细菌的毒力岛.ppt

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mapping),接合介导的DNA插入取代标记法(conjugation-mediated diretced tagged internal DNA replacement),粘粒克隆测序(cosmid cloning combined with sample sequence),毒力岛探查法(island probing),毒力岛与致病性的关系,1,2,3,毒力岛基因,受体菌的状态,被感染宿主的特点,毒力岛的获得是否就足以使细菌成为致病菌呢?,取决于三个方面的因素,是否携带毒力基因,内部其他基因成分的调控,受染宿主本身的免疫状态,毒力基因的其致病性,1.,尿路致病型大肠埃希氏菌毒力岛,(1)大小为58 170kb。,(2)能编码,-溶血素I,、,P相关菌毛,(P-related fimbrial，Prf)和,I型细胞坏死因子,。,(3)两侧具有,同向重复序列和或插入序列,。,(4)各毒力岛都位于染色体的tRNA位点内；,(5)G+Cmol%均比宿主菌染色体,低,。,(6)含有一些,潜在的可移动成分,1.,尿路致病型大肠埃希氏菌毒力岛,1.,尿路致病型大肠埃希氏菌毒力岛,Pai I:,(70kb),selC,intA,hlyI,DR,DR,Pai II:,(90kb),leuX,intP4,hlyII,DR,DR,prf,Pai,Pai,的,tRNA,编码,硒代半胱氨酸,tRNA的,seIC基因,位于紧邻,sel C-tRNA基因,3端,为一静息（cryptic）的整合酶基因intA,Pai,Pai,的,tRNA,编码,亮氨酸,tRNA的,leuX基因,即leuX-tRNA基因是,Pai的插入位点,，紧邻该基因的为一静息的,P4噬菌体整合酶基,2、,EPEC,和,EHEC,的毒力岛,AE,损伤,EPEC,和,EHEC,在致病过程中，都能产生特征性的组织病理学变化,粘附和脱落损伤,(,attaching and effacing lesion)，,简称为,AE,损伤,AE,损伤特征：,病菌附在宿主粘膜上皮细胞微绒毛,信号转导系统,膜蛋白,Hp90,的酪氨酸磷酸化,肌醇磷酸和,Ca2+,浓度,病菌粘附在细胞壁,形成致密的纤维样肌动蛋白基座,上皮细胞排列紊乱,严重腹泻,决定,AE,损伤的基因,位于,EPEC,和,EHEC,染色体上一个大约35,kb,的区域，称为,LEE,(locus of enterocyte effacement),毒力岛.,特点：,插入在,selC-tRNA,处,G+C mol%,为39%,其功能为,编码,III,型分泌系统,和,介导,AE,损伤,。,LEE,毒力岛两侧没有发现,重复序列(,DR),和,插入序列(,IS),，,这可能是,LEE,较其它毒力岛更稳定的原因。,LEE,毒力岛,A：,紧密粘附素(,intimin),：,由,eae,基因编码的一种外膜蛋白，作为粘附因子，介导细菌紧密粘附到宿主细胞上，并激活宿主细胞的信号转导系统,B：Esps,：,由,esps,基因编码，目前较清楚的有四种蛋白。,C：Escs,：,由,escs,基因编码，至少包括9种蛋白，共同组成,III,型分泌系统，将,Esps,等毒力因子分泌至细胞外或直接注入宿主细胞以启动信号转导。,D：CesD,和,CesT,：,分别由,cesD,和,cesT,基因编码，为分子伴侣蛋白(,chaperone),二、耶尔森菌属的毒力岛,耶尔森菌属至少有11个菌种，其中,鼠疫耶尔森菌,伪结核耶尔森菌,小肠结肠炎耶尔森菌 与致病关系较密切。,强毒力岛：,耶尔森菌强毒株具有的小鼠毒性特征取决于一个35,kb,的毒力岛，该岛不存在于弱毒株和无毒株，故称为,强毒力岛,(,high pathogenicity island,HPI)。,二、耶尔森菌属的毒力岛,耶尔森菌属毒力岛及其特点,注：斜线前为毒力岛,G+C mol%，,斜线后为该毒力岛所在细菌染色体,G+C mol%。,二、耶尔森菌属的毒力岛,1、小肠结肠炎耶氏菌的强毒力岛,(HPI),小肠结肠炎耶氏菌共有,5个生物型,，其中,仅1,B,生物型为强毒株,，而,Yen HPI,就仅存在于1,B,生物型，而不存在于非1,B,生物型。,结构特点,：,小肠结肠炎耶氏菌,Ye8081,菌株中，,Yen HPI,全长43,393,bp，,大致可分为,功能核心区,和,可变区,两个区域。