从细胞到分子打印版.pptx

n1818年英国妇产科医生布伦德尔成功地用输血救活了一名产后大出血的产妇，成为人类历史上成功输血的第一例。第1页/共95页第2页/共95页血型抗原能够激活免疫系统血型抗原能够激活免疫系统：1.母胎不相容母胎不相容2.输血不相容输血不相容3.自身溶血性贫血自身溶血性贫血第3页/共95页ABO血型的发现n1900年奥地利 Landsteinern1907年捷克人Janskyn1910年美国人MossnLandsteiner（18681943）获得1930年诺贝尔奖金nLandsteiner一生发现了ABO、MN、P、RH等许多血型。第4页/共95页 ABO血型的配合性血型的配合性是输血前试验的重要基础是输血前试验的重要基础第5页/共95页ABO血型系统的独特特点nA和B抗原的免疫源性强n血清中规律性存在抗-A和/或抗-B抗体n分泌型个体的血浆、唾液、组织细胞等处存在A、B、H血型物质第6页/共95页ABO血型主要抗原和抗体第7页/共95页ABO系统概述nA和B抗原是红细胞膜表面糖蛋白、糖脂分子中的糖类决定簇。n二者之间的区别在于免疫结构域末端单糖性质不同。nA抗原末端糖基是N-乙酰氨基半乳糖nB抗原末端糖基是D-半乳糖。第8页/共95页ABO系统概述nABO抗原不是ABO基因的直接产物nA和B基因编码不同的糖基转移酶，催化不同的糖基转移到H抗原末端半乳糖基上，形成相应的A或B抗原nO基因的产物是一种无活性的转移酶，不能转移任何糖基到H抗原上，因此O型个体的抗原就是H抗原。第9页/共95页ABO血型的遗传n复等位基因 共显性遗传n显性基因：A、Bn隐性基因：OnA型：AA AOnB型:BB BOnAB型:ABnO型:OO第10页/共95页根据孟德尔遗传定律 不同婚配类型子女可能的血型不同婚配类型子女可能的血型A*OA OB*OB OA*BA B AB OAB*OA BA*ABA B ABB*ABB A ABA*AA O第11页/共95页HAB物质生物合成 nABO基因 特异性糖基转移酶 ABO抗原n血型前身物质nL岩藻糖nN乙酰氨基半乳糖nD半乳糖 第12页/共95页ABO基因糖基转移酶结构模式图（1）第13页/共95页ABO基因糖基转移酶结构模式图（2）第14页/共95页ABO基因糖基转移酶结构模式图（3）第15页/共95页ABO抗原形成的基础：H位点nH基因：一个独立于ABO的基因FUT1n编码岩藻糖基转移酶n转移一个岩藻糖到血型前身物质上形成H抗原。n极少数个体缺乏H基因，红细胞上无H抗原，既使编码A和B的糖基转移酶基因是正常的，也不能产生A或B抗原。第16页/共95页第17页/共95页ABO物质的生物合成第18页/共95页A、B、H血型物质n1930年Lehrs发现唾液中有A和B物质n1943年Wiener发现分泌型占80nAB物质的量具有较显著的个体差异n血清中的血型物质较弱n唾液中的血型物质较容易测到第19页/共95页nA型 A抗原，少量H抗原 血型物质：A，HnB型 B抗原，少量H抗原 血型物质：B，HnAB型 A，B抗原，很少的H抗原 血型物质：A，B，HnO型 H抗原 血型物质：HH抗原强弱：OA2 B A2B A1 A1BH 抗原在人群中抗原在人群中 呈呈 减减 低低 趋趋 势势第20页/共95页ABH 抗原决定族n新生儿正定型：RBC与血型试剂反应弱。n 56周的胚胎RBC就可检测出来。n 出生时发育不完整。n 24岁红细胞发育完全。n新生儿通常不做反定型 1 新生儿免疫系统发育不成熟 2 血清抗体易受到母亲血清的干扰 第21页/共95页成人与新生儿抗原数量比较细胞 成人新生儿A1810 0001170 000250 000 370 000A2240 000 290 000140 000B610 000 830 000200 000320 000第22页/共95页抗-A、抗-B的特性nIgM、IgGnIgM抗体可被2Me（2巯基乙醇），DTT(2硫苏糖醇)破坏nIgA抗体经2Me处理血清学活性下降，但抗体不破坏。