药物分析-04第四章-药物定量分析与分析方法验证.ppt

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药物定量分析与分析方法验证,基本要求,一、掌握定量分析方法验证的效能指标。,二、熟悉定量分析样品的前处理方法。,三、了解定量分析样品的前处理方法的进展,及在药物分中的应用。,第四章 药物定量分析与分析方法验证,定量分析样品前处理方法,定量分析方法特点,药品质量标准分析方法验证,1,2,3,定量分析样品前处理方法,直接测定法含金属或,C-M,不牢固的有机金属,经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）,直接回流后测定,碱化回流后测定,硫酸水解后测定,经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）,碱性还原后测定法如泛影酸,利用药物中可,游离,的金属离子的氧化性测定含量,不经有机破坏,的分析方法,:,（一）直接测定法,例如：富马酸亚铁,溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,邻二氮菲与亚铁离子的配合物,显红色,，化学计量点后，,指示剂中的,Fe2+Fe3+,，,生成邻二氮菲铁，显,淡蓝色,指示终点。,2FeS0,4,+2Ce,（,S0,4,）,2,Fe,2,（,S0,4,）,3,+Ce,2,（,S0,4,）,3,（二）经水解后测定法,1.,碱水解后测定法,例如：三氯叔丁醇的含量测定,CCl,3,-C(CH,3,),2,-OH+4NaOH (CH,3,),2,CO+3NaCl+HCOONa+2H,2,O,NaCl +AgNO,3,AgCl +NaNO,3,AgNO,3,+NH,4,SCN AgSCN +NH,4,NO,3,2.,酸水解后测定法,例如：硬脂酸镁的含量测定,Mg(C,17,H,35,COO),2,+H,2,SO,4,MgSO,4,+2C,17,H,35,COOH,H,2,SO,4,+,2NaOH Na,2,SO,4,+2H,2,O,（三,）,经氧化还原后测定法,碱性还原后,测定 例如：泛影酸的含量测定,碱性条件下,Zn,还原，生成无机碘化物，用银量法测定,空心,A.,燃烧瓶,B.,铂丝网,C.D.,盛固体样品滤纸及其折叠法,E.F.G.,称取液体样品方法,7mm,50mm,30mm,尾部,7mm,13mm,20mm,25mm,35,6mm,16,6mm,滤纸,滤纸,A,G,F,E,D,C,B,氧瓶燃烧装置及称样方法,碘苯酯含量测定,取本品约,20mg,，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用,NaOH,T.S.2ml,与,H,2,O 10ml,为吸收液，待吸收完全后，加,溴醋酸,溶液,10 ml,，密塞，振摇放置数分钟，加,甲酸,约,1ml,，用水洗涤瓶口，并通入空气流约,35min,，以除去剩余的溴蒸气，加,KI,2g,，密塞，摇匀，用,Na,2,S,2,O,3,液,(,0.02mol/L,),滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每,1ml,的硫代硫酸钠液,(0.02mol/L),相当于,1.388mg,的,C,19,H,29,IO,2,（二）容量分析法的,计算,问题,1.,滴定度,（,T,）,的概念 每1,ml,溶液相当于被测物质的量(,mg),2.,滴定度的计算,aA,+,bB cC,+,dD,T,=,M,a,/b,m,3.,百分含量的计算,（1）直接滴定法,D%=,V,F,T/W,100%,F,=,实际标定的浓度/规定的浓度,（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）,D%=（,V,O,V,B,),F,T,/,W,100%,二、光谱分析法,（一）紫外-可见分光光度法（200,nm760nm),灵敏度高，可达10,-4,g/ml,10,-7,g/ml,1.特点 准确度高，,SRD（%）,为2%,5%,仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用,范围广。,2.朗伯-比耳定律,A=ECL E,1%,1,cm,=,10/M,3.,仪器校正和检定,波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07,nm,与576.96,nm,或用仪器中氘灯的486.02,nm,与656.10,nm,进行校正。,吸收度的检定：用,K,2,CrO,7,(60mg)+0.005mol/LH,2,SO,4,液至1000,ml,波长(,nm)235(,最小)257(最大)313(最小)350(最大),E,1%,1,cm,124.5 144.0 48.62 106.6,杂散光检查：试剂 浓度(,g/ml),测定波长 透光率(%),NaI 1.00 220nm 0.8,NaNO,2,5.00 340nm 0.8,4.