研究生分子生物学工作基础.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/19,*,研究生分子生物学工作基础,2020/12/19,1,核酸化学,2020/12/19,2,一，核酸分为核糖核苷酸（,RNA,）和脱氧核糖核苷酸（,DNA,），它们的基本组成单位是核苷酸,2020/12/19,3,DNA,和,RNA,组成的差异,碱基 戊糖 磷酸,DNA A G C T,脱氧核糖,-,RNA A G C U,核糖,-,2020/12/19,4,二、核苷酸及其连接,2020/12/19,5,三、,DNA,的结构,1,DNA,的一级结构,DNA,的一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及其连接方式。由于,DNA,中核苷酸彼此之间的差别仅见于碱基部分，因此,DNA,的一级结构又指其碱基排列顺序，即,DNA,序列,(sequence),2,DNA,的空间结构,（,1,）,DNA,双螺旋结构,DNA,双螺旋结构特点如下。,i,，,DNA,分子由两条反向平行（一条是,5,一,3,、另一条是,3,一,5,走向）的多核苷酸链围绕同一个中心轴盘曲而成，两条链均为右手螺旋。,DNA,链的骨架由交替出现的亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧；碱基位于双螺旋的内侧。,ii,，两条多核苷酸链间以配对碱基之间形成的氢键相联系：一条链中的,A,与对侧链的,T,配对，形成两个氢键；,G,与,C,配对，形成三个氢键；氢键方向与长轴垂直。这种碱基配对（,base pairing,）又称碱基互补（,Fig.3-10,），所以组成,DNA,的两条链为互补链。,iii,，碱基对平面在螺旋中的位置与螺旋轴几乎垂直，相邻碱基对沿轴旋转,36,，上升,0.34nm,。每个螺旋结构含,10,个碱基对，螺旋的螺距为,3.4nm,，直径是,2.0nm,。,DNA,两股链之间的螺旋状凹陷一面较浅，称为小沟,(minor groove),；对侧较深，称为大沟,(major groove)(Fig.3-11),。近年研究证明，大、小沟携带了其他分子可识别的信息，是蛋白质,-DNA,相互作用的基础。,IV,，,DNA,双螺旋结构的稳定主要由互补碱基对之间的氢键和碱基堆积力来维持。,2020/12/19,6,2020/12/19,7,（,2,）,DNA,的超螺旋结构与染色质组装,在细胞中，双螺旋还可以进一步盘曲形成更加复杂的、多种形式的空间结构，其中以超螺旋（,supercoil,）最常见,由于双螺旋本身具有方向性，因此，超螺旋的旋转方向不同可形成两种不同手性的超螺旋：负超螺旋,(negative supercoil),，其超螺旋方向与双螺旋方向相反，即左手超螺旋，这是生物体中最常见的,DNA,超螺旋形式；正超螺旋,(positive supercoil),，其超螺旋方向与双螺旋方向相同，即右手超螺旋，目前仅发现于一种嗜热菌,Sulfolobus,体内,2020/12/19,8,2020/12/19,9,真核细胞基因组,DNA,的超级结构与染色质的组装密切相关。首先，由双螺旋,DNA,与一组称为组蛋白,(histones),的蛋白质共同构成核小体,(nucleosome),。在一个典型的核小体中，大约有,200,个碱基对，其中,146,个碱基对与由组蛋白,H2A,、,H2B,、,H3,和,H4,各两分子组成核小体的核心紧密缠绕；组蛋白,H1,则与处于核小体之间的连接,DNA,（,linker DNA,）相连。在电子显微镜下，可观察到核小体成串存在，呈念珠状。在细胞分裂期间，形成核小体是,DNA,长度压缩的第一步。其次，在核小体形成的基础上，,DNA,链进一步折叠成每圈,6,个核小体、直径为,30nm,的纤维状结构。这种,30nm,纤维再扭曲成襻，许多襻环绕核骨架,(nuclear scaffold),形成棒状的染色质。核骨架中含有以组蛋白,H1,和拓扑异构酶,I,为主的多种蛋白。,2020/12/19,10,2020/12/19,11,四、,RNA,的结构,一级结构,单股多聚核苷酸链中核糖核苷酸的排列顺序和共价连接就是,RNA,的一级结构。,二级结构,尽管,RNA,分子是单股多聚核苷酸链，但是可有局部双链结构,三级结构,是在二级结构形式基础上折叠形成的空间构象，其中常见的形式之一就是“假结”（,pseudoknot,）（,Fig.3-16B,）。,RNA,分子的折叠（,folding,）结构不仅在结构上与蛋白质相似，而且在功能方面也有类似之处，即具有折叠形式的,RNA,有分子识别、结合或催化功能，例如具有三级结构形式的,tRNA,和核酶（,ribozyme,）,2020/12/19,12,2020/12/19,13,1,mRNA,的结构,m,7,Gppp,AAAAAAAA,DNA,hnRNA,mRNA,AUG,AUG,UAA,UCG,5,untranslation region,3,untranslation region,Translation region,2020/12/19,14,AUG,AUG,UAA,UAG,UGA,UAA,UAG,UGA,AAAAAA,mRNA,2020/12/19,15,2,tRNA,的结构,2020/12/19,16,3,rRNA,的结构,2020/12/19,17,4,非编码蛋白质,RNA,除了参与蛋白质生物合成的,mRNA,tRNA,和,rRNA,外，细胞中还存在另一类非编码蛋白质的,RNA(non-coding RNA,ncRNA),，此类,RNA,的一个共同特点是缺乏长的开放读码框架（,ORF,），不具有编码蛋白质的能力。