nIgG抗体分子量小，可以通过胎盘屏障 第23页/共95页交叉反应性抗-AB：1.来源于O型人血清2.联合抗体：抗-AB 3.不是抗-A和抗-B简单的混合，针对A和B抗原共同的决定簇。4.A细胞与O型血清吸收后放散液可以凝集B细胞，反之亦然。第24页/共95页与与ABO密切相关的密切相关的H及及Lewis血型系统血型系统nABH和Lewis抗原被称作组织血型抗原 nH（FUT1）抗原是ABO基因表达的基础；nABH的分泌型Se（FUT2）在决定Lewis表现型中发挥重要作用nLewis（FUT3）抗原是从血浆吸附到红细胞膜上的血型抗原。第25页/共95页Lewis血型系统n1946年，Mourant最早描述了抗Lewis（后来称之为抗-Lea）的两个例子，这些抗体凝集约25英国人的红细胞。nAndresen发现一种抗体，后来被称作抗Leb，该抗体针对的决定簇仅仅出现于成人Le（a）细胞。第26页/共95页Lewis抗原的产生抗原的产生nLewis基因（FUT3）编码一种岩藻糖基转移酶催化一个岩藻糖基到分泌物的H物质上，产生Leb抗原。n当个体属非分泌型（sese）分泌物中没有H物质时，则催化一个岩藻糖残基到H前体物质上，产生Lea抗原。第27页/共95页Lewis系统当这些结构被从血浆吸附到红细胞膜上时：1.多数H分泌型红细胞表现Le（a-b）2.H非分泌型则表现为Le（ab）3.约6的白人和25的黑人在Lewis位点是沉默因纯合子，他们不产生Lewis酶，其红细胞为Le（ab），其分泌物中缺乏Lewis物质。4.在亚洲，表现型Le（ab）很常见，这是由于一个弱的分泌型等位基因Sew所致。第28页/共95页Lewis抗原n虽然Lea和Leb不是由红细胞合成的，而是从血浆中获得的，他们被当作血型抗原是因为它们首先从红细胞上发现的。n术语Lea和Leb容易使人们产生误解，因为这两种抗原不是一对等位基因决定的，但仍沿用。第29页/共95页Lewis血型的基因型与表现型第30页/共95页ABO、H及Lewis血型系统nABO基因：9号染色体nFUT1（H）nFUT2（SE）nFUT3（Lewis）19号染色体第31页/共95页常见ABO亚型判断ABO亚型:n1 红细胞与抗-A/抗-A1/抗-B及抗-AB的凝集程度。n2 红细胞上H物质活性的强弱。n3 血清中是否存在抗-A1。n4 分泌型人的唾液中A、B和H物质。第32页/共95页 ABO亚型nA抗原中主要为A1和A2 n其它A亚型：A3、Ax、Aend、Am、Ay、和AelnB亚型种类比A亚型更少：B3、Bx、Bm和Bel等第33页/共95页第34页/共95页H抗原强弱：抗原强弱：OA2 B A2B A1 A1BO型A2BA2BA1A1B第35页/共95页各种弱A亚型的鉴别程序红细胞弱凝集混合外观(Mf）A60A3与抗-AA3 Ax10 红细胞呈十分弱的mf凝集Aend及/或抗-Aend只与抗-AB呈弱凝集AxAB反应不凝集容易吸附放散抗-AAm能吸附分泌型唾液中有一定量的A物质及放散不容易吸附放散抗-AAy抗-A分泌型唾液含少量的A物质Am Ay 吸附放散抗-AAelAel分泌型唾液只含H物质无A物质第36页/共95页A2n与人源性抗A试剂的反应强度为4,与抗H+/2+n可能有不规则抗A1存在 (sometimes)n1-8%A2和22-35%的A2B存在抗 A1n血型物质 A Hn举例 抗A 抗B Ac Bc Oc 4+4+-第37页/共95页A1和和A2决定簇的区别决定簇的区别是仅存在量的差异还是抗原决定簇结是仅存在量的差异还是抗原决定簇结构不同？构不同？n用A2细胞重复吸收来源于B型个体的抗-A血清可以移去所有抗体，表明二者之间仅是量的差别。nA2和A2B个体常常产生抗-A1，说明A2细胞上缺乏A1细胞上的一种决定簇。