不同类型细胞培养特点.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 个别细胞和组织的培养,类型：,正常细胞培养,肿瘤细胞培养,第一节 正常细胞培养,正常细胞，在体外培养时都,不易生长，建立细胞系更难。,正常细胞难培养的,原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格,.,但只要一切条件适当仍有培养成功可能。,一、上皮细胞类培养,上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；,培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。,上皮细胞培养有三个难点：,需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；,需求特殊培养基；,与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。,纯化和延长上皮细胞生存期,是上皮细胞培养的关键之一。,(,一,),表皮细胞培养,1,特点,：,在有胶原的底物上易生长,；,把人或小鼠表皮细胞培养在以,3T3,细胞为饲养层,(,用射线照射后,),上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。,降低,pH,、,Ca2+,的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。,向培养基中加氢化可的松,(10 g/m1),、,10,-6,M,的异丙基肾上腺素,(,Isoproterenol,),和,10 ng/m1,促表皮生长因子,(EGF),能促表皮细胞生长。,【,饲细胞,】,饲细胞,(Feeder Cells),也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。,饲细胞作用：,有同化营养液的能力,。,饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成,。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。,饲细胞的制备：,(1),取原代培养的,人或动物胚胎成纤维细胞,，,90%,汇合时制成细胞悬液，再按,10,3,细胞,/,毫升重新接种培养；,(2),在细胞半汇合时，准备,0.25g/ml,的丝裂霉素，按,2ug/10,5,细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量,30,50,戈瑞,(,Gy,),；,(3),细胞经上述处理后，,Hanks,液漂洗两次、更换培养液、再培养,24,小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按,510,4,/ml,接种入新培养基中；,(4)48,小时后，即可用于细胞克隆之用。,2,表皮细胞培养程序：,(1),取材,：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成,0.5 1cm,2,小块；,(2)EDTA,处理,：先置入,0.02,EDTA,中室温置,5,分钟。,(3),冷消化,：换入,0.25%,胰蛋白酶中，置,4,过夜；,(4),分离：,取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；,(5),温消化：,取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的,0.25,胰蛋白酶中，,37,再消化,30 60,分钟；,(6),制细胞悬液：,用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；,(7),加培养液：,通过,80,目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入,Eagle,液和,20,小牛血清,.,(8),培养：,接种入碟皿中，,CO2,温箱培养。,注意事项：,冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；,如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入,PBS,中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。,(,二,),胃上皮细胞培养,适于胃上皮细胞生长的条件是：,胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；,应用胶原底物培养；,制备含有特定成分的培养基；,培养程序：,(1),取材,：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端,非病变区,粘膜少许；,(2),清洗,：用含庆大霉素,(400g/m1),和两性霉素,(2g/m1,的,Hanks),液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成,1mm,大小；,(3),消化,：在,I,型胶原酶,和,透明质酸酶,中，于,37,中消化,80,分钟；,(4),离心,：收集细胞悬液，,800,转,/,分离心后，,Hanks,液漂洗两次；,(5),接种,：末次离心后加入含有,1,2,胎牛血清的完全培养基,，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。,细胞接种后一般在,16,小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持,2 3,周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。,(,三,),肝细胞培养,肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。,1,初代组织块培养：,肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成,1mm,3,左右的小块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。,2,初代消化法培养：,(1),把肝组织切成,2 4,立方毫米的小块，用不合钙镁的,BSS,液洗两次；,(2),移入,1:1,的,0.1,胰蛋白酶和,0.1,胶原酶,(,都用无钙镁,BSS,配制,),中，,4,冷消化,10 12,小时后，通过,250,微米和,64,微米尼龙网或不锈钢纱网滤过,(,用纱布滤过亦可,),；,(3),收集细胞、,BSS,液洗,1 2,次、计数、接种培养；,3,肝脏灌流法：,需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好,。,(1),无菌解剖动物，取出肝脏，先用,BSS,洗除血污；,(2),取,5ml,注射器一支，吸取消化液后，把,注射器头轻轻插入肝管中,，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；,消化液在肝内停留,20 30,分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；,(3),待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用,RPMI 1640,培养基培养,(,较其它培养基为好,),，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。,(,四,),内皮细胞培养,应用材料：,人脐带脐静脉、动物大动脉等，,用灌流消化法获取细胞最为简便。,(1),取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于,4,中，但不宜超过,12,小时；,无菌剪取长,10 15,厘米一段,。,其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养；,(2),先用三通注射器吸,温,PBS,液注入脐带的脐静脉中，洗除残血,；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；,(3),用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为,0.1,的胶原酶,，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，,消化,3 10,分钟,；,(4),吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中,；为获取更多细胞，可再注入温,PBS,冲洗,2 3,次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心；,(5),吸除上清，加,1640,培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养,，顺利时,2 3,天内细胞即可长成单层。