诊断分子生物学基本技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,诊断分子生物学基本技术,诊断分子生物学基本技术,基础知识,实验基础,诊断技术,临床应用,amp,r,半乳糖苷酶,N,端编码序列,变性与复性,（,denaturation and renaturation,）,变性 在某些理化因素作用下，,DNA,分子互补碱基对之间的氢键断裂，使,DNA,双螺旋结构松散，变成单链，即变性,增色效应 解链过程中，,DNA,的,A,260,增加，并与解链温度有一定的关系，这重关系称为,DNA,的增色效应,复性 变性,DNA,在适当的条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象即复性,退火 热变性的,DNA,经缓慢冷却即可复性，这一过程称为退火,解链温度,Tm,(melting temperature),解链曲线 在连续加热,DNA,过程中，以温度对,A260,的关系作图，所得曲线称为解链曲线,解链温度,Tm,在解链曲线中，紫外线吸收值达到达,50%,时的温度为,Tm,。在,Tm,时，核酸分子内,50%,的双链结构被打开,Tm,的影响因素,碱基组成 与,G+C,比例有关，,G+C,比例越高，,Tm,值越高,实验条件 例如三氯醋酸存在使,Tm,变小，氯化钠存在使,Tm,升高,限制性内切酶,（,restriction endonuclease),概念 识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,分类 三类 重组技术中常用一类,识别位点 回文结构即核苷酸结构呈二元旋转对称。,切口类型,平端,AG,CT-Alu -AG CT-,-TG,CA-TC GA-,粘端,-G,AATT C-EcoR1 -G AATTC-,-C TTAA,G-CTTAA G-,DNA,连结酶,（,DNA ligase,）,概念 连接,DNA,链,3-OH,末端和相邻,DNA,链的,5-P,末端，生成磷酸二酯键而形成完整的,DNA,链,种类,T4,噬菌体,DNA,连结酶,T4,噬菌体,RNA,连结酶,大肠,E.coliDNA,连结酶,作用,连接粘端,连接平端,目的基因,（,target gene,）,概念 需要研究的基因叫目的基因。,来源,基因文库 存在于转化菌内、由克隆载体所带的所有基因组,DNA,的集合。,化学合成法 用,DNA,合成仪利用化学原理合成该核苷酸序列。,cDNA,以,mRNA,为模板，利用反转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,。,聚合酶链反应 在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组,DNA,。,核酸的分离与纯化,（,the separation and purification of nucleic acid,）,细胞的溶解 因标本而异 用,SDS,、,Triton x-100,、超声破碎等,核酸的分离 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，将核酸分离,核酸的提取 冷乙醇或异丙醇沉淀核酸，离心回收核酸,去除杂质,70%,的乙醇洗涤沉淀，除去处多余的盐类,核酸探针的标记,（,the labelling probe of nucleic acid,）,概念 对已知碱基序列的单链核酸用示踪物进行标记得到核酸探针,示踪物分类,放射性核素类 优点：灵敏度高、特异性高、不影响酶促反应。缺点：污染环境、损害人体。,非放射性核素类 抗原抗体免疫标记物地高辛、亲和配体标记物生物素、荧光标记物,FITC,、电子密度标记物胶体金等。,标记方法 缺口平移法 随机引物法 末端标记法,缺口平移标记法,（,The label method of nick level moving,）,概念 由,Dnase,在,DNA,双链上切出随机切口，,DNA,聚合酶,沿缺口水解,5,端核苷酸和,3,端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记,DNA,链，合成与模板互补的新链。,优点 快速、简便、成本相对低、比活性较高、标记均一，大分子标记效果好（,1000bp,）。,缺点 单链,DNA,、,RNA,、,200bp,不能用该法标记。,随机引物标记法,(The label method of random primer),概念 采用,6,个核苷酸的随机引物 与模板,DNA,结合的原理将标记物掺入到新合成的,DNA,片段中去，完成探针标记反应。,随机引物 是指有各种可能排列组合顺序的混合物，能与任何核酸序列退火杂交，并为,DNA,聚合酶的反应起到引物作用。,方法 将双链,DNA,变性为单链，与随机引物退火杂交，在含有,dNTP,底物的示踪物的存在下，由,Klenow,片段催化下，从引物,3,末端开始按,5-3,方向合成新的互补,DNA,链，即标记的,DNA,探针。