第38页/共95页血型前体物质：nType1 Gal13GlcNAc 1R（血清）nType2 Gal14GlcNAc 1R（红细胞）nType3 Gal13GalNAc1R（红细胞）nType4 Gal13GalNAc 1R（红细胞）nType5 Gal13Gal 1R（人工合成）nType6 Gal14Glc 1R第39页/共95页2型H与3型H的区别第40页/共95页A1和A2同样存在质的区别nA1细胞出现重复的3型A抗原结构，但A2细胞却没有。n抗-A1是3型或4型A特异性的，或者抗-A1可以优先与3型或4型A反应。第41页/共95页n只有A1转移酶能够转化3型H加一个N乙酰氨基半乳糖基成为3型An因此A2细胞上可以检测到3型H而不是3型A抗原。n双花扁豆植物血凝素检测N乙酰氨基半乳糖胺，当过量的浓度下，它可以凝集A2细胞，因此将它用作A亚型分型试剂更多是依赖A1和A2表现型数量上的差异。第42页/共95页A3n最早由Friedenreich在1936年描述n与抗-A和抗-AB共同孵育时：“混合视野外观”（mixed field agglutination）。即：小的凝集块周围是大量未凝集的细胞。n与抗-A反应强度低于A2。n与抗-AB反应呈混合视野，但并不增强。n偶有抗-A1(occasionally)n血型物质 A HnA3不像是A2和O细胞的嵌合体。第43页/共95页Aend（Afinn，Abantu）nAend最早由Weiner 等于1959年描述n类似于A3细胞：它们与一些抗-A和抗-AB表现很弱的混合视野外观。nAend分泌型的唾液中只有H物质，但是无A物质n抗-A1出现在部分Aend个体的血清中n10细胞凝集（Mf）第44页/共95页AmnAm细胞不能被抗-A和抗-AB凝集，或者仅能发生很弱的凝集。Am细胞可以吸附放散抗-A。nAm分泌型的唾液中包含正常含量的A和H物质，Am血清中通常无抗-A1。nAm作为ABO位点上一个稀有的等位基因遗传nAm在法国献血者的频率是150 000中有1例。（A型人中占0.0015%），中国台湾的数据是400 000万人中1例。第45页/共95页Amn抗原性较弱 与抗-A反应:-/w+n与抗-H反应：增强n无抗-A1产生，与抗-AB反应不增强n血型物质:A H第46页/共95页AxnAx表现型最初由Fischer和Hahn于1935年报道，它的主要血清学特点是：n红细胞与多数来源于B型血清的抗A不发生反应，但是可以被大多数来源于O型个体的抗-AB凝集，没有混合视野表现。n血清中含有抗-A1，后者有时候可以凝集A1和A2细胞。n除了H物质，Ax分泌型个体唾液中可以捡出痕量的A物质。第47页/共95页Axn抗A:-/w+n抗H:增强n血清中常有抗-A1(Frequently),比A2 A3的几率都高。n抗-AB：反应比与抗-A明显增强n血型物质 H，痕量A第48页/共95页AxnAx表现型具有很高的遗传异质性：n许多家系资料表明Ax以ABO位点上一种稀有的等位基因的方式遗传。n在一些家庭中遗传背景不清楚n在两项独立的研究中，法国Ax的频率为1/77000(A型人中的0.003%)和1/44000 第49页/共95页AintnLandsteiner和Levine：有些A型个体的红细胞既不能定义为A1也不能定义为A2。nAint在黑人中较白人更为常见。nAint是作为ABO位点上的一个等位基因遗传的。n它的H抗原强度象A2一样强，甚至更强。n与抗-A1反应较弱 2+n与抗-A及抗-H反应较强 4+/3+第50页/共95页Aeln在通常的条件下，Ael细胞与抗-A和抗-AB不发生凝集，虽然它们可以结合这些抗体，结合的抗体可以通过吸收放散技术检测到。nAel分泌型唾液中无A物质，仅有H物质，血清中常含有抗-A1，也可以含有能够凝集A2细胞的抗体。第51页/共95页Ael n在Ael血清和红细胞膜上不能检出A转移酶。n在法国150000例献血者中，没有检测到Ael表现型，在中国台湾400000人中检出5例Ael个体。