第2讲色谱分析法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,YANGTZE NORMAL UNIVERSITY,现代仪器分析,现代仪器分析,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二讲色谱分析,第,2,章 气相色谱分析法,（,Gas,Chromatography,GC,）,一、色谱法简介,色谱法也叫,层析法,，它是一种,高效能的物理分离技术,，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为,色谱分析法,。,色谱法的最早应用是在,1906,年俄国植物学家,茨维特,(Tswett),用于分离植物色素时采用，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。,第一节 概 述,色谱起源,加入石油醚分层,胡萝卜素,叶黄素,叶绿素,A,、,B,Chromatography,原理,:,基于物质在不同相之间具有不同的分配系数引起的分离,此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。,现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它,色谱法,。,在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为,固定相,；,自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为,流动相,；,装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为,色谱柱,。,1941,年，,Martin,和,Synge,提出了用气体代替流体做流动相的可能性，在他们发展了完整的气液色谱法之后，获得了,1952,年的诺贝尔化学奖。,1957,年，,Golay,开展了开管柱气相色谱。,1963,年，,Giddings,把高压泵和键合相固定相结合，出现了高效液相色谱。,随后，出现了色谱法和其他检测技术的联用，例如,GC-MS,、,GC-IR,等。,上个世纪八十年代，毛细管电泳出现，此后得到长足的发展，并不断出现新的模式，一直成为研究的热点。,二、色谱法的分类,色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。,（一）从两相的物理状态分类：,色谱法中，,流动相,可以是,气体,，也可以是,液体,，由此可分为气相色谱法（,GC,）和液相色谱法（,LC,）。固定相既可以是,固体,，也可以是涂在固体上的,液体,，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气,-,液色谱、气,-,固色谱、液,-,固色谱、液,-,液色谱。,流动相,还可以是,超临界流体,。,物质通常有三种状态：气态，液态和固态。,除了这三种常见的状态外物质还有另外的一些状态，如等离子状态、超临界状态等。,什么是超临界流体？,物质处于临界温度（,T,c,）和临界压力（,P,c,）以上状态时，向该状态气体加压，气体不会液化，只是密度增大，具有类似液态性质，同时还保留气体性能，这种状态的流体称为超临界流体（,Supercritical Fluid,简称,SCF,）。,高于临界温度和临界压力的状态称为超临界状态。处于超临界状态时，气液两相界面消失，性质非常接近，以至于无法分辨，故称之为超临界流体。,这种流体,(SCF),兼有气液两重性的特点，它既有与气体相当的高渗透能力和低的粘度，又兼有与液体相近的密度和对许多物质优良的溶解能力。,色谱法,液相色谱法,气相色谱法,气,-,液色谱法,气,-,固色谱法,液,-,固色谱法,液,-,液色谱法,超临界流体色谱法,分类情况如下,：,（二）按固定相的形式分类：,按固定相的状态可分为柱色谱和平板色谱：,柱色谱,：固定相装在色谱柱中；,平板色谱,：固定相呈平板状的色谱，它又可分,为薄层色谱和纸色谱。,薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃 板或塑料,板上制成薄层作固定相；,纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上的,水作固定相。,（三）按分离原理分类：,可分为：,吸附色谱法,：利用吸附剂（固定相 一般是固,体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分,离的方法；,分配色谱法,：利用不同组分在两相间的分配,系数的差别进行分离的方法。,离子交换色谱,：利用溶液中不同离子与离子,交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方,法。,空间排斥（阻）色谱法,：利用多孔性物质对,不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。