,优点 具有缺口平移标记法的优点，而且能标记任何长度的,DNA,及,RNA,。,末端标记法,（,The end-labelling method,）,概念 用核酸修饰酶对核酸片段的,5,或,3,末端进行部分标记，不对全长标记。,分类,Klenow,片段末端标记法 在有标记的,dNTP,存在下，,Klenow,片段可以填充双链,DNA,凹陷的,3,末端，获得标记的,DNA,探针。,T4DNA,聚合酶置换合成标记法 利用,T4DNA,聚合酶的,3-5,核酸外切酶和,5-3,核酸内切酶的作用，使,3,末端凹陷，加入有标记的,dNTP,，获得标记的,DNA,探针，用于末端为,3,突出粘端和平端的情况。,T4,多聚核苷酸激酶标记法,T4,多聚核苷酸激酶可将,-,32,PATP,的,-,32,P,转移到,DNA,游离的,5-OH,上，还可催化,-,32,P,与,5,末端的磷酸基团交换，因此无论是否,5,末端去磷酸均可用此法标记。,分子生物学实验诊断技术,核酸扩增技术,核酸杂交技术,多态性的分析,核酸序列分析,DNA,重组技术,杂交核酸技术,（,The hybridization technique of nucleic acid,）,核酸分子杂交 在,DNA,复性过程中，如果把不同的,DNA,单链分子或者把,DNA,与,RNA,放在一起，只要存在碱基配对关系，就可以在不同分子间形成杂化双链，这种分子现象为核酸分子杂交,核酸杂交技术 利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。,分类,斑点杂交 用于基因组,DNA,或,RNA,的分析,Southern blot,用于基因组,DNA,的分析,Northern blot,用于以知,mRNA,表达水平的分析,原位杂交 细胞内杂交，用于,DNA,或,RNA,的分析,Southern blot,（,1,）,概念 用转膜法进行,DNA,杂交分析,步骤,提取消化 提取基因组,DNA,并将其经限制性内切酶消化成片段,电泳 将,DNA,片段在琼脂糖凝胶中电泳变性使其成为单链,转膜 将硝酸纤维素（,nitrocellulose,NC,）膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中,DNA,片段转移到,NC,膜上,杂交 此杂交膜在杂交 液中与探针杂交,显影 用放射自显影显示出杂交分子带,Southern blot,（,2,）,重物,吸水纸,滤纸,凝胶,缓冲液,Northern blot,概念 用转膜法进行,RNA,杂交分析,步骤,提取 总,RNA,的提取,电泳 将,RNA,片段在琼脂糖凝胶中电泳变性，防止发夹状结构形成,转膜,NC,膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中,RNA,片段转移到,NC,膜上,杂交 此杂交膜在杂交 液中与,DNA,探针杂交,显影 用放射自显影显示出杂交分子带,注意 所用试剂均用,0.1%DEPC,水配制,注意 所有器具均需高温处理,斑点杂交,（,dot hybridization technique,）,概念 核酸与探针直接在,NC,膜上杂交的方法,步骤,提取 提取,DNA,或,RNA,样品,点样 样品点在,NC,膜上，烘烤使其固定在膜上,杂交 将膜、探针、杂交液封入杂交袋中，杂交,显影 用放射自显影显示出杂交分子点,原位杂交,（,in situ hybridization,）,概念 保持细胞形态，在细胞内进行核酸杂交,步骤,固定标本 涂片或组织切片置微波炉中照射，固定标本,杂交 将探针（常用生物素标记法）复盖在标本上，加入杂交液，杂交,显色 载玻片放入缓冲液中，加入底物，显色。,摄影 显微镜下观察结果，摄影,核酸杂交技术与基因诊断,（,The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis,）,限制性内切酶酶谱分析法,概念 利用限制性内切酶和特异性,DNA,探针来检测是否存在基因突变,原理 当待测,DNA,序列发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其片段的长度与数量在电泳迁移率上会随之改变。借此做出诊断,应用 检测基因突变的位点与数量,核酸杂交技术与基因诊断,（,The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis,）,DNA,限制性片段多态性分析（,RELP,）,概念,DNA,多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该片段会产生长度不同的片段，此片段为遗传标志，检测致病基因的带者,原理 在人类基因组中，平均约,200,对碱基可发生一对突变（称为中性突变），中性突变导致个体间的差异，叫,DNA,多态性。