nAel以ABO位点上的一种稀有的等位基因遗传的。第52页/共95页AwnML Olsson等n对其它弱A亚型的ABO基因的外显子、剪切部位和启动子进行序列测定。n表现型不太容易被划分到任何现存的分类的异常基因被称作Aw（15）。第53页/共95页Subgroups of APheno-typeRed cellstestedWith anti-seraSerum tested withKnown red cellsSalivaof secretorsAnti-A-B-AB-A1-HA1A2BO A1V_VV_V_A and HAint+_V+_V_A and HA2+_V_+Some-times.+_V_A and HA3+mf_+mf_+Occa-sionally.+_V_A and HAm-/w+_-/w+_V_V_A and HAx-/W+_+/+_VFre-quently +_V_H第54页/共95页B亚型n弱的B变异型是相对较少的，可能是由于在许多群体中B基因的频率要相对低得多。n弱B亚型的分类，Salmon指出B亚型最好的分类应参照A变异型：B3、Bx、Bm和Bel，另外加上那些不符合其它4种类型的Bw。第55页/共95页B3n1972年 Wiener和Cioffi首先报道一例ABH非分泌型B3。n它被作为最稀少的一种B亚型 n这种表现型以与抗B和抗AB呈现混合视野反应为特点n血清中缺乏抗Bn唾液中含有正常含量的B抗原nB3通常是由于ABO位点上的稀有等位基因所致。第56页/共95页Bxn一种异质性的血型n典型的Bx红细胞与抗B和抗AB呈弱凝集。n血清中含有弱的抗BnBx分泌型唾液中含有一些B物质，后者常常仅能通过Bx细胞与抗B的凝集抑制试验才能检测到nBx是ABO位点上的一种稀有的等位基因。第57页/共95页BmnBm细胞不能被抗B或抗AB凝集nB抗原仅能通过敏感的技术比如吸收放散抗B才能检测到。nBm分泌型唾液中B物质的含量接近正常BnBm个体的血清中不含有抗B。n通常Bm是作为ABO位点上一个变异的基因来遗传的，但是有几个例外报道。第58页/共95页BelnBel红细胞与抗-B和抗-AB不发生凝集反应，但是它们的确可以结合抗-B，抗体可以通过放散技术被检测到。nBel分泌型唾液中不出现B物质，血清中可能存在抗B抗体。nBel作为ABO位点上的稀有基因而遗传，第59页/共95页BwnOlsson等确认了7种新的等位基因，它们与正常B基因相比有1个核苷酸改变，导致一个氨基酸的取代（见表2.19Bw2到8），所有这些等位基因与B的弱表达相关，但是没有做进一步分类。第60页/共95页分泌型与非分泌型n1930年Lehrs发现唾液中有A和B物质n1943年Wiener发现分泌型占80n血型物质的量有显著个体差异n血清中的血型物质较弱n唾液中的血型物质较容易测到第61页/共95页分泌型：n产生可溶性HAB抗原的能力由分泌型基因座SE（FUT2）决定，该位点由Se、se两个等位基因决定。nSeSe或Sese个体表现为HAB分泌型 80nSese基因控制唾液中H物质的分泌，与红细胞上的H抗原表现型无关nLewis血型：Le（a-b+）/Le（a-b-）第62页/共95页非分泌型：n隐性基因纯合子sese在人群中占20，产生非分泌型n唾液中缺乏HAB血型物质 nLewis血型：Le（a+b-）/Le（a-b-）第63页/共95页孟买型与类孟买型n孟买型（Oh）和类孟买血型(Amh/Bmh/ABmh/Omh)是人群中两种非常罕见的稀有血型 第64页/共95页孟买型：n孟买型：H（FUT1）基因的产物为a（1，2）岩藻糖转移酶，但缺少H时，即hh时不能形成H抗原物质，尽管ABO基因存在，A/B抗原将不能形成。n红细胞缺乏H物质、A、B物质。n血清中有很强的抗-H，血清与所有O型人的红细胞反应都很强。n孟买型细胞与荆豆盐水提取液（抗-H）不发生反应。