western-blot总结前人的经验.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,Western Blot,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,Western Blot,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,Western Blot,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,Western blot,1.,实验的原理,2.,试剂的配制,3.,实验的步骤,4.,凝胶图象分析,2021/10/10,1,实验的原理,2021/10/10,2,实验室所用的试剂的配方参考,TAKARA,分子实验常用配方手册,试剂的配制,2021/10/10,3,蛋白样品的制备,SDS-PAGE,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,实验的步骤,2021/10/10,4,蛋白样品的制备,参考,RIPA,裂解液的说明书：,对于培养细胞样品,：,1.,取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入,PMSF,，,PMSF,的工作浓度为,1X,2.,对于贴壁细胞，去除培养液，用,PBS,、生理盐水或无血清培养液洗两遍。加入适量的裂解 液（约为细胞体积的,5-7,倍），用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置,20min,，,14000g,离心,10,分钟，取上清，即为 蛋白提取物。,2021/10/10,5,2021/10/10,6,3.,对于悬浮细胞，,2500g,离心,5min,收集细胞，用,PBS,、生理盐水或无血清培养液漂洗细胞，,2500g,离心,5min,收集细胞,加入适量裂解液,.,（约为细胞体积的,5-7,倍）。用移液器吹打数下，把细胞吹散，冰上孵育,20min,，,14000g,离心,10,分钟，取上清，即为 蛋白提取物。,对于组织样品：,1.,手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组 织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入匀浆器中。,2.,取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入,PMSF,使,PMSF,的最终浓度为,1x,。,3.,按组织净重（,g,）：裂解液,(ml)=1,：,10,的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆,(,如果裂解 不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的 用量,),。,4.,匀浆器匀浆,冰上孵育,20min,，直至充分裂解。,5.,充分裂解后,14000g,离心,10,分钟,取上清,即为蛋白提,2021/10/10,7,蛋白浓度的测定,使用,BCA,法测，详细步骤参考说明书,:,(1),取,1.2ml,蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（,30mg BSA,）中，充分溶解后配制成,25mg/ml,的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可,-20,长期保存；,(2),稀释标准品：取适量,25mg/ml,蛋白标准，稀释至,0.5mg/ml(,蛋白样品在什么溶液中，标 准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用,0.9%NaCl,或,PBS,稀释标准品,),。稀释后的,0.5mg/ml,蛋白标准也可,-20,长期保存；,(3),配制,BCA,工作液：按,50,体积试剂,A,加,1,体积试剂,B,配制适量工作液，充分混匀（配 制的量视样本量而定，,200l/,孔）。工作液室温,24,小时内稳定。,(4),加标准品：将标准品按,0,、,1,、,2,、,4,、,8,、,12,、,16,、,20l,加入,96,孔板的标准品孔中（做 副孔），加标准品稀释液补足到,20l,。,2021/10/10,8,(5),加样品：加,2l,样品到,96,孔板的样品孔中，加,18l PBS(,好用,1%SDS,或裂解液，保 持与原样本中的一致,),，使总体积达到,20l,。,(6),加工作液：每孔加入,200l,步骤,2,所配制工作液。,(7)37,静置,20-30,分钟。可室温放置,2,小时。,(8),酶标仪测定,A562,，,540-595nm,之间的波长也可接受。,(9)EXCEL,绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。,附,2021/10/10,9,SDSPAGE 电泳,不连续的电泳缓冲体系。,SDS,蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质,分子量,的大小,。,2021/10/10,10,【SDS-PAGE,基本原理,】,SDS-PAGE,是在蛋白质样品中加入,SDS,和含有巯基乙醇的样品处理液，,SDS,是一种很强的,阴离子表面活性剂,，它可以,断开分子内和分子间的氢键,，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，,DTT,）,可以,断开二硫键破坏蛋白质的四级结构,。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,复合物。,蛋白质分子结合,SDS,阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所,带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于,亚基,的,相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关,2021/10/10,11,SDS,：,阴离子去污剂 变性剂,氨基酸侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,胶束。,蛋白质,-SDS,胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。,与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,2021/10/10,12,2021/10/10,13,蛋白质,-SDS,胶束的特点：,（,1,）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（,2,）平均,1g,蛋白质结合,1.4g SDS,（,3,）短轴对不同的蛋白质亚基,-SDS,胶束基本上是相同的,（,4,）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,2021/10/10,14,SDS-PAGE,凝胶的有效分离范围,2021/10/10,15,SDS,PAGE,电泳详细过程,（,1,）清洗玻璃板：,一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干,（,2,）灌胶与上样,1,、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要 使两玻璃对齐，以免漏胶。）