对溶剂的要求:,220,240nm 241250nm 251300nm 300nm,以上,溶剂+吸收池,A,0.41 0.20 0.10 0.05,5.,测定方法：,要求供试品溶液的,A,应在0.3,0.7,标准曲线法,常用方法：,对照品比较法：,C,x,=(,A,x,/,A,r,),C,r,;,含量%=,C,x,D/W,100%,吸收系数法：含量%=(,E,1%,1,cm,),x,/(,E,1%,1,cm,),r,100%,计算分光光度法：,V,A,的三点校正法,（二）荧光分光光度法,灵敏度高,，可达10,-10,g/ml,10,-12,g/ml,在,低浓度,进行测定，防止,F,与,C,不成正比及自熄灭作用,1.,特点,用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减,灵敏度高，但,干扰因素多,。,制备荧光,衍生物,，可提高其灵敏度和选择性。,用样品,量少,，操作,简单,，方法,快速,，应用,范围,较,广,。,三、色谱分析法,按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱,方法分类,按分离方法分为：,PC；TLC；,柱色谱；,GC；HPLC。,（一）,HPLC,法,1.对,HPLC,仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。,色谱柱的理论板数：,n,=5.54(,t,R,/,W,h/2,),2,2.系统性试验 分离度：,R,=2（,t,R1,t,R2,)/(,W,1,+,W,2,);,要大于1.5,拖尾因子：,T,=,W,0.05h,/2,d,1,应在0.9,1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,3.测定方法,标准曲线法,外标法测定供试品中主成分含量,外标一点法,应用示例：,RP-HPLC,法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法,如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,3.测定方法,标准曲线法,外标法测定供试品中主成分含量,外标一点法,应用示例：,Ch.P(2000),收载的月桂卓酮、维生素,E,及其片剂、注,射剂、甲酚皂溶液等均采用,GC,法中的内标法加校正,因子测定含量。,药品质量标准分析方法验证,指导原则,药品质量标准分析方法验证,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验,指导原则,药物稳定性试验,指导原则,缓释、控释制剂,指导原则,微囊、微球与脂质体制剂,指导原则,细菌内毒素检查法应用,指导原则,(1),准确度,（,accuracy,）：,测量值与真实值接近的程度,表 示,:,回收率,测定方法：回收试验,加样回收试验,1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确,度的另一方法测定的结果进行比较。,2.制剂 要考察,辅料对回收率的影响,。采用在空白辅料中加入原,料对照品的方法作回收率试验，然后计算,RSD,。,具体做法：测定高、中、低三个浓度，,n=3,共9个数据来评价,回收率的,RSD,2%,；,用,UV,和,HPLC,法时，一般回,收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%,回收率%=（测定平均值 空白值）/加入量100%,要求制备,高,、,中,、,低,三浓度的样品，各测定,3次,。应,报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值,之差及其可信限。,(3),专属性,（,specificity,）,:,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。,鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。,含量测定和杂质测定,:,色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。,图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,鉴别反应,:,应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分,的样品均应呈现负反应。,(4),检测限,（,limit of detection,，,LOD,）：,药物能被检出的最低浓度,(g/ml),测 定,:,信噪比法,(S:N=3:1),(5),定量限,（,1imit of quantitation,，,LOQ,）：,药物能被定量测出的最低浓度,(g/ml),测 定,:,信噪比法,(S:N=10:1),药品质量标准分析方法验证,-,性能指标,(6),线性与范围,（,linearity and