,空间排斥（阻）色谱,Size Exclusion Chromatography,M.W.,t,R,空间排斥（阻）色谱,Size Exclusion Chromatography,M.W.,t,R,空间排斥（阻）色谱,Size Exclusion Chromatography,M.W.,t,R,空间排斥（阻）色谱,Size Exclusion Chromatography,M.W.,t,R,空间排斥（阻）色谱,Size Exclusion Chromatography,M.W.,t,R,三、气相色谱分离过程及有关术语,（一）气相色谱分离过程,（二）气相色谱的常用术语,（一）气相色谱分离过程,试样中各组分经色谱柱分离后，随气,体依次流入检测器，检测器将各组分浓度,变化转换成电信号，在记录仪上记录为检,测器响应随时间变化的微分曲线，即色谱,流出曲线，也称,色谱图,（见图,2-3,）。,（二）气相色谱的常用术语,色谱图,：若干物质的流出曲线，即在不同时间上的,浓度或者响应的大小。,1,、基线,（,Base-line,）,无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。,2,、色谱峰（,Peak of,Chromatogram,）,曲线上突起部分就是色谱峰。,色谱峰的对称性,高斯（,Gaussian,）曲线,不对称因子（,asymmetry,）,拖尾峰（,tailing peak,）,伸舌峰（,leading peak,或,fronting peak,）,高斯曲线：,在理想情况下,(,进样量很小，,浓度很低，在吸附或分配等温线的线性范围,内,),，色谱峰的形状可以近似地用高斯曲线描,述。图中,为标准偏差（拐点处的半峰宽），,h,为最大峰高，,w,b,为峰宽。,不对称因子：,在实际的色谱过程中，溶,质从色谱柱中流出时，很少符合高斯分布，,而是具有一定的不对称性。,我们可以定义一个不对称因子,As,来定量,地表示色谱峰的不对称程度，将,10,峰高处,前半峰的宽度设为,a,同高度处后半峰的宽度,设为,b,，将,b,与,a,的比值定义为不对称因子,As,，,即,拖尾峰：,当,As,大于,1,时，色谱峰的形状是前半,部分信号增加快，后半部分信号减少慢。引起,峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在吸附,作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。,伸舌峰：,当,As,小于,1,时，色谱峰是前半部分信号,增加慢，后半部分信号减小快。因为伸舌峰主,要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作,用位置，使一部分溶质超过了峰的中心，即产,生了超载，所以也称超载峰。,3,、色谱峰高（,the Height of Peak of,Chromatogram,）,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,h,4,、色谱峰区域宽度,（,Regional width of,Peak of,Chromatogram,）,色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重,要参数之一。,用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的,动力学因素，其宽度越窄越好,。,表示色谱峰区域宽度通常有,三种方法,。,.,标准偏差,（它是,0.607,倍峰高处色谱峰宽的一半）,.,半高峰宽,Y,（,Y,=2.354,）,.,色谱峰底宽（,色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离）,W,b,（,W,b,=,4,）,5,、保留值（,Retation Value,）是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，它反映了组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。,（,1,）保留时间（,Retation Time,）,t,R,指某组分通过色谱柱所需要的时间，即从进样到出现某组分色谱峰最大值的时间，单位为,min,或,s,。在一定的色谱体系和操作条件下，任何一种化合物都有一定的保留时间，这是色谱定性分析的依据。,（,2,）死时间（,Dead Time,）,t,M,不被固定相吸,附或溶解的气体（如空气、甲烷）从进样到,出现其色谱峰最大值所需要的时间，也是气,体流经色谱柱中空隙所需要的时间。,（,3,）调整保留时间（,Adjust Retation Time,）,t,R,扣除死时间之后的保留时间：,t,R,=,t,R,t,M,，,它反映了组分在色谱过程中，与固定相,相互作用所消耗的时间，是各组分产生差速,迁移的物理化学基础。,保留时间是色谱法定性的基本依据，,但,同一组分的保留时间常受到流动相流速的影,响。,因此色谱工作者有时也用保留体积来表,示保留值。,（,4,）保留体积,V,R,（,Retation Volume,）是,指从进样到出现某组分色谱峰最大值时所,通过的载气体积。