高中生物专题五DNA和蛋白质技术选修1课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,5 DNA,和蛋白质技术,考纲要求：,1,、蛋白质的提取和分离,2,、,PCR,技术的基本操作和应用,课题,1 DNA,的粗提取与鉴定,（一）提取,DNA,的方法,DNA,提取的原理,一、基础知识,DNA,在,NaCL,溶液中的溶解度曲线,（,1,）,DNA,在不同浓度,NaCL,中的,溶,解度,不同，,0.14,mol/L,最小，,2,mol/L,的,NaCl,溶解,DNA,。加水,稀释降至,0.14,mol,L,时析出。,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受性,某些,蛋白质,溶于酒精，,DNA,析出,蛋白酶：,高 温：,洗涤剂：,DNA,不溶于,酒精,溶液,水解,蛋白质,多数蛋白质不能忍受,60,80,，,DNA,在,80,以上才会变性,瓦解,细胞膜,，对,DNA,无影响。,（二）,DNA,鉴定的原理,沸水浴,条件下，,DNA,遇,二苯胺,被染成,蓝,色,二、实验设计,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,选取,DNA,含量较高,的生物材料,注意安全，环境保护，不用珍稀濒危生物,动物细胞,蒸馏水,植物细胞,洗涤剂,食盐,所用溶液,目的,细胞吸水胀破,溶解细胞膜,溶解,DNA,（都要搅拌）,提取的,DNA,少,，看不到,丝状物,，鉴定,无,蓝色,植物材料研磨不充分，结果会怎样？,滤液中可能含有哪些成分？,核蛋白、多糖,和,RNA,等杂质,（三）除去滤液中的杂质,、方案一为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除,杂质？,高盐溶液,溶解,DNA,除,高盐不溶,的杂质,除,溶于低盐,的杂质,低盐溶液,析出,DNA,、方案二与方案三的原理有什么不同？,方案三：用,DNA,和蛋白质对,高温,耐受性不同，,蛋白质变性，与,DNA,分离。,（四）,DNA,的析出与鉴定,析出,加与滤液,等体积的冷,酒精,(,体积分数,95,),，静置,2,3min,，出现,白色丝状物,。用玻璃棒,沿一个方向,搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸干水分。,将处理后的溶液过滤,方案二：,蛋白酶,分解杂质蛋白,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片断,体外迅速扩增DNA片段的技术,1,、什么是多聚酶链式反应（,PCR,）？,2,、,PCR,技术有何意义？,3,、,PCR,技术有哪些应用？,解决样品中,DNA,含量太低,而难以分析研究的问题,遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆、,DNA,序列测定等。,课题背景,一、基础知识,（一）,PCR,原理,条件,组分,作用,模板,原料,酶,能量,DNA两条单链,四种脱氧核苷酸,解旋酶,DNA聚合酶,ATP,一小段DNA或RNA,提供复制模板,合成子链的原料,打开DNA双螺旋,催化合成DNA子链,为解旋和合成子链供能,使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,1,、,DNA,分子复制需要哪些基本条件？有何作用？,引物,2,、,DNA,复制为什么需要引物？,DNA,聚合酶不能够从头开始合成,DNA,，而只能从,3,端延伸,DNA,链。,A,A,A,T,T,T,G,G,G,G,C,C,C,C,5,端：,3,端：,5,端,3,端,反向平行,DNA,的羟基（,OH,）末端,磷酸基团的末端,当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从,开始延伸,DNA,链，,DNA,的合成方向总是从,向,延伸。,引物的3端,子链的5端,3端,引物,母链的,3,端,缓慢冷却复性（,55,）,加热变性（,80,100,）,3,、双链的解开是,DNA,复制的前提，在体外如何打开,DNA,的双螺旋结构,?,利用,DNA,的热变性原理，通过控制温度来实现。,PCR,仪,4,、,PCR,技术中如何解决高温使酶失活的问题？,用耐高温的,TaqDNA,聚合酶。,5,、,PCR,反应需要哪些条件？,缓冲溶液、,DNA,模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的,TaqDNA,聚合酶,，通过控制,温度,使,DNA,复制在体外反复进行。（,PCR,仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器）,（二）,PCR,的反应过程,1,、,PCR,的每次循环可以分为哪几步？,变性,：,95,DNA,解旋,复性,：温度下降到,55,，引物与,DNA,单链结合,延伸,：,72,左右，合成,DNA,子链,5,3,G,G,T,C,3,5,A,G,C,C,5,3,A,G,引物,5,3,G,G,引物,变性,95,复性,55,延伸,72,2,、预变性有什么作用？,进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。