,1、小肠结肠炎耶氏菌的HPI,结构特点：,(1)功能核心区,：,为,GC,富含区，,编码产物主要为参与耶尔森杆菌素的合成、调节和摄取,IS1328,IS1329,cf13,IS1400,cf15,cf14,cf16,cf17,cf18,cf19,cf20,DR17,asn,int B,irp9,irp8,irp7,irp6,ybt A,irp2,irp1,fyu A,irp5,irp4,irp3,Yen HPI,的结构示意图,可变区,功能核心区,HPI,5,3,(2)可变区,：,为AT富含区,1、小肠结肠炎耶氏菌的HPI,功能：,小肠结肠耶尔森菌强毒株,Yen HPI,携带与铁摄取有关的基因簇，包括,耶尔森杆菌素(,Ybt),的,合成基因,(,irps,),摄取基因,(,fyuA,),调节基因,(,ybtA,)，,组成耶尔森杆菌素介导铁摄取系统,铁缺乏,小肠结肠耶尔菌强毒株,HPI,合成低分子量的,高铁螯合物铁载体,Ybt,夺取铁,外膜受体(,Psn/FyuA),等,铁转运到菌体内,细菌生长,1、小肠结肠炎耶氏菌的HPI,稳定性：,Yen HPI,至少有4个重复序列(,IS1328、IS1329、RS3、RS4)，,它们,可能与毒力岛的稳定性有关,。,左端15,kb，,毒力岛的大部分是保守的,。,Yen HPI,两端为17,bp,的同向重复序列,DR,17,，,与天冬酰胺,tRNA,基因,asnT-tRNA,3,端不完全重复，与其紧邻的为灭活的整合酶基因,intB,。,因阅读框内单个碱基突变，导致,intB,过早出现终止密码子而灭活，故,Yen HPI,似乎比,Yps HPI,稳定,。,2、鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌的,HPI,结构特点：,Yps HPI,是存在于鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌01血清型染色体上的毒力基因簇，内含合成与摄取耶尔森杆菌素的基因及调节基因，行使铁摄取功能。,色素沉着区,5,功能核心区,可变区,HPI,3,IS100,hmsS,hmsF,hmsR,hmsH,asn,ybtS,int,ybtX,ybtQ,ybtP,ybtA,irp 2,irp 1,ybtU,ybtT,ybtE,fyuA,ybt41,ybt42,ybt43,ybt44,ybt45,ybt46,ybt47,IS100,2、鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌的HPI,Yps HPI,也是由两个区域组成：,功能核心区,可变区,只含1个插入元件,IS100,和另外几个功能未明的编码序列。,Yps HPI,的结构示意图,色素沉着区,5,功能核心区,可变区,HPI,3,IS100,hmsS,hmsF,hmsR,hmsH,asn,ybtS,int,ybtX,ybtQ,ybtP,ybtA,irp 2,irp 1,ybtU,ybtT,ybtE,fyuA,ybt41,ybt42,ybt43,ybt44,ybt45,ybt46,ybt47,IS100,2、鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌的HPI,Yps HPI,比,Yen HPI,小，约35,kb，,不如,Yen HPI,稳定,，可以10,-5,的频率发生完全缺失。,Yps HPI,可以随意整合在3个,asn-tRNA,基因的任一处，而且其中的整合酶基因（,int,）,完整，未被终止密码子干扰。,2、鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌的HPI,鼠疫耶氏菌与伪结核耶氏菌,HPI,的比较,鼠疫耶氏菌和伪结核耶氏菌01血清型的,HPI,高度保守，但两者仍存在一些差异：,(1),HPI,在染色体上的定位不同：,伪结核耶氏菌01血清型没有,Pgm,位点。,(2)HPI的切除或缺失的结局不同：,在鼠疫耶氏菌中，,HPI,不能发生精确切除,在伪结核耶氏菌01血清型中，,HPI,可被精确切除,三、幽门螺杆菌的毒力岛,cag,毒力岛,幽门螺杆菌(,H.pylori,Hp),是引起,胃炎和消化性溃疡,的重要病原菌，是胃癌的危险因素之一。,I,型菌株含有1个约40,kb,的特殊基因片段，具有毒力岛的典型特征，称之为,cag,毒力岛,，负责编码,细胞毒素相关蛋白,(,cytotoxin-associated protein,Cag A),等毒力因子。,三、幽门螺杆菌的毒力岛,1、,cag,毒力岛的结构,(1)存在于,致病菌株,弱毒株和无毒株中不存在或很少见,(5%-10%的,Hp,菌株可发生,cag,毒力岛的部分缺失。),(2)含有,编码细菌毒力的基因簇,。,orf1orf14,orf15orf29,cag A,cag II IS605 cag I,幽门螺杆菌,cag,毒力岛的结构示意图,三、幽门螺杆菌的毒力岛,(3),cag,毒力岛的两侧为31,bp,的同向重复序列，在,cagA,-,菌株的染色体上也存在一个同样的拷贝,。