,V,R,=t,R,F,0,F,0,为色谱柱出口的载气流量（,mL min,-1,）,（,5,）死体积,V,M,（,Dead Volume,）,指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩,留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以,及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略,不计时，,死体积可由死时间与色谱柱出口的载,气流速,F,0,（,mL min,-1,）计算,。,等于在,t,M,这段,时间内通过色谱柱的载气体积。,V,M,=t,M,F,0,（,仅适用于气相色谱,，不适用于液相色谱,。,）,（,6,）调整保留体积,V,R,（,Adjust,Retation,Volume,）指扣除死体积后的保留体积。,V,R,=V,R,-V,M,（,7,）相对保留值（,Relative Retation value,）,指在相同的操作条件下某组分,2,的调整保留,值与另一种组分,1,的调整保留值之比。,相对保留值仅与,柱温和固定相性质,有关，,而与柱径、柱长、载气流量等其它实验条件无,关，因此，它是,色谱定性分析的重要参数之一,。,相对保留值还可以用来表示色谱柱的选择,性。,r,2,1,值越大，两组分的,t,R,值相差越大，越,容易实现分离，当,r,2,1,=1,时，两组分色谱峰重,叠。,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作,为标准（,s,），然后再求其它峰（,i,）对这个,峰的相对保留值。此时可用符号,表示，即,=t,R,(i),/t,R,(s),式中,t,R,(i),为后出峰的调整保留时间，所以,总是大于,1,的。,相对保留值,往往可作为衡量固定相选择,性的指标，又称,选择因子,。,从色谱流出曲线可以获得许多重要信息：,1.,根据色谱峰的数目，可以判断试样中所,含有组分的最少个数。,2.,根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。,3.,根据色谱峰高或面积可以进行定量测定。,4.,根据色谱峰间距及其区域宽度，可对色谱柱,的分离效能进行评价。,5.,色谱峰间距,固定相或流动相选择是否合,适的依据。,问题,1,：不同组分在色谱柱中为什么呈现不同的运行速度？,第二节 气相色谱理论基础,因为固定相对不同组分有不同的吸附力，吸附力强的组分难以被流动相冲洗出色谱柱，故运行速度慢，运行时间长。反之，吸附力弱的组分则容易被流动相冲洗出色谱柱，故运行速度快，运行时间短。,吸附 脱附,同样的道理，若固定相呈液体状态，则不同组分呈现不同运行速度则是因为固定液对不同组分有不同的溶解能力，溶解性强的组分难以挥发至流动相中，故其在色谱柱中运行速度慢，运行时间长。反之，溶解性弱的组分则容易挥发至流动相中，故其在色谱柱中运行速度快，运行时间短。,溶解 挥发,问题,2,：吸附与脱附是怎么回事？,吸附作用是指各种气体、蒸气以及溶液里的溶质被吸着在固体或液体物质表面上的作用。具有吸附性的物质叫做吸附剂，被吸附的物质叫吸附质。吸附作用可分为物理吸附和化学吸附。,脱附作用正好与吸附作用相反，是指吸着在固体或液体物质表面上的物质在一定的作用下离开原表面的过程。,问题,3,：什么是溶解过程与挥发过程？,溶解过程是指气态或液态组分进入固定液的过程，而挥发过程则是指组分离开固定液回到气态或液态流动相的过程。,色谱分离原理及实例：,色谱柱内紧密均匀地涂着在惰性载体上的,液体固定相，流动相则连续不断流经其间，两,相充分接触，但不相溶解。,将混合样品一次注入色谱柱后，刚进柱,时，组分,A,和,B,是一条混合带。,由于样品分子与两相分子间的相互作,用，它们既可以进入固定相，又可以返回流,动相，这个过程就叫分配。,当样品进入流动相时，它就随流动相一,起沿柱床向前移动，当它们进入固定相时，,被滞留而不再向前移动。,与固定相作用越大的组分，越容易进入固定相，向前移动的速度就愈慢；与流动相作用力越大的组分，就越容易进入流动相，向前移动的速度愈快。这样经过一定的柱长后，由于反复多次（,10,3,10,6,次）的分配，即使原来性质（如沸点、溶解度、分子结构及极性等）差异微小的组分，也能达到很好的分离。,结果，与流动相作用力大的组分先从色谱柱中流出来，与固定相作用力大的组分则后流出，从而使得样品内各个组分得到分离。,A,B,C,D,载气,3,种组分同时进入色谱柱,3,种组分开始在色谱柱中分离,3,种组分在色谱柱中基本达到分离,3,种组分在色谱柱中完全达到分离,结论：色谱分离是基于样品中各组分在两相,间,平衡分配,的差异。可用,分配系数,或,分配比,来表征。,问题,4:,何谓分配系数？分配比？它在色谱分,离过程中有什么作用？,1,、分配系数,K,在一定的温度、压力下，组,分在,液相（固定相）,和,气相（流动相）,之间分,配达到平衡时的,浓度比,称为分配系数,K,，即：,(,物质在固定相和流动相之间发生的吸附、脱,附和溶解、挥发的过程叫,分配过程,。,),（,2-8,）,2,、,分配比,k,在一定的温度、压力下，组分在,两相之间分配达到平衡时的,质量比,称为分配比,k,，即：,它是衡量色谱柱对被组分保留能力的重要参数。