,人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传,6 7,代后即衰退，难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好，可传,10 30,代；,不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对各种作用因素反应亦有很大差别。,(,五,),毛细血管内皮细胞培养,毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。,近年毛细血管培养已获成功；,利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织,(,如卵巢癌,),等均可；,1,材料：,肿瘤条件培养基制备,(1),取,C3H,小鼠的,S-180,实体肉瘤组织,；,(2),胰蛋白酶消化,，,Dulbecco,改良,Eagle,氏培养液,15m1(,含,10,小牛血清,),种到培养瓶中培养；,(3),在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含,10,小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基；,(4)4000,转分离心后，再通过,0.22m,微孔滤膜滤过，,-20,冻存备用,(,临用前融解,),。,凝胶底层制备,(1),取,60 mm Falcon,产培养皿，加,1%,Difco,产明胶,(,用不合钙和镁的,Hanks,液配制,),，铺盖瓶底，形成薄层；,(2),置,4,过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。,2,初代培养,(1),取材,：取新鲜牛肾上腺数个，先用,Hanks,液洗除血污；,(2),消化：,剥除被膜，分离出皮质，切成,l mm,3,小块，加,0.5,胶原酶室温中消化,1,小时；每隔,10,分钟用吸管吹打悬液令消化充分；,(3),过滤：,通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于,110,微米长的毛细血管小段；,(4),离心：,650 rpm,，,4,，离心,7,分钟后，弃掉上清胶原酶；,(5),再离心：,沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次；,(6),制细胞悬液：,末次沉淀物仍用含,10,小牛血清的,Dulbecco,改良,Eag1e,氏培养液重悬后，稍吹打；,(7),接种：,接种入铺有明胶底层的培养皿中，,37,培养；在培养头,1 3,小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮；,(8),换液：,吸除培养液，再,加入肿瘤条件培养液,；每两天换液一次。毛细血管小段一般成自,1 4,个内皮细胞，,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续,2 5,天。,3,毛细血管内皮细胞分离培养：,(1),初代培养,2 3,天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起；,(2),镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长,(15 20,分钟,),；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；,(3),用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；,(4),剩余内皮细胞岛如小,(5 20,个细胞,),而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入,3T3,等饲细胞；饲细胞接种量为,4000,细胞,cm,2,；,(5),当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基；,(6),接种入明胶底物皿中继续培养,(,饲细胞死亡被淘汰,),，细胞增殖生长汇合后，按,1:5,传代。,二、结缔组织类细胞培养,(,一,),成纤维细胞培养,包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。,用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。,小鼠成纤维细胞培养条件,12.514.5d,胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；,最佳培养基为,DMEM,添加,15%,小牛血清；,第,3,代细胞增殖最旺盛；,室温条件下，,0.125%,胰蛋白酶消化时间以,810min,为宜。,在培养,ES,细胞时，应选择第,35,代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。,小鼠成纤维细胞；细胞来源：,swiss,小鼠胚胎,(,二,),巨噬细胞培养,巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。,巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活,2 3,周，因之多用作初代培养,。,巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如,P388D-1,、,J774A,1,、,RAW309,、,Cr.1,等。,1,培养技术要点：,来源和取材,巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。,实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用,40g,的,PHA,注入腹腔中，能产生,6 810,6,个细胞，而且无刺激性，效果较好。,2,培养方法：,培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。,程序,(1),实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤,1ml(,勿注入肠内,),；,(2),引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入,70,酒精中,3 5,秒；,(3),置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁；,(4),再用,70,酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸,10ml Eag1e,液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；,(5),用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；,(6),小心拔出针头，把液体注入离心管中，,(4),离心,10,分钟后，去上清，加,10 ml Eagle,培养基；,(7),计数细胞，每只小鼠可产生,20 3010,6,细胞，其中,90,为巨噬细胞；,(8),为获取,310,5,个贴附细胞平方厘米，需接种,2.510,6,m1,；,(9),为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用,Eagle,液冲洗,1 2,次后，再加新,Eagle,培养液置,37 CO,2,温箱中培养。,三、肌组织细胞培养,以心肌和骨骼肌培养较为实用。,(,一,),骨骼肌细胞培养,动物胚或幼体的,大腿肌组织为最好的培养材料,。取材常用生后,1 2,天的乳鼠,(,Wistar,大鼠更好,),。,(1),取材,：,杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成,0.3 0.5,厘米小块；,(2),消化,：,用不含钙镁离子的,Hanks,液配的,0.25,胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加,10,小牛,(,或马,),血清培养，,为促进分化可加,1,的胎汁；,(3),接种：,细胞接种量为,210,6,/,皿；接种在胶原或明胶的底物上能促进细胞分化。,明胶制备比较简单，常用,Hanks,液配的,0.01,明胶。,生长特点：,细胞生长开始呈纺锤形，培养,50 52,小时后将出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时能观察到横纹。一般在融合后二三天内能见到收缩现象；因收缩运动有时可导致细胞从底物脱离。,(,二,),心肌细胞培养,最常用材料：,鸡胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎儿心肌等都可应用,。,心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如,悬滴培养、组织块培养和消化培养法,等，主要取,心室肌,培养，均能获得良好的生长效果。,程序,(1),选新鲜受精鸡卵，置温箱中孵育,(,温箱中放有水槽，以维持箱内湿度,),；每日翻动一次,(180,度,),，孵育,9 12,天；,(2),取鸡胎；,(3),用眼科剪剪开胸腔，剥出心脏，置入皿中用,Hanks,液漂洗,1 2,次；,(4),小心剪除大的动静脉，保留心室肌；用,组织块或消化培养法均可,。