,一般要经历三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物作为模板参与反应，且引物,延伸而成的,DNA,单链会与引物,结合，进行,DNA,的延伸。这样，,DNA,聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的,DNA,序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,二、实验操作：,用,3,个,恒温水浴锅,，温度分别为,94,、,55,和,72,，按要求，在,3,个水浴锅中来回转移,PCR,反应的微量离心管即可。,1,、微量离心管,薄壁塑料管,2,、微量移液器,3,、如果没有,PCR,仪，如何怎样来控制温度？,（反应场所）,添加药品的工具,三、操作提示：,1,、避免,外源,DNA,污染,：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等,高压灭菌。,2,、缓冲液和酶分装成小份，,20,低温,保存。使用,前，取出放在冰块上缓慢融化。,3,、每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。,所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手,指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。混匀,后离心处理，使反应液集中在离心管底部。,（一）理论上,DNA,扩增数目的计算,四、结果分析与评价：,2,n,a x 2,n,（二）实验中,DNA,含量的测定,1,、原理：,DNA,在,260,nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与,DNA,的含量,有关。可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果。,1,、一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为：,2,、,a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为：,2,、过程,稀释,：,PCR,反应液稀释,50,倍,对照调零,：,蒸馏水作,空白对照,，在波长,260nm,处，将,紫外分光光度计,的读数调节至零。,取,DNA,稀释液,100uL,至比色杯中，测定,260nm,处的光吸收值,测定：,计算,DNA,含量（,g,/ml,）,50 x(260nm,的读数）,x,稀释倍数,50,：在标准厚度为,1cm,的比色杯中，,OD,260,为,1,相当于,50,g,/ml,的双链,DNA.,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,PCR,原理,DNA,的复制需要酶、原料、引物、模板,DNA,的变性、复性和延伸受温度影响,PCR,过程,变性,复性,延伸,操作步骤,配制,PCR,反应体系,移入离心管,放入,PCR,仪,设置循环程序,DNA,扩增,测定含量,稀释,调零,测定并读数,计算,根据需要扩增的目标,DNA,的碱基序列来设计的。,引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验,练习：如果要使用,PCR,扩增一段已知,DNA,序列，你打算,如何设计引物？,课题,3,血红蛋白的提取和分离,根据,分子形状、大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识,（一）凝胶色谱法,2,、凝胶：,大多数是由,多糖,（如,葡聚糖,或,琼脂糖,）构成的微小的,多孔球体,，内部有许多,贯穿的通道,。,也称,分配色谱法,，是根据,相对分子质量的大小,分离蛋白质。,1,、概念：,3,、原理：,相对分子量较,小,的蛋白质易进入凝胶内部的通道，路程,长,，移动速度,慢,；,相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,相对分子量较,大,的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在外移动，路程,短,，移动速度,快,。,4,、凝胶色谱法分离蛋白质的原理,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,1,、概念：,一定范围内，能抵制外界,酸,或,碱,对溶液,PH,的影响，维持,PH,值,基本不变,的混合溶液。,2,、缓冲溶液的配制：,1,2,种缓冲剂,溶于水中配制,模拟生物体内的过程，保持,体外溶液的,PH,与体内,PH,基本一致,，防止蛋白质,失去活性。,3,、意义：,1,、概念：,带电粒子,在,电场,作用下发生,迁移,的过程,（三）电泳,（二）缓冲溶液,2,、原理,电泳利用待分离样品中各种分子,带电性质的差异,以及,分子大小,、,形状不同,，使带电分子,产生不同的迁移速,度,，从而实现样品中各种分子的分离。,3,、常用方法：,聚丙烯酰胺凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳。,许多生物大分子，如,多肽、核酸,等有可解离的基团，,在,一定的,PH,下，这些基团会,带上正电或负电,。,在,电场,的作用下，这些带电分子会向着,与其所带电荷,相反,的电极移动。,红细胞：,血小板,血浆：,水分、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖,白细胞,血红蛋白（,90,）,血细胞,2,、血液,1,、用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因？,哺乳动物成熟红细胞无核无器，血红蛋白含量丰富,二、实验操作,四个亚铁血红素基团,特点：,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团,，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白有,血红素,呈红色。,两条,肽链、,两条,一肽链,组成：,3,、血红蛋白由哪些成分组成？有什么特点？,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,5,、蛋白质的提取和分离包括哪几步？,4,、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？,这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,红细胞中的血红蛋白是,有色蛋白,，分离时可观察颜色判断什么时候收集洗脱液。使分离过程非常直观，简化了实验操作。,（一）样品处理及粗分离,红细胞的洗涤,目的：,去除杂蛋白,过程：,结果：,上清液中无黄色，表明洗涤干净,血红蛋白的释放：,加蒸馏水、甲苯，磁力搅拌器搅拌,血样离心、,生理盐水洗涤红细胞、,离心、,重复洗涤三次,思考,分离血红蛋白溶液：,离心管内,离心,透析,过程：,原理：,血红蛋白溶液装入,透析袋,，透析袋放入磷酸缓冲液透析,目的：,除去样品中分子小的杂质,透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。,（粗分离）,吸出血浆、,思考,（二）凝胶色谱操作（纯化）：,2,、凝胶色谱柱的装填,装填完毕，立即连接,缓冲液洗脱瓶,，在,50cm,高的,操作压,下，用,磷酸缓冲液,充分,洗涤平衡,12,小时。使凝胶装填,紧密,。,1,、凝胶色谱柱的,制作,：,取凝胶浸泡于,蒸馏水,或,缓冲液,中充分,溶胀,后，配成,凝胶悬浮液,。,填入色谱柱内,3,、样品加入与洗脱,待,红色的蛋白质,接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每,5ml,收集一试管，连续收集,收集：,洗脱,：,调节缓冲液面,与凝胶面平齐,滴加透析样品,样品渗入凝胶床,加,磷酸缓冲液,到适当高度，连接,缓冲液洗脱瓶,，洗脱。,2,、如何检测血红蛋白的分离是否成功？,红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出,血红蛋白处在稳定的,pH,内，维持结构和功能。,1,、在整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是？,思考：,3,、你能描绘血红蛋白分离的完整过程吗？,（,1,）样品处理：,（,4,）纯度鉴定：,（,3,）纯化：,（,2,）粗分离：,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,凝胶色谱法除去分子量较大的杂质蛋白,透析除去分子量较小的杂质。,包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心；透析,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。,3,、血液样品离心后如果分层不明显，可能的原因是什么？,1,、加入什么可以防止血液凝固？,加入柠檬酸钠,思考：,4,、如果离心速度过高和时间过长，会有什么影响？,如果离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,2,、可以用蒸馏水代替生理盐水吗？,不可以。用蒸馏水使细胞提前吸水涨破，使血红蛋白和杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。,1,、加甲苯的目的是什么？,思考：,细胞膜的磷脂,易溶于甲苯，甲苯能,加速红细胞破裂并释放出血红蛋白,。,无色透明,有机溶剂（甲苯层）,暗红色,红细胞破碎物沉淀,红色透明液体,血红蛋白的水溶液层,白色薄层固体,脂溶性物质的沉淀层,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,透析过程动画演示,柱底部的制作：,尼龙网,100,目尼龙纱,1,、从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶,的装填要紧密、均匀？,在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,2,、装填凝胶柱时为什么不得有气泡存在？,50cm,搅乱洗脱次序，降低分离效果。,