,k,值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当,于柱的容量大，因此又称,分配容量,或,容量因子,。,（,2-9,）,式中,:,V,M,为柱中流动相的体积，近似等于死体,积。,Vs,为柱中固定相的体积,，,在各种不同的,类型的色谱中有不同的含义。,例如，,在分配色谱中，,Vs,表示固定液的体积；,在吸附色谱中，,Vs,表示吸附剂的表面容量；,在排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。,3.,分配系数,K,与,分配比,k,的,关系,由,2-9,式：,即,其中,称为相比,，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。,分配系数和分配比都与,组分及固定液,的,热力学性质,有关，并随,柱温、柱压,的变化而变化。分配系数与两相体积无关，而分配比随,固定液的量,的改变而改变。,（,2-10,）,4.,滞留因子,Rs,分配比,k,值可直接从色谱图测得：,设流动相在柱内的线速度为,u,（,=L/t,M,),，组,分在柱内线速度为,u,s,(=L/t,R,),，由于固定相对组,分有保留作用，所以,u,s,u,，此两速度之比称为,滞留因子,Rs,。,（,2-11,）,Rs,若用质量分数表示，则有,结合两式有：,（,2-12,）,经整理可得,（,2-15,）,（,2-16,）,可见，某组分的,k,可直接从色谱图中测得：,它等于该组分的,调整保留时间,与,死时间,的比值。,上式表明，,某组分的保留时间越长则,k,值越大，色谱柱对该组分的保留能力就越强,。,5.,分配系数,K,及分配比,k,与选择因子,的关系,对,1,、,2,两组分的选择因子，用下式表示：,=,t,R,(2),/,t,R,(1),=,k,（,2),/,k,（,1),=,K,（,2),/,K,（,1),对固定相的选择具有实际意义。,如果两组分的,K,或,k,值相等，则,=1,，两,个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。,两组分的,K,或,k,值相差越大，则分离得越好,。,因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离,的先决条件。,色谱分析的,目的,是将样品中,各组分彼此,分离,，组分要达到完全分离，两峰间的距离,必须足够远。,但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都,很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰,的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为,决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。,因此，,要从热力学和动力学两方面来研究色谱,行为。,下图是,A,、,B,两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。,浓度,沿柱移动距离,L,A,B,A,B,K,A,K,B,图中,K,A,K,B,，因此，,A,组分在移动过程中滞后。,随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的,浓度轮廓,（即区域宽度）也慢慢变宽。,显然，区域扩宽对分离是不利的，但不可避免。,若要使,A,、,B,组分完全分离，必须满足以下三点：,第一,，两组分的分配系数必须有差异；,第二,，区域扩宽的速率应小于区域分,离的速度；,第三,，在保证快速分离的前提下，提,供,足够长的色谱柱,。,第一、二点是完全分离的必要条件,。,作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。,塔板理论和速率理论,均以色谱过程中分配系数恒定为前提,，提出了相关的模型来解释和分析色谱过程，称为线性色谱理论。,色谱法研究的核心,选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。,一、塔板理论（,Plate Theory,）,塔板理论的基本内容是什么？,塔板理论假定：,（,1,）塔板之间不连续；,（,2,）塔板之间无分子扩散；,（,3,）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平,衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度,H,；,（,4,）某组分在所有塔板上的分配系数相同；,（,5,）流动相以不连续方式加入，即以一个一个,的塔板体积加入。