在某家族中，致病基因与特异多态性紧密连锁，此多态性为遗传标志,应用 遗传病的基因诊断,核酸杂交技术与基因诊断,（,The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis,）,等位基因特异寡核苷酸探针杂交,概念 根据已知遗传病基因突变的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探针（突变与正常），分别与受检者杂交，判断其为突变的纯合子、杂合子、新的突变类型或正常,原理 若受检者只与突变探针杂交，则为突变纯合子；若与两种探针杂交，则为突变杂合子；若与正常探针杂交，则不存在该突变基因；若与两者均不杂交，提示新的突变。,聚合酶链反应,PCR,（,polymerase chain reaction,，,PCR,）,概念 用于扩增位于两段已知序列之间的,DNA,区段,原理 以待扩增的,DNA,为模板，以一对与模板,5,和,3,末端互补的寡核苷酸片段为引屋，在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，合成新链，反复重复这一过程，可使目的,DNA,片段得到扩增。,基本步骤,变性,95,使模板,DNA,完全变性为单链,应退火 较,Tm,低,5,，使引物与模板,DNA,退火结合,延伸,72 DNA,聚合酶以,dNTP,为底物催化,DNA,的合成反应,PCR,与基因诊断,（,PCR and gene diagnosis,）,目的基因的克隆（模板为,cDNA,或基因组）,利用特异性引物获得已知的目的基因,利用简并引物获得同源性的基因片段,利用随机引物随机克隆基因,基因的体外突变,可以随机设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造,DNA,的微量分析,病原微生物的微量检测,突变基因的筛选,法医学的鉴定,DNA,序列分析,PCR,引物的设计,（,The design of PCR primer,）,长度 以扩增片段而定，一般,15,30,个碱基，引物越长，特异性越强,碱基,GC,含量以,45%,55%,为佳，,GC,应随机分布,Tm,值,Tm,值应底于延长温度,引物内和引物间不宜形成二级结构,特异性 特异性强，不扩增目的基因以外的,DNA,PCR,扩增条件的设计,（,The design of PCR extension condition,）,退火 一般,Tm,5,，与目的基因长度有关，目的基因短，退火温度 可底，时间可短。退火温度 太高，有时会得不扩增产物，退火温度 太低，容易得不到产物,延伸 与目的基因长度有关，一般认为,DNA,聚合酶的聚合速度,1000bp/min.,时间太短，会得不到产物，时间太长，会出现,Smear.,扩增次数 扩增次数太少，扩增量不足，扩增次数太多，提高灵敏度，易造成非特异性扩增，会出现,Smear.,引物 引物过多，易出现双引物聚合，电泳出现小于,100bp,的带，引物过少，扩增量少。,PCR,技术探讨,（,The investigation of PCR technique,）,Smear,现象,原因,酶量过多,变性时间过短,变性温度过低,dNTP,量过少,延伸时间过长,循环次数过多,模板量过多,建议,0.5U,递减,变性时间,5,秒递增,变性温度,0.5,递增,50um,递增,10,秒递减,2,个循环递减,模板量,20%,递减,PCR,技术探讨,（,The investigation of PCR technique,非特异性扩增,原因,引物浓度过高,引物设计不合理,酶量过多,循环次数过多,变性温度过低,延伸时间过短,模板量过多,建议,0.1um,递减,改变引物位置与长度,0.5U,递减,2,个循环递减,2,递增,10,秒递增,酶量,20%,递减,单链构象多态分析技术,（,The analysis technique of single strand conformational polymorphism,）,概念 由,DNA,单链构象所决定迁移率的电泳技术,原理 在中性聚丙烯凝胶电泳时，,DNA,单链的迁移率除与长短有关，更取决于,DNA,自身折叠形成的由碱基顺序决定的构象，甚至单个碱基不同，迁移率就不同，因此检测出含有基因突变的,DNA,或,RNA,片段,特点 这项技术具有简便、快速、敏感、和经济等特点，适用于大样本基因变异的筛查,SSCP,技术的应用,（,The application of SSCP technique,）,适用于大样本基因变异的筛查,用于癌基因和抗癌基因突变的检测,DNA,多态性分析,复等位基因的分析,遗传病的致病基因分析,基因制图,SSCP,技术流程,（,The procedure of SSCP technique,）,总,RNA,的提取,逆转录合成,cDNA,PCR,特异扩增目的基因,目的基因变性,在中性聚丙烯凝胶电泳,凝胶的处理,同位素标记的样品放射自显影,银染法或溴化乙锭（,EB,）染色,参考条件,（,reference condition,）,长度 目的基因小于,400bp,分离单链效果好，突变检出率高,温度 温度高，不利于分离突变,DNA,，最好采用恒温,4,或,20,26,交联度 低交联度、大孔径的聚丙烯酰胺凝胶有利于,DNA,互补链的分离，对,DNA,构型变化敏感，建议用,1,2%C,甘油 