第65页/共95页第66页/共95页类孟买型（过去观点）n带有正常的H基因和A基因，但因其调节H基因作用的一对基因是zz纯合，故使其H的作用部分地受到抑制，因而只能产生少量的H抗原，少量的H抗原在A基因的作用下全部转化为A抗原。但红细胞上的A抗原是很弱的。n红细胞上缺少H物质，有少量A抗原。血清中有抗B，抗HI抗体。n唾液中含正常A、H物质，控制HAB物质分泌的调节基因SeSe/Sese，因而能分泌正常的A、H物质。第67页/共95页孟买型与类孟买型n孟买型属H缺陷的非分泌型，其个体红细胞和分泌液中均检测不到ABO抗原。nhh/sesenLe(a+b-)或Le（a-b-）n类孟买血型是H缺陷的分泌型，其特点是红细胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中却可以找到ABH血型物质。nhh/Sese；hh/SeSen Le(a-b+)或Le(a-b-)第68页/共95页H基因的缺失1孟买型hhsese血清和红细胞膜上均缺少H物质抗-A抗-B强抗-H(OhOhAOhBOhAB)第69页/共95页H基因的缺失2类孟买型hhSe红细胞膜上均缺少H物质血清中有1型H(A/B)物质抗-A强/弱抗-B强/弱抗-H弱少少量量吸吸附附(OmhBmhAmhABmh)第70页/共95页H基因的缺失3类孟买型hhSew红细胞膜上缺少H物质血清中有少量1型H(A/B)物质抗-A强/弱抗-B强/弱抗-H较强痕痕量量吸吸附附(OmhBmhAmhABmh)第71页/共95页H基因的减弱弱H型HmSe红细胞膜上有少量H血清H(A/B)物质含量正常抗-A强/无抗-B强/无抗-H无(OHmBHmAHmABHm)第72页/共95页H缺陷表现型总结第73页/共95页从血清学到分子生物学从血清学到分子生物学1900年年 2008年年1990年年1985年年第74页/共95页ABO血型系统遗传学基础nABO基因 9q34.19q34.2nA基因：(1,3)N-乙酰氨基半乳糖转移酶nB基因：D半乳糖转移酶nO基因：无有效的基因产物第75页/共95页ABO基因n7个外显子，跨越基因组DNA 18kb n外显子17，28bp 691bp不等n编码顺序：exon 6 和 exon 7第76页/共95页ABO基因的核苷酸差异n在A1基因的基础上核苷酸突变糖基转移酶改变影响催化活性抗原改变第77页/共95页ABO系统A1等位基因cDNA全长序列第78页/共95页ABO基因在cDNA和氨基酸上的差异A1 allele(1)A1 allele(2)nt.467(CT)=aa156(proleu)B allele nt.291(AG)；nt.526(CG)=aa176(ArgGly)；nt657(CT)；nt.703(GA)=aa235(glySer)；nt.796(CA)=aa266(leuMet)；nt.803(GC)=aa268(GlyAla)；nt.930(GA)。O allele(1)nt.261(Gdel)=framshiftO allele(2)nt.261(Gdel)=framshift,nt297(AG),nt646(TA),nt681(G A),nt771(CT),nt829(GA)第79页/共95页第80页/共95页ABO基因亚型的分子基础A2allelent.467(CT)=aa156(ProLeu)nt.1059-1061(3Cs2Cs)=frameshiftA3allelent.871(GA)=aa291(AspAsn)Axallelent.646(TA)aa216(AspAsn)Oallele(3)nt.297(AG)nt.526(CG)=aa176(ArgGly),nt.802(GA)=aa268(GlyArg)B3allelent.297(AG),nt526(CG)=aa176(ArgGly)nt.657(CT),nt.703(GA)=aa235(GlySer)nt.796(cA)=aa266(LeuMet)nt.803(GC)=aa268(GlyAla)nt.930(GA),nt.1054(CT)=aa353(ArgTrp)CisABnt.467(CT)=aa156(ProLeu),nt.803(GC)=aa.268(GlyAla)第81页/共95页常见A亚型的分子基础第82页/共95页常见B亚型的分子基础第83页/共95页ABO基因等位基因举例第84页/共95页H位点隐性基因在人群中的多态性第85页/共95页ABO血型系统基因分型第86页/共95页1.聚合酶链反应polymerase chain reaction,PCRn聚合酶链反应是DNA分型的基础，在含有模板DNA 的反应液中加入四种脱氧核糖核苷，耐热的TaqDNA聚合酶，经变性、复性和延伸三个不同温度时相的变化，大约2530个循环后，DNA得到大量扩增。反应在热循环仪上自动进行，简便易行。序列特异的PCR可直接用于分型，或将PCR产物作进一步的分析。第87页/共95页2序列特异性引物的PCR PCR-sequence specific primer，PCR-SSPn此技术采用序列特异性引物(SSP)。SSP的3端具有独一无二的序列，在退火时只能与某特定等位基因结合，因此能够特异性地扩增ABO基因，然后通过凝胶电泳检测PCR产物。根据是否得到PCR产物，以及产物的片段大小来判断ABO基因型。第88页/共95页3PCRRFLP（PCR-restriction fragment length polymorphism）n如果ABO的SNP序列改变涉及到限制性内切酶的识别位点，不同基因型个体的DNA被酶切后将得到长度不一的片段，这种由限制性内切酶酶切片断大小揭示的多态性，被称为限制性片段长度多态性(RFLP)。第89页/共95页3PCRRFLP（PCR-restriction fragment length polymorphism）n限制性内切酶只能对特定的核苷酸序列具有识别和切割的作用。如：HpaII识别 5ccgg 3片断。nPCRRFLP需在内切酶消化后，由电泳鉴定限制片断大小，若因突变失去某个限制性位点，电泳格局将发生改变。第90页/共95页4DNA克隆和DNA序列测定 (DNA Cloning and Sequence analysis)n由于多数个体在ABO位点的基因型呈杂合状态，而O基因在nt261处存在单碱基缺失，即O基因与A或B基因相比具有移码突变，因此许多研究对象在nt261后的序列为杂合状态。n研究ABO位点的基因时可以从mRNA入手，测定cDNA序列或者分别对其ABO基因的不同外显子的高保真扩增产物进行克隆测序。第91页/共95页ABO基因分型及核苷酸序列分析n聚合酶链反应nPCR-RFLPnDNA序列测定第92页/共95页血清学方法与血清学方法与DNA技术相互补充技术相互补充n一个一个CisAB核心家系核心家系A2Bx(CisAB/O)O(OO)A2Bx(CisAB/O)A2Bx(CisAB/O)O(OO)l家系来源：上海某医院孕妇家系来源：上海某医院孕妇n血清学：血清学：A2Bxn基因分型：基因分型：A*102/On序列测定：序列测定：nnt.467(CT)=aa156(ProLeu),nnt.803 (GC)=aa.268(GlyAla）n结论：结论：CisAB*01/O第93页/共95页n 抗抗-A 抗抗-B 抗抗-AB Ac Bc Oc A2cI单克隆单克隆 4 4 4w II单克隆单克隆 4 4 4 人血清人血清 1 4 4 与抗与抗H反应：反应：Pc：4w Oc：4 Bc：A2c：2w血清学疑为血清学疑为 AwB（血清中包含抗血清中包含抗-A）初步基因分型：初步基因分型：BO（PCRRFLP）PCR产物克隆测序：产物克隆测序：B（A）700/O一例罕见的一例罕见的B（A）血型）血型第94页/共95页CisAB与B（A）血型分子基础总结第95页/共95页