,（一）、色谱分离过程：,塔板理论,是把色谱柱假想为一个精馏塔，,塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液,相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流,动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经,过多次分配平衡后，,分配系数小的组分，先离开,精馏塔,（色谱柱），分配系数大的组分后离开精,馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼,此得到分离。,（理论塔板数）,（理论塔板高度）,H,A,L,（,2-19,）,理论塔板数还可以根据色谱图按下面,经验公式计算：,式中,t,R,与,Y,1/2,(W,b,),应采用同一单位（时间或距离）,由上式可知，组分的,保留时间越长,，,峰宽度越小,，则,理论塔板数,n,越多,，色谱,柱效能越高,。,（,2-18,）,在实际的应用中，由上式计算出来的的,n,值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能。,因为采用,t,R,计算时，没有扣除死时间,t,M,，所以常用调整保留时间,t,R,代替,t,R,计算所得到的有效理论塔板数,n,eff,来衡量色谱柱效。,即：,（,2-20,）,（二）、塔板理论的特点和不足,1.,当色谱柱长度一定时，塔板数,n,越大（塔板高度,H,越小），被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,2.,不同物质在同一色谱柱上的,分配系数不同,，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，,应指明测定物质,。,3.,柱效不能表示被分离组分的实际分离效,果，当两组分的分配系数,K,相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,4.,塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的,载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,塔板理论是一种半经验性理论。,它用,热力学,的观点定量说明了溶质在色谱柱中的,行为，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价,柱效高低的参数。,但是，色谱过程不仅受,热力学,因素的影响，而且,还与分子的扩散、传质等,动力学,因素有关。,因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不,能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不,同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制,了它的应用。,二、速率理论,1956,年，荷兰学者范第姆特（,Van,Deemter,）,等在研究,气,-,液,色谱时，提出了色,谱过程,动力学理论,速率理论,。吸收了塔板,理论板高的概念，并把,色谱分配过程,与组分,在两相中的,扩散和传质过程,联系起来，导出,速率理论方程式，,较完善地解释了影响塔板,高度的各种因素,。同时适用于气相和液相色,谱。,式中的,u,为载气的,线速度,；,A,、,B,、,C,为,常数，分别代表,涡流扩散项系数、分子扩,散项系数和传质阻力项系数,。,Van Deemter,方程的数学简化式为,:,（,2-22,）,1.,涡流扩散项系数,A,组分随载气在流动过程中遇到填充物的,颗粒阻碍不断改变流动方向，使组分在气相,中形成紊乱的类似,“,涡流,”,的流动，因而引起,了色谱峰变宽。,涡流扩散示意图,上式表明,涡流扩散,引起的,峰形变宽,只与,填,充物平均颗粒直径,d,P,及,填充不规则因子,有,关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。,为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而,均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。,对于空心毛细管，不存在涡流扩散，,因此,A=0,2.,分子扩散项,B/,u,分子扩散亦称,纵向扩散,，是由色谱柱内,沿,轴向,存在,浓度梯度,，使组分分子随载气迁移时,自发地产生,由高浓度向低浓度,的扩散。,（,2-23,）,称为,弯曲因子,，它反映填充物对分子扩散,的,阻碍程度（,填充柱,1,，空心柱,=1,）,；,D,g,为组分在气相中的,扩散系数,（,cm,3,/s,），,与流动相及组分性质有关：,(a),相对分子质量,大的组分,D,g,小，,D,g,反比于流动相相对分子质量的平方根，,所以采用相对分子质量较大的流动相，可使,B,项降低；,(b),D,g,随,柱温,增高而增加，但反比于色谱柱的压力。,u,为载气的,线速度,，即,u,=L/t,M,，载气,的线速度越小，则组分在气体中停留的,时间越长，分子扩散项就越大，,因此加,大流动相速度可降低纵向扩散影响,。,3.,传质阻力项,C,u,传质阻力项系数,C,包括,气相传质系数,C,g,和,液相传,质阻力系数,C,l,，,即：,气相传质过程是,指试样组分从气相移动到固定相表面,的过程,。