是核酸的弱变性剂，能部分打开,DNA,单链的折叠结构，但浓度过大，降低迁移率，建议用,5,10%,的甘油,电压 影响分析结果，建议先用低电压，后加大电压的条件，分辨率高，电泳时间短,SSCP,正常结果分析,（,The analysis of SSCP normal result,）,位置,DNA,单链在电泳中的位置无法预先确定，应设立未变性样品对照,条带数 由于单链构象的多样性，中间状态的存在，可以出现多条单链,突变条带 不一定在两条单链都表现出，有时可见于一条单链上,假阴性 用该法不能证明无突变发生，若无突变发生可以改变电泳条件,假阳性 筛选出泳动变位，不能完全排除假阳性,核酸序列分析,(The sequence analysis of nucleic acid),DNA,末断合成终止法,原理 在待测,DNA,的,3,末端人工合成引物，在,DNA,聚合酶,的作用下，复制链延长，在,ddNTP(2,3,双脱氧核糖核苷三磷酸,),存在下，复制延长随机受阻，形成分子量大小不等的片段。电泳分离，自显影，读分析碱基片段,步骤,标记 将单链模板,DNA,分成,4,份，每一管加入,32,PdATP,、,dNTP,、引物和酶，每管还加入,4,种,ddNTP,中的一种，进行反应,电泳 聚丙烯酰胺凝胶高压（,1600V,）电泳，复制延长随机受阻，可形成一个核苷酸的差异的大小不等的片段,显影 电泳后干燥，对,X,光片进行放射自显影,图谱 自下往上读，得到,5-3,的碱基序列，其互补链是待测的,DNA,的,3-5,碱基序列,核酸序列分析,(The sequence analysis of nucleic acid),复制模板,基因工程,M13,是单链噬菌体，转染宿主菌复制为双链增殖，又以单链透出菌体。把待测,DNA,重组插入双链,M13,复制型,DNA,中，经培养扩增，可分离得到单链,M13DNA,，即复制模板,cDNA,提取样品总,RNA,，逆转录为,DNA,，特异扩增目的基因，纯化，即复制模板,基因工程,（,gene engineering,）,概述 基因工程又称重组体,DNA,技术，是指在体外将不同来源的,DNA,分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作,主要步骤,目的基因的获取,载体的选择与构建,复制子的形成,转化,筛选复制子,表达外源基因,复制子,（,replicon,）,概念 即重组,DNA,，在体外将各种来源的遗传物质与载体,DNA,结合成具有自我复制能力的,DNA,分子,构建方式,粘性末端连接,平端连接,同聚物加尾连接,同聚物加尾连接,（,The ligation of adding-tail polymer,）,概念 利用同聚物序列，如多聚,A,与多聚,T,之间的退火作用完成连接。,步骤,粘性末端 在末端转移酶的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列，制造粘性末端,连接 在连接酶作用下进行粘性末端连接,转化,（,transformation,）,概念 把有复制能力，在细胞外无复制活性的复制子装入细胞，使其复制、扩增,步骤,感受态菌 增加细胞膜的通透性，便于复制子进入,转化 将感受态菌和复制子共同加热,（,42,）、,冰浴，使感受态菌热胀冷缩，把复制子导入菌体,转化菌培养 在培养基中扩大培养,筛选,（,screening,）,概念 确定含有复制子的细菌的过程,方法,抗药性标志 含有抗药性标志的载体转化菌能在含该抗生素的培养板上生存，与非转化菌分开,标志补救,a,互补又名蓝白筛选，根据,B-,半乳糖苷酶有,a,和,B,两个片段，只有宿主细胞和载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有,B-,半乳糖苷酶活性，使特异底物变为蓝色化合物,分子杂交 利用,32P,标记的探针与转移到硝酸纤维素膜上的转化子或目的基因的,DNA,片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因,目的基因的表达,（,The expression of target DNA,）,原核表达体系 如,E.coli,优点 简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺,缺点,缺乏转录后加工机制，不宜表达真核组,DNA,缺乏适当的翻译后加工机制,表达的蛋白质常为不溶性的包涵体，使其有活性还需进行复杂的复性处理,很难在,E.coli,表达体系表达大量可溶性蛋制品,目的基因的表达,（,The expression of target DNA,）,真核表达体系,优点,表达克隆的,cDNA,，也可表达真核基因组,DNA,表达的蛋白质可被适当修饰,表达的蛋白质会恰当的分布在细胞内一定区域并积累,缺点 操作技术难、费时、不经济,基因工程与医学,（,gene engineering and medicine,）,疾病基因的发现,发展生物制药,DNA,诊断,基因治疗,遗传病的预防,