初代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，,纯化及生长特点：,常杂有成纤维细胞和内皮细胞；,心肌细胞亦较其它成分贴壁慢，可反复贴壁法排除其它细胞成分。在培养成功时，相差显微镜下可观察到横纹；一周后便可出现节律性收缩现象。,乳鼠心肌细胞原代培养,四、神经组织细胞培养,神经组织主要由两种神经细胞,(,神经元和神经胶质细胞）组成。,神经元为高度分化的细胞，在组织发生晚期已失掉增殖能力，对生存条件要求高，,只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或在加入神经生长因子,(NGF),和胶质细胞因子时，才能生存，并可能出现一定程度的分化现象，如长出突起等，但却难使之增殖；,即使培养胚胎组织情况也是如此。,神经胶质细胞为较易培养成分，它分少突、星形和小胶质三种,。,神经胶质细胞与神经元有共存关系。,人脑胶质瘤细胞,大鼠,c6,胶质细胞,(,一,),初代培养,神经元能发生一定分化现象，如生长突起，但因无增殖能力，最后衰退死亡；但神经胶质尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。,(,二,),传代培养,神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。不仅能获得生长的胶质细胞并可形成能传代的二倍体细胞系。,(,三,),培养方法,人脑组织可用于神经胶质细胞培养，培养组织来自手术室无菌取脑髓灰质或白质均可用于培养，,1,程序：,(1),细胞悬液制备：,获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入,Hanks,液中漂洗,1 2,次后，置于,30 50,倍的,Hanks,液中；脑组织比较柔软，反复吹打即可制备成细胞悬液；,(2),排除脂肪成分和其它碎块,：把悬液注入离心管中，在室温直立,5 10,分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获较多的细胞成分；,(3),滤过、计数、接种：,向末次沉降物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置,5,C02,温箱中培养；,(4),传代：,细胞生长汇合后，可用,0.25,胰蛋白酶消化法做传代处理。,2,生长特点：,接种后初期，细胞可能出现飘浮不贴壁现象，贴壁后在短期内也可能不见细胞分裂现象；细胞适应环境过程较长，然而一旦生长后，即能进入较旺盛的增殖状态。,生长开始常杂有巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞等，传二、三代后，这些成分即消失，逐渐形成均一的星形胶质细胞，一般形成连接不甚紧密的单层细胞,第二节 肿瘤细胞培养,肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。,肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。,培养方法,肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。,初代培养应用组织块和消化培养法均可。,一、要点,1,取材：,人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材时尽量避免用退变组织，要,挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。,2,培养基：,肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的,RPMI l640,、,DMEM,、,Mc-Coy5A,等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大。,培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。,3,成纤维细胞的排除：,成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。,成纤维细胞排除法,1,机械刮除法：,是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头,(,用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝,),，或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用,(,也可用特制电热烧灼器刮除,),。刮除程序为：,(1),标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；,(2),刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；,(3),用,Hanks,液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；,(5),注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。,2,反复贴壁法：,根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，,(1),细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，,Hanks,冲洗,2,次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；,(2),编号为,A,、,B,、,C,三个培养瓶；首先把悬液接种入,A,培养瓶中，置温箱中静止培养,520,分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入,B,培养瓶中后；向,A,瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；,(3)B,瓶中细胞,520,分钟后，按处理,A,的方法，把培养液注入,C,培养瓶中；再向,B,瓶中补加完全培养基。,当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见,A,瓶主要为成纤维细胞，,B,瓶两类细胞相杂，,C,瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。,3,消化排除法：,(1),先是用,0.5,胰蛋白酶和,0.02,EDTA(1:1),混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；,(2),把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，,成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落,，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。,4,胶原酶消化法：,本法是,利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,，通过消化进行选择。,(1),可用,0,5mg,ml,的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；,(2),用,Hanks,洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞末被除净，可再次重复。,5,其它方法：,有人发现,聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用,；也有人用聚蔗糖制备成比重,1.025 1.085,的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在,23,中,800g,离心,10,分钟。在比重,1.025 1.050,层为成纤维细胞，在比重,1.065 1.085,层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如,SOD,抑制成纤维细胞生长的方法。,选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。,二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施,1,适宜底物：,如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。,2,生长因子：,应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。,3,动物体媒介培养：,为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞,(,干细胞,),的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。,Hela,细胞,肝癌细胞,人乳腺癌细胞株,MCF-7,