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交,换，即根据分配系数在两相间进行分配。有的来不及,进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面,又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能,瞬间达到分配平衡，从而引起滞后现象，使色谱峰变,宽,。,固定液,(Liquid stationary phase),担体,(Substrate),组分,(Component),C,u,l,d,p,d,f,对于填充柱：,K,为容量因子。,气相传质阻力,与填充物粒,度,d,P,的,平方成正比,，与组分在气相中的扩,散系数,D,g,成反比。,因此采用,粒度小,的填充,物和,相对分子质量小的气体,（如,H,2,）做载,气可减小,C,g,值，提高柱效能,。,（,2-24,）,液相传质阻力是,组分从气液两相界面,扩散至液相内部达到分配平衡后，又返回,两相界面的过程所受到的阻力,。,液相传质阻力系数,C,l,为：,适当的降低固定液的,液膜厚度,d,f,，增大组分在液相中的,扩散系数,D,l,，可减小液相传质阻力，提高柱效能。,（,2-25,）,提高柱温可增大,D,1,，,但会使,k,值减小；,为了保持适当的,C,1,值，,应控制适宜的柱温。,4.,载气流速,u,对理论塔板高度,H,的影响,根据式,H=A+B/,u,+C,u,，以不同流速下,测得的理论塔板高度,H,对流速,u,作图，得到,H-,u,曲线（,图,2-7,）。在曲线的最低点，理,论塔板高度最小（,H,min,），柱效能最高。,该点所对应的流速即为最佳流速（,u,opt,）。,u,opt,和,H,min,可由式（,2-22,）微分求得：,将上式（,2-34,）代入（,2-22,）得：,（,2-34,）,（,2-35,）,由式子（,2-22,）及,图,2-7,可见，当,u,值较小时，分子扩散系项,B/,u,成为影响理,论塔板高度,H,的,主要因素,，此时应采用相,对分子量较大的载气（,N,2,、,Ar,）以使组分,在气相中有较小的扩散系数；而当,u,值较大,时，传质阻力相,C,u,成为,H,的主要因素，宜,采用相对分子量较小的载气（,H,2,，,He,），,使组分在气相中有较大的扩散系数，以减,小气相传质阻力，提高柱效能。,综上所述，可以得到气,-,液色谱速率理论方程的具体表达式：,速率理论方程式对于指导我们进行色谱分离条件的选择具有重要意义。它比较全面的概括了,柱填充物颗粒度，填充均匀性，固定液液膜厚度，载气种类及流速,等对柱效能和色谱峰变宽的影响。,速率理论的要点,1,、被分离组分分子在色谱柱内运行的,多路,径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质,阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间,达到,等因素是造成色谱峰扩展柱效下降,的主要原因。,2,、通过选择适当的,固定相粒度,、,载气种,类,、,液膜厚度,及,载气流速,可提高柱效。,3,、速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了,流速,和,柱温,对柱效及分离的影响。,4,、,各种因素相互制约,，如,载气流速,增大，,分子扩散项,的影响减小，使柱效提高，但同时,传质阻力项,的影响增大，又使,柱效下降,；柱温升高，有利于,传质,，但又加剧了,分子扩散,的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,（一）分离度,单独的考虑,柱效能,或,选择性,不能真实,的反映组分在色谱柱中的分离情况。故需,要引入一个,综合性指标,分离度,R,作为色谱柱的总分离效能指标。,三、色谱分离基本方程,R,定义为相邻两组分色谱峰,保留值 之差,与,两组分色谱峰峰底宽度平均值,之比：,理论证明，若相邻两色谱峰,对称且满足正态分布,，当,R,10,时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。,一般取,k,为,1-10,最宜。,对于,GC,，通过提高温度，可选择合适的,k,值，以改进分离度。,而对于,LC,，只要改变流动相的组成，就能有效地控制,k,值。,4,）分离度与分析时间的关系,由上图,t,r,/Q,对,k,的曲线可见，,当,k,在,2-5,时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度。,5,）色谱分离基本方程式的应用,色谱分离基本方程式将柱效、选择因子、,分离度三者的关系联系起来。,知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。,例,1-1,有一根,lm,长的柱子，分离组分,1,和,2,得到如下的色谱图。图中横坐标,l,为记录笔走纸距离。,若欲得到,R=1.2,的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？