,2,、根据蛋白大小配制一定浓度的分离胶，加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用,1ml,枪吸取,5ml,胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）,3,、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等,3min,使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。,2021/10/10,16,灌制分离胶 隔绝空气,ddH,2,O,0.1%SDS:8%,4,、按前面方法配,5,的浓缩胶,加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。将剩余空 间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以 免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收 缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经 常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。,5,、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向 外。）,6,、测完蛋白含量后，计算含,50g,蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样 品至,PCR,管中，加入,5SDS,上样缓冲液至终浓度为,1,。（,5SDS,上样缓冲液事先跟,巯基乙醇按,1ml,加,50ul,配好,。）上样前要将样 品于沸水中煮,5min,使蛋白变性,2021/10/10,18,灌制积层胶 插入梳子,7,、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液枪的枪头插 至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品溢出），没加一个样品要换一次枪头,（,3,）电泳 电泳时间一般,1.5h,，电压为 浓缩胶,80V,较好，分离胶,120V,。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止 电泳，进行转膜。,2021/10/10,20,Staking gel,Separating gel,转膜,（,1,）转一张膜需准备,6,张,5x9cm,的滤纸和,1,张,4x8cm,的,PVDF,膜。切 滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的膜 置于甲醇中浸,15,秒才可使用。,（,2,）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。,（,3,）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。,2021/10/10,22,（,4,）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖,3,张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作 在转移液中进行，要不断的擀去气泡。,2021/10/10,23,（,5,）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 恒流,300mA,转,2h,（,6,）转完后将膜用,1,丽春红染液染,5min,（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染 上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。,(,此步可以省略,),2021/10/10,24,2021/10/10,25,免疫反应,（,1,）将膜用,TBST,从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇 动封闭,1h,。,（,2,）将一抗用,TBST,稀释至适当浓度（在,1.5ml,离心管中）。剪一大小合适的杂交袋，取出膜，在滤纸上沾几下（,PVDF,膜需保持湿的状态），放入杂交袋中，加入一抗后，用封口机封闭在袋内，赶尽气泡，,4,过夜（指,12,小时）。或者室温摇床,1.5h.,取出滤膜用,TBST,漂洗,3,次，每次,10min,（室温，平缓摇动）。,（,3,）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育,1.5h,后，用,TBST,在室温 下脱色摇床上洗三次，每次,10min,；,2021/10/10,26,化学发光，显影，定影,（1）将 A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混 合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X光片夹中,2021/10/10,27,（,2,）在暗室中，将,1,显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出,X,光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大,1cm,）；打开,X-,光片夹，把,X,光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上,X-,光片夹，开始计时；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为,1min,或,5min,，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开,X-,光片夹，取出,X-,光片，迅速浸入显影液中 显影，,待出现明显条带后,，即刻终止显影。显影时间一般为,1,2min,（,20,25,），温度过低时（低于,16,）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把,X,光片浸入定影液中，定影时间一般为,5,10min,，,以胶片透明为止,；用自来水冲 去残留的定影液后，室温下晾干。,应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对 结果产生影响,。,全程不要用镊子去夹。,2021/10/10,28,凝胶图象分析,将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统对目的条带进行光密度定量。计算出相对表达量，然后作条形图。,2021/10/10,29,常见的一些问题与分析,1.,暗处观察膜，明明发现只有一条荧光带，为何我显影出来的条带却很多，形成了拖尾现象,？,答：主要是将胶片放到膜上后，还在拖动它，取出胶片的时候，要小心，尽量不要拖动胶片，可以将整个压片盒倒转过来打开。,2.,为何每次洗出来的条带都是很粗，每个样品之间的间隔很小呢？,答：这是一个常见的问题，有些人的做法是减少上样量，但最后还是出现了同样的问题。其实关键在于显影的技巧，当胶片在显影液中，刚出现条带时，叫要立刻拿上来了，然后条带会慢慢变粗，当达到想要的效果时，立刻放到定影液中定影。,2021/10/10,30,3.,胶带显影出来后，出现了几条条带，我怎么知道哪个是我们的目的条带，还有哪个样品是多少号怎么看？,答：显影完后，晾干，拿去跟膜进行对照，根据,mark,的大小标出相应条带的大小，这里关键在于，压片的时候，放胶片一定要按正确的方式放，一般胶片半圆角的两边要跟压片盒的左上角的两边紧挨着对齐。用梳子去跟膜和胶片匹对就可以找出每个加样孔的位置了。,4.,为什么我转膜后，没有看到膜上有,marker?,答：很有可能是你转膜的时，方向搞错了，黑胶白膜，夹子黑的一面要跟电泳槽黑的一面对齐，白的一面跟电泳槽红的一面对齐。,2021/10/10,31,