免疫细胞功能检测技术.ppt

免疫细胞功能检测技术1.一 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 2.淋巴细胞T T细胞（负责细胞免疫功能）B B细胞（执行体液免疫功能）NKNK细胞（非特异性免疫作用）3.一、T细胞功能的检测T T细胞增殖试验T T细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试验体内试验4.（一）T T淋巴细胞增殖试验1.1.原理：淋巴细胞DNADNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松5.未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小(直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1 14 4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无6.2.2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA -TPHA -T细胞 ConA-TConA-T细胞 PWM-TPWM-T、B B细胞 LPS -BLPS -B细胞特异性刺激物：异种抗原 同种组织抗原 7.3.3.检测方法 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-64-6天）母细胞化 同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（54h54h）DNADNA合成期 +3 3HTdRHTdR掺入 收集细胞 检测射线 测定细胞内的3H3HTdRTdR8.（1 1）形态学检查法9.方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。10.培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法11.优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。12.培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(3)MTT(3)MTT 比色法13.(二)T)T细胞分泌功能测定 体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T T细胞功能。14.（三）T T细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：靶细胞抗原T T细胞观察杀伤活力致敏CTLCTL靶细胞15.形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞2.2.方法意义：肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力 16.图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图17.靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放法18.(四)体内试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验 19.二、B细胞功能检测B B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测体内试验20.(一)B)B细胞增殖能力的试验抗IgMIgM细菌脂多糖SACSAC的SPASPAB B细胞增殖形态学3 3H HTdRTdR掺入法21.(二)溶血空斑试验1.1.原理：22.2.2.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验 23.3 3临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。24.(三)B B细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法ELISPOTELISPOT1.原理：25.2 2应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。26.(四)体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1 1周、2 2周、3 3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B B细胞的功能。27.染色计数离心取上清测LDHLDH或AKPAKP离心取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPMCPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法三、NK细胞活性测定靶细胞溶解常用靶细胞:K562细胞株28.二 吞噬细胞功能检测技术 按其形态大小分为两类：大吞噬细胞单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞中性粒细胞29.一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测30.(一)细胞运动功能趋化功能检测1.1.原理：31.2.2.方法：琼脂糖平板法 滤膜渗透法（Boyden小室法）32.(二)吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：33.2.2.溶菌法34.NBTNBT还原试验 原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）甲臜（紫黑色）3 3NBTNBT还原试验 35.中性粒细胞NBTNBT甲臜颗粒沉积于胞质中36.二、巨噬细胞功能检测(一)炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。37.(二)吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。38.(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法2 2非特异性酯酶的测定 常用-萘醋酸法39.(四)细胞毒作用测定 用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对125125I-UdRI-UdR标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性。40.(五)巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经3737预温的正常兔血浆和CaClCaCl2 2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即时记录血浆凝固时间。41.Thanks！42.