,解：,组分,2,对组分,1,的相对保留值,r,2,，,1,（即,值）,求有效塔板数,n,eff,n,eff,16,（,0.8,）,2,1.1/(1.1-1),2,1239,若使,R=1.2,所需塔板数可计算,即,因此,欲使分离度达到,1.2,需有效塔板数为,2788,块,则所需柱长为,L=2788/12391m=2.25m,例,1-2,已知某色谱柱的理论塔板数为,3600,组分,A,和,B,在该柱上的保留时间为,27mm,和,30mm,求两峰的半峰宽和分离度,。,解,:,Y,1/2,=2.354W/4=W/1.7,w,1,=27/(3600/16),1/2,=1.8 mm,Y(1),1/2,1.8/1.7,1.06 mm,w,2,=30/(3600/16),1/2,=2.0 mm,Y(2),1/2,2.0/1.7,1.18 mm,R,2(30-27)/(1.8+2),6/3.8,1.6,例,1-3,已知一色谱柱在某温度下的速率方程的,A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度,u,和最小塔板高,H.,解,:,欲求,u,最佳,和,H,最小,要对速率方程微分,即,dH/du,d(A+B/u+Cu)/du,-B/u,2,+C,0,最佳线速,:u,最佳,(B/C),1/2,最小板高,:H,最小,A+2(BC),1/2,可得,u,最佳,(0.65/0.003),1/2,14.7cm/s,H,最小,0.08+2(0.650.003),1/2,0.16cm,例,1-4,已知物质,A,和,B,在一个,30.0cm,柱上的保留时间分别为,16.40,和,17.63,分钟，峰宽分别为,1.11,和,1.21min,不被保留组分通过该柱的时间为,1.30,分钟,.,计算,:(1),柱分辨本领,;(2),柱的平均塔板数目,;(3),塔板高度,;(4),达到,1.5,分离度所需的柱长度,;,解,:,(1)R=2(17.63-6.40)/(1.11+1.21)=1.06,(2)n,A,=16(16.40/1.11),2,=3493,n,B,=16(17.63/1.21),2,=3397,n,av,=(3493+3397)/2=3445=3.4410,3,(3)H=L/n=30.0/3445=8.70810,-3,cm,=8.7110,-3,cm,(4)n,2,=3445(1.5/1.06),2,=6.9010,3,n,1,/n,2,=(R,1,/R,2,),2,L=nH=6.9010,3,8.7110,-3,=60.1cm,例,1-5,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为,85,秒和,100,秒，要达到完全分离，即,R,=,1.5,。计算需要多少块,有效塔板,。若填充柱的塔板高度为,0.1,cm,，柱长是多少？,解：,r,2,，,1,=100/85=1.18,n,有效,=16,R,2,r,21,/(,r,21,-1),2,=161.5,2,(1.18/,0.18),2,=1547,（块）,L,有效,=,n,有效,H,有效,=15470.1=155 cm,即柱长为,1.55,米时，两组分可以得到,完全分离,。,第三节 色谱定性和定量分析,一、色谱的定性分析,色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。,由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此,保留值可作为一种定性指标,。,各种色谱定性方法都是基于保留值的。,但不同物质在同一色谱条件下，可能具,有相似或相同保留值，即,保留值并非专属的,。,因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定,性是困难的（双柱或多柱法）。,如果在了解样品的来源、性质、分析要,求的基础上，对样品组成作初步的判断，再,结合下列的方法可进行相关定性分析。,（,一）利用纯物质对照定性,在一定的色谱条件下，,一个未知物只有一个确定的保留时间,。,因此，将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间，与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。,若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。,注意,纯物质对照法进行定性分析，只适,用于组分性质已有所了解，组成比较简,单，且有纯物质的未知物。,（二）相对保留值法,相对保留值,is,是指组分,i,与基准物质,s,调整保留值的比值,is,=t,ri,/t,rS,=V,ri,/V,rs,它仅随固定液及柱温变化而变化；但与其它操作条件无关。,相对保留值测定方法,：,在某一固定相及柱温下，分别测出组,分,i,和基准物质,s,的调整保留值；再用已求,出的相对保留值与文献相应值比较即可定,性。,基准物质的选择：,通常选容易得到纯品的，而且与被分,析组分相近的物质作基准物质,。