,orf1orf14,orf15orf29,cag A,cag II IS605 cag I,三、幽门螺杆菌的毒力岛,(4),cag,毒力岛并,未插入在任何,tRNA,基因处,，离最近的,tRNA,基因也相关数个,kb，,而是插入在谷氨酸消旋酶(,glutamatase racemase),基因中。,其插入机制可能与其它已知的毒力岛不同,(5),G+C mol%,平均为,35%,，低于,Hp,染色体,DNA,平均,G+C mol%(38%45%)，,提示,毒力岛可能是从外界获得的。,2、,cag,毒力岛的功能,cag,毒力岛所编码的蛋白的功能可能包括,(1),介导,Hp,与宿主细胞粘附,(2),诱导宿主细胞信号转导,(3),构成分泌系统,3、,cag,毒力岛与细菌进化,cag毒力岛的获得及随后的染色体重排,在Hp的进化中起重要作用。,cag,毒力岛,两端具有重复序列的插入元件,33%,Hp,菌株含有一个8.1,kb,的质粒，其,G+Cmol%,与,cag,毒力岛非常接近,cag毒力岛的获得可促使空泡/细菌毒素vacA基因的进化,四、霍乱弧菌的毒力岛,霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌。,已知有200多个血清型，,但只有,01群古典生物型,埃尔托生物型,O139群霍乱弧菌 能引起霍乱暴发流行。,这些菌株带有,毒力岛,VPI,(,V.cholerae,pathogenity island)。,毒力岛,VPI,上携带有,CTX,毒力单元，能产生霍乱肠毒素。,四、霍乱弧菌的毒力岛,结构特点：,（如下图示,）,VPI,毒力岛大小为,39.5,kb,主要包含,aldA,基因、,tagAD,基因簇、,TCP,基因簇和,ACF,基因簇。,G+C mol%,为35%，,明显低于细菌染色体,DNA,的,G+C mol%,(4749%)。,att,ald A tag A,tag D,x y 1 2 3 4,TCP,基因簇,Toxt,ACF,基因簇,irrt att aarA,四、霍乱弧菌的毒力岛,编码产物及功能:,编码毒素协同调节菌毛,(,toxin coregulated pilus,Tcp),辅助定居因子,(,accessory colonization factor,Acf),等毒力因子。,.,毒力岛在细菌进化中的意义,六、毒力岛在细菌进化中的意义,1、毒力岛的获得与细菌毒力的进化,点突变,基因的水平转移,基因重组,是细菌进化的主要推动力。,质粒、噬菌体或转座子的水平转移可能与新现病原菌的产生有关。,六、毒力岛在细菌进化中的意义,毒力岛在细菌毒力的进化中扮演更为重要的角色：,(1)毒力岛,存在于众多细菌中,；,(2)毒力岛的结构特点决定了,DNA,重组的可能性,(3)毒力岛,与质粒和噬菌体关系密切,：,毒力岛所携带的基因也,存在于噬菌体和质粒上,(4)某些致病,具有较高的基因突变率和重组效率,2、,tRNA,位点和毒力岛的其它边缘序列,毒力岛的边缘通常为,tRNA,基因位点,同向重复序列或插入元件，,位点特异性重组具有二个重要特征,：,(1)插入,DNA,片段的两侧为同向重复；,(2)整合酶基因插入在,tRNA,基因附近。,tRNA,位点,在致病菌进化中起着关键作用。,3、毒力岛的缺失与细菌对环境的适应性,从进化观点来看，,毒力岛的获得和缺失,都是基因可塑性或弹性的重要原则。,有的菌为适应新的环境并朝着更有利的生存方式发展，也可能,将原有的毒力岛丢失,。,致病菌毒力岛或其它基因片段的位点,特异性切除或随后的缺失,，可能在细菌适应外界环境方面起一定的作用。,PAI,研究的意义,新出现的病原菌产生的分子机制和进化,病原菌的致病机制,病原菌与宿主细胞的作用,细菌疫苗,发现新毒力岛的策略,七、发现新毒力岛的策略,通过,分子流行病学研究鉴定致病菌的新变异株,，是检测新毒力岛的基础。,步骤,采用传统的流行病学原理和方法,确定研究现场和研究对象,采集标本分离相关菌株,然后利用分子生物学原理和技术,检测鉴定新的遗传变异株。,七、发现新毒力岛的策略,细菌种类繁多，基因组成复杂多变，弄清细菌未知的毒力岛，还,缺乏一个通用易行的有效方法,。,利用已掌握的毒力岛知识和分子生物学新方法，主动地寻找未知的毒力岛。,(1),正向方式,：表现为从结构到功能。,(2),反向方式,：表现为从功能到结构。,基因组岛,通过细菌基因组学研究发现，致病菌基因组中还有大量结构组成特征与,PAI,类似的基因结构，但其功能广泛。,与分泌有关的,“,分泌岛,”,与抗生素耐药性有关的,“,抗性岛,”,与生理代谢有关的,“,代谢岛,”,与细菌共生有关的,“,共生岛,”,将它们与,毒力岛,一起合称：,基因组岛,genomic island,，,GI,汇报人,dddddd,dddddd,大学,谢谢大家,