分子生物学实验流程及相关.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学实验流程及相关试剂、仪器概述,GENE COMPANY LTD,分子生物学实验概述,生物样品（细胞、组织、细菌）,细胞调节,神经科学,分子诊断,DNA,分离,RNA,分离,质粒,DNA,噬菌体,DNA,基因组,DNA,总,RNA,mRNA,cDNA,重组,DNA,PCR,遗传鉴定,DNA,测序,DNA,标记,突变,基因表达,分子生物学实验概述（续）,基因表达,报告基因载体,基因转化,报告基因检测,真核转录,体外转录,翻译,蛋白,蛋白分析,蛋白分离,实验起始材料的选取和准备,常规材料,组织器官,原生质体,细胞,细菌,真菌,酵母,特殊材料,少量起始材料,特殊病变组织,亚细胞结构,实验起始材料的选取和准备,水稻卵细胞的分离,分离准备工作,材料的速冻,长期保存,人工气候箱、制冰机,超净工作台、显微操作系统,RNase-free,耗材、液氮罐,超低温冰箱,RNase,抑制剂,卵细胞,mRNA,的提取、纯化,Oligotex,系列试剂盒,细胞裂解,匀浆,去蛋白和细胞残渣,温浴并结合,洗脱,去盐和回收,旋涡混匀器,离心机,恒温水浴锅,离心机、旋涡混匀器,200,烘箱,DEPC,、,RNase-free DNase I,、,RNase-free,耗材,目标片段的克隆和分析,利用,SMART cDNA,文库构建试剂盒构建水稻卵细胞,cDNA,文库,目标基因的获得,通过噬菌体载体自切割或,T-Vector,、平末端载体克隆获得目标质粒,利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序,目标基因的克隆,利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原,-,抗体反应进行文库目标基因的筛选,利用,GSP,（基因特异引物）通过,PCR,扩增出目标基因,通过,5,RACE,和,3,RACE,克隆已知部分序列的目标基因,利用,PCR,技术获得目标基因,利用,GSP,，以文库为模板通过,PCR,扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测,利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和,GSP,，通过,5,RACE,和,3,RACE,扩增出目标基因的,5,和,3,端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测,包含有目标基因的质粒的获得,对于通过筛库技术获得的目标基因,通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒,对于通过,PCR,技术获得的目标基因,通过回收纯化后利用,T,载体等克隆并转化细菌,铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个菌落,对于通过,PCR,技术获得的目标基因,PCR,或,RACE,电泳,凝胶成像系统,长波紫外观察箱,切胶,胶回收试剂盒,T,载体、平末端载体,转化细菌并铺板培养,筛选目标菌落,提取目标质粒,对于通过,PCR,技术获得的目标基因,PCR,或,RACE,琼脂水平电泳,凝胶成像系统、手提紫外灯,长波紫外观察箱,PCR,回收试剂盒,胶回收试剂盒,PCR,仪,电泳仪器,恒温水浴锅、离心机,Taq,酶、薄壁管、矿物油,琼脂糖,对于通过,PCR,技术获得的目标基因（续）,纯化产物,PCR,产物测序,T,载体、平末端载体连接,细菌转化、铺板培养,蓝白斑筛选、菌落原位杂交,质粒提取、酶切分析、测序,测序仪,低温冰箱,杂交箱、恒温摇床、低温冰箱,超净工作台、电转化仪,离心机、恒温水浴锅,感受态细胞、培养基、,抗生素,X-gal,、,IPTG,、,尼龙膜和探针,限制性内切酶,质粒提取、分析,常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒,DNA,质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒,DNA,质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切,电泳，用凝胶成像系统分析,测序,水稻各器官,Total RNA,的提取、纯化和分析,分离所需的水稻各器官组织，并利用,Qiagen,的,RNeasy,系列试剂盒提取总,RNA,：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总,RNA,在,RNase-free,的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总,RNA,的质量,利用特异性的探针，通过,Northern blotting,检测目标基因在各器官的表达情况,Southern blotting,和,Northern blotting,Southern blotting,基因组,DNA,完全消化,探针制备,琼脂水平电泳,比活性测定,印迹转膜,DNA,交联,限制性内切酶、恒温水浴锅,手提紫外灯、电泳仪器,真空转膜仪,紫外交联仪,同位素检测仪,探针制备试剂盒,尼龙膜,克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析,克隆化基因的表达,表达蛋白的纯化,功能分析,克隆化基因的表达,基因的克隆：利用高保真的,Taq,酶和合适的反应系统，通过,PCR,获得与目标基因完全一致的,DNA,片段（通过测序确证）,体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达,体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等,目标蛋白功能分析,抗体的制备：多抗、单抗,DNA-,蛋白质相互作用研究：,Gel-shift,实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等,蛋白质,-,蛋白质相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等,蛋白体内表达研究,Western blotting,：利用抗原,-,抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量,免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位,蛋白质芯片系统,基因转化实验和转基因结果分析,转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊抗生素,植株的转化：叶盘转化法、基因枪,植株的筛选：荧光检测、,GUS,染色、,PCR,法,基因功能分析：激光共聚焦显微镜、,FISH,等,谢 谢,