,如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲,苯、环己醇、环己酮等。,（三）加入已知物增加峰高法,当未知样品,中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。,首先作出未知样品,的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。,峰高增加的组分即可能为这种已知物。,（四）保留指数定性法,retention index,保留指数又称为柯瓦（,Kov,ts,）,指数,它表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。,它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。,保留指数也是一种相对保留值,:,把组分的保留行为换算成相当于正构烷,烃的保留行为，也就是用正构烷烃系列作为,标准，以两个保留时间紧邻待测组分的正构,烷烃来,标定,该组分，这个相对值称为保留指,数,，,并假定正构烷烃的保留指数为,n,100。,被测物的保留指数值可用内插法计算。,确定,i,在某固定液,X,上的,保留指数,I,i,X,：,先选取两个,正构烷烃作为基准物质，,其中一个的碳数为Z，另一个为Z+1,，它们的调整保留时间分别为,t,R(Z),和,t,R(Z+1),。,使被测物质,i,的调整保留时间,t,R(i),恰好位于两者之间，即,t,R(Z),t,R(i),t,R(Z+1),。,将含,i,和所选的两个,正构烷烃的混合物注入固定液,为,X的色谱柱，在一定温度条件下,，进行色谱分析，得以下,色谱图。,信号,t,R(Z),t,R(i),t,R(Z+1),t,进样,内插法求,I,i,X,示意图,据此，可用内插法求算保留指数,I,i,X,。,大量实验数据表明，化合物调整保留时间的对数值与其保留指数间的关系基本上是一条直线关系。,保留指数的物理意义,：,它是与被测物质具有相同调整保留时间,的假想的,正构烷烃的碳数乘以100。,保留指数仅与固定相的性质、柱温有,关，与其它实验条件无关。,其准确度和重现性都很好。,只要柱温与固定相相同，就可应用文献,值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。,(,五,),与其它仪器联用定性,这是最可靠的定性方法。早期应用填充柱分离组分，冷阱收集后测定红外光谱、质谱和核磁共振谱等，即所谓,“,离线,”,(off-line),联用的方法对组分定性。这种方式分离度不好，灵敏度不高，操作麻烦。目前常用,“,在线,”,(on-line),联用方式，用毛细管色谱柱与傅利叶红外仪联用,(GC-FTIR),或与质谱联用,(GC-MS),。这些联用仪器和技术已完全成熟,成为现代仪器分析的重要工具。,二、定量分析,定量分析的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。,色谱定量的依据是，当操作条件一致时，,被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比,。,即：,m,i,=f,i,A,i,式中,m,i,为被测组分,i,的质量；,A,i,为被测组分,i,的峰面积；,f,i,为被测组分,i,的校正因子。,可见，进行色谱定量分析时需要：,（,1,）,准确测量检测器的响应信号,峰面积或峰高；,（,2,）,准确求得比例常数,校正因子；,（,3,）,正确选择合适的定量计算方法。,将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。,（,一）峰面积测量方法,峰面积是色谱图提供的基本定量数据；,其测量的准确与否直接影响定量结果。,不同峰形的色谱峰采用不同的定量方法：,（,1,）对称形峰面积的测量,峰高乘以半峰宽法,对称峰的面积,A=1.065,h,Y,1/2,（,2,）不,对称形峰面积的测量,峰高乘平均峰宽法,对于不对称峰的测量如仍用峰高乘以半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法：,A=0.5,h,（,Y,0.15,+Y,0.85,）,式中,Y,0.15,和,Y,0.85,分别为峰高,0.15,倍 以及,0.85,倍处的峰宽。,（二）定量校正因子,色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。,但是峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。,即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。,因此，,混合物中某一组分的百分含量并不,等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所,占的百分率,。,这样，就不能直接利用峰面积计算物质的,含量。,为了使峰面积能真实反映出物质的质量，,就要对峰面积进行校正，即在定量计算是引入,校正因子。,校正因子分为：,绝对校正因子和相对校正因子。,1,、绝对校正因子定义