range,）：,待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围,线性关系：,Y=a+bx,（,r=0.9999),线性程度：相关系数,(7),耐用性,（,robustness,）,:,测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度,影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和,pH,，商品柱的品牌，柱温等,药品质量标准分析方法验证,-,性能指标,检验项目和验证内容：,项目内容,鉴别,杂质测定,含量测定及溶出量测定,定量,限度,准确度,精密度,重复性,中间精密度,专属性,检测限,定量限,线性,范围,耐用性,已有重现性验证，不需验证中间精密度,如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充,视具体情况予以验证,生物样品分析的基本步骤,1.,药物从蛋白结合或缀合物中释出,蛋白变性：如应用三氯醋酸、,HClO,4,、有机溶剂,(,乙醇、丙酮、乙腈,),使蛋白沉淀,盐酸水解,酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素,(,一种细菌性蛋白分解酶，可在,pH 7.011.0,使肽键降解,),定量分析方法的验证,-,生物样品分析,（一）特异性,内源性物质不得干扰原药、代谢物,（二）标准曲线,r0.9900,，至少,5,个浓度，不许外延,（三）精密度和准确度,RSD15,、,20,相对回收率,85,115,（,80,120,）,（四）最低定量限,LOQ,35,倍,t,1/2,，或,1/10,1/20,倍,C,max,（五）样品稳定性,室温、冻融、冰冻长期,（六）提取回收率（绝对回收率）,一般低于,100,，须稳定,（七）质控样品,已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度,定量分析方法的验证,-,生物样品分析,样品,固相净化,及,反相高效液相色谱法,测定血浆中茶碱,伍朝筼等 药学学报,1989,24(10):769773,血浆样品 净化后空白血浆 净化前空白血浆,Column Zorbax C,18,5m 2.5cm,4.6mm,254nm,Precolumn YWG-ODS 9-11m 5,4.6mm,Mobile Phase:,甲醇,-,醋酸钠,(0.05mol/L pH3.0)50,50,12 8 4 0min,茶碱,咖啡因,12 8 4 0min,12 8 4 0min,50 100 150 200,25,20,15,10,5,茶碱,(g/ml),(min),五例病人血浆茶碱浓度测定,6.4,12.8,19.225.6 32,3,2.4,1.8,1.2,0.6,0,茶碱,(g/ml),标准曲线,Y,=9.566,10,-2,X,+6.153,10,-3,r,=0.9995,练习与思考,A,型题,1 药品的鉴别是证明,A,未知药物的真伪,B,已知药物的真伪,C,已知药物的疗效,D,药物的纯度,E,药物的稳定性,2相对标准差表示的应是,A,准确度,B,回收率,C,精密度,D,纯净度,E,限度,3用移液管量取的25,ml,溶液，应记成,A25ml B25.0ml C25.00ml,D25.000ml E251ml,4,以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和,应为,A0.79 B0.788 C0.787,D0.7876 E0.8,5表示两变量指标,A,与,C,之间线性相关程度常用,A,相关规律,B,比例常数,C,相关常数,D,相关系数,E,精密度,6减小偶然误差的方法是,A,做空白试验,B,做对照实验,C,做回收试验,D,增加平行测定次数,E,选用多种测定方法,B,型题,14,A1.23 B1.22 C2.54 D2.53 E2.51,11.2252,22.5351,32.5348,42.5068,A,C,D,E,58,A,空白试验,B,对照试验,C,回收试验,D,鉴别试验,E,检测试验,5以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验,6在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验,7用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验,8取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色,A,C,D,B,X,型题,1药物分析方法的效能指标有,A,检测限,B,耐用性,C,准确度,D,专属性,E,代表性,2对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有,A,耐用性,B,专属性,C,检测限,D,准确度,E,线性与范围,3用碘量法测定维生素,C,原料药时，要求碘量法应具备,A,专属性,B,定量限,C,精密度,D,粗放度,E,线性4系统误差来源于,A,分析方法,B,所用试剂,C,操作者,D,所用仪器,E,工作环境,5消除系统误差的方法为,A,校正所用的仪器,B,作对照实验,C,做空白试验,D,做预试验,E,做回收试验,6以下所列仪器哪些使用前需进行校正,A,滴定管,B,量瓶,C,量杯,D,移液管,E,碘量瓶,7中国药典（20,1,0年版）在正文部分的检查项下应包括,A,药物的真伪,B,有效性,C,均一性,D,纯度要求,E,安全性,8进行药品检验时，要从大量样品中取出少量样品应考虑取样的,A,多样性,B,真实性,C,代表性,D,科学性,E,可靠性,9用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为,A11 B21 C31 D41 E5110,检验报告应有以下内容,A,供试品名称,B,外观性状,C,检验结果、结论,D,送检人盖章,E,报告的日期,