可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。,灭菌时间到达后,停止加热,待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀,排尽余气,打开锅盖,取出灭菌物品。,3)注意事项,检查排气活塞及安全阀门,特别是压力表的性能是否正常,以免发生危险。,灭菌物品不应放置过挤,妨碍蒸气流通,影响灭菌效果。,灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除,否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力,灭菌将不彻底。,灭菌过程中及灭菌完毕,,灭菌后,切不可,排气过急,,突然打开排气阀门放气减压,以免瓶内液体外溢或者破裂。,第二天观察结果,本次试验不写试验报告,下周一起写肠道杆菌的分离鉴定依据和结果,预习下周内容:肠道杆菌的鉴定、药敏实验,抗酸染色,
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