至今，,200,多种,ncRNA,已经被证实。研究表明，这些,ncRNA,在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节,RNA,（,regulatory RNA,）。所以，在细胞中基因的功能性产物除蛋白质外，还包括这些非编码蛋白质,RNA,，如在核酸分类中曾经提到的,UsnRNA,、,microRNA,等,microRNA,的生物合成,：,2020/12/19,18,2020/12/19,19,五核酸的理化性质,1,紫外吸收,由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在,250280nm,波长处有光吸收，其最大吸收峰在,260nm,处。这个性质可用于核酸的定量测定,2,变性、复性和杂交,变性,：,双螺旋结构的稳定靠碱基堆积力和氢键维持。许多因素，如加热、酸碱过强等因素均可破坏核酸内这两种非共价键，导致,DNA,两条链完全解离，称为,核酸变性,(denaturation),。核酸变性中以,DNA,变性为最有意义，而,DNA,变性中又以,DNA,的热变性最常见。,DNA,变性是,DNA,二级结构破坏、双螺旋解体的过程。,DNA,变性时，碱基对之间的氢键断开，碱基堆积力破坏，但不伴随共价键的断裂，这是与,DNA,降解过程的区别,DNA,变性常伴随着一些物理性质的改变。如粘度降低，浮力密度增加，旋转偏振光的改变等，尤其重要的是紫外吸收光密度值（,OD260,）的改变。在双螺旋结构中，上下相邻的平行碱基堆积会导致双螺旋,DNA,溶液的,OD260,值比相同组成的游离核苷酸混合物的,OD260,值低约,40,，这种效应称为减色,(hypochromic),效应。,DNA,变性时引起这一效应的降低，与未发生变性的相同浓度,DNA,溶液比较，变性,DNA,在波长,260nm,的光吸收增强，这种效应称为,增色,(hyperchromic),效应,2020/12/19,20,利用增色效应可在波长,260nm,处监测温度引起的,DNA,变性过程，,DNA,变性发生在一定的温度范围内，这个温度范围的中点叫,融解温度,(melting temperature),，用,Tm,表示。当温度达到融解温度时，,DNA,分子内,50,的双螺旋结构被破坏。不同的,DNA,解链曲线的形式大致相同，但,Tm,值则有差异。,Tm,值与,DNA,的碱基组成和变性条件有关。,DNA,分子的,GC,含量越高，,Tm,值也越大，这是由于每一,GC,碱基对有,3,个氢键，比只有两个氢键的,AT,碱基对更稳定。因此，,DNA,分子所含的,GC,碱基对越多，两条链分开所需的能量越大，解链所需的温度越高；,Tm,值还与,DNA,分子的长度有关，,DNA,分子越长，,Tm,值越大。此外，溶液离子强度增高也可使,Tm,值增大。,复性：,DNA,的变性是可逆的。在适宜条件下，如温度或,PH,值逐渐恢复到生理范围，分离的,DNA,双链可以自动退火,(annealing),，再次互补结合形成双螺旋，这个过程称为复性,(renaturation),。,核酸的分子杂交：,复性作用表明了变性分开的两个互补序列之间的反应。复性的分子基础是碱基配对。因此，不同来源的核酸变性以后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，形成杂化双链,(heteroduplex),，这个过程称为杂交,(hybridization),。不同来源的,DNA,可以杂交，,DNA,与,RNA,、,RNA,与,RNA,之间也可以杂交。若标记一个已知序列的核酸，通过杂交反应就可以确定待测核酸是否含有与之相同的序列。这种标记的核酸称为探针,(probe),。由此发展出的分子杂交技术己成为分子生物学研究中不可缺少的基本技术，如,Southern,印迹（,DNA-DNA,杂交）、,Northern,印迹（,DNA-RNA,杂交）技术,2020/12/19,21,六核酸的核苷酸序列测定,1,化学裂解法,Maxam-Gilbert Method for DNA Sequencing,此方法的基本步骤为，,(1),先将,DNA,的末端之一标记放射性同位素,(32P,或,35S),；,(2),再对,DNA,样品分别进行多组具碱基特异的、随机的、不完全的化学修饰；,(3),采用修饰碱敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开,DNA,链；,(4),通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将,DNA,断裂片段按分子大小分离开；,(5),根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段的分布情况，直接读出,DNA,的核苷酸序列,2020/12/19,22,2020/12/19,23,2,双脱氧,DNA,链合成终止法,Sanger(Dideoxy)Method for DNA Sequencing,2020/12/19,24,七,DNA,的合成,1,DNA,复制,2020/12/19,25,2,反转录作用,(reverse transcription),2020/12/19,26,八合成,5,3,TATA,Start site,+1,Promoter,Hogness box,GC,CAAT,-70 -40 -25,Enhancer or Silencer,100 200 bp,Regulatory elements,2020/12/19,27,