第九章-细菌类疫苗.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第九章 细菌类疫苗,2,细菌类疫苗,定义,：用细菌、支原体、螺旋体或其衍生物制成，进入人体后使机体产生抵抗相应细菌能力的生物制品,细菌类疫苗,种类：,（1）减毒活疫苗,（2）灭活疫苗,（3）亚单位疫苗或成分疫苗,第一节 概述,3,（,3,）亚单位疫苗或成分疫苗,主要指在细菌培养液中提取，用化学方法脱毒的类毒素，如破伤风类毒素、白喉类毒素。,成分疫苗：主要指从荚膜细菌纯化的细菌多糖疫苗，其诱导机体产生的抗体可抵抗荚膜菌的感染。,5,基本流程,菌液,佐剂,+,乳 化,分装和保存,原料,配置,灭活菌液,灭活,第二节 细菌灭活疫苗,6,灭活疫苗的生产工艺与检定,菌种检定与制备,1,）菌种检定：包括 培养特性、血清学特性、毒力试验、抗原性试验、免疫力试验,制苗用菌种多数为,毒力强、免疫原性优良,的菌株，通常使用,1-3,个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。,各种用于制造菌苗的菌种应按规定,定期复壮,，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，,合格菌种准许用于制苗,。,7,灭活疫苗的生产工艺与检定,菌种检定与制备,2,）菌种制备,菌种启开：接种于适宜的培养基上，,371C,一代培养；,扩量转种：一代菌种的扩量接种，于,371C,二代培养。,将经鉴定,符合标准,的菌种接种于菌苗生产规程中所,规定,的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。,种子液通常保存于,2-8,C,冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。,8,2.,生产方法,（1）固体培养法：,克氏瓶、茄形瓶,（2）液体静置培养法、液体深层通气培养法,3.,细菌采集,（1）固体培养法采集时逐瓶检查，污染杂菌者废弃。,（2）液体培养法采集时应做纯菌试验，确定无杂菌生长。,10,5,浓 缩,为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。,常用的浓缩方法：氢氧化铝胶吸附沉淀法,离心沉降法,羧甲基纤维沉淀法,以上方法可使菌液浓缩一倍以上,。,此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸,食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。,12,7.,配苗及分装,由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。,氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。,有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135 m1 10号白油、11.4m1 Span-85、3.6 ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制,。,配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字,8.,成品检定,按规程进行,14,（3）目前最常用的霍乱疫苗,口服霍乱灭活全菌体+重组霍乱毒素B亚单位,重组霍乱毒素B亚单位（sBS）具有黏膜免疫,佐剂特性，该疫苗安全有效且无明显不良反,应，保护力持久。,15,2.,伤寒疫苗,（1）概述,由伤寒沙门杆菌引起的急性全身感染，患者出,现高热，胃肠炎，败血症等。含有三类抗原:,LPS，荚膜多糖(vi)，鞭毛抗原，耐药性比较严重。,（2）生产工艺与检定,全菌体死疫苗分三种，按杀菌剂不同可分为丙,酮灭活苗，加温加酚灭活苗，甲醛灭活苗。,16,菌株,我国现用两个菌株生产疫苗：,国际通用Ty2株,国内代表株,培养基及培养方法,采用马丁琼脂、肉汤琼脂或其他经批准的培养,基，主要采用固体培养法，也可进行发酵生产,接种后3537培养1824h。,17,成品检定,鉴别试验、外观、化学检定、无菌试验、异常,毒性试验、菌形及纯度检查,疫苗规格及有效期,每安瓿瓶5ml，每人用剂量含伤寒菌610,7,310,8,，28避光保存和运输，有效期1.5,年。,18,（3）伤寒Vi多糖疫苗,早期乙酸处理Vi多糖，抗原性明显降低，经溴化-16-烷基-3-甲基氨处理Vi多糖，得到的非变性多糖可显示较好的免疫原性，但是对2岁以下儿童无效，且多糖是T淋巴细胞非依赖性抗原，不具有加强免疫记忆的作用，蛋白质-Vi多糖结合疫苗正在研制当中。,莢膜（Vi）抗原:,即荚膜多糖（CPS）,是伤寒杆菌细胞外壁的一种荚膜抗原,Vi抗原与其致病性有关Vi来源于毒力的缩写。,20,3.百日咳疫苗,1）概述,由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，主要,侵犯婴幼儿，全病程较长，可持续几个月，故,名百日咳。百日咳菌可分四种相变：相菌毒,力最强，有免疫原性；相毒力消失，无免疫,原性；、相菌介于、之间。,23,原液检定,浓度测定、镜检、血清学试验、无菌试验、特,异性毒性试验、效价测定。,原液保存,28，有效期3年,配合稀释及分装,按原液中具有1、2和3型菌株的配比混合，也,可制成百白破三联疫苗（百日咳、白喉、破伤风）,24,弱毒菌种多系冻干品,，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。,菌种使用前应按,规程规定,进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，,符合标准后方可用于制苗,。,将检定合格的菌种接种子于,规定,的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的,检查合格者,即可作为种子液。,种子液通常在,0,4,C,可保存,2,个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。,第三节 细菌减毒活疫苗,一、生产工艺与检定,（一）菌种与种子,26,经检验,合格,的菌液，按规定比例加入,保护剂,配苗，充分摇匀后随即进行分装，,分装量必须准确,。,分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。,（四）配苗与冻干,为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，,以提高单位活菌数,，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入,0.2%,0.25%,羧甲基纤维素,(CMC),进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。,（三）浓缩,27,流程图1,细菌疫苗制造工艺流程,蛋白质、肉浸液等原料,培养基,细菌分离,菌 种,弱毒菌种,配置、灭菌,鉴定,减毒,检验,配制,灭菌,检验,配制,灭菌,原 料,佐 剂,灭活菌液,配苗、乳化,灭活疫苗,培 养,菌苗原液,配 苗,活疫苗,保护剂,菌 液,分装、冻干,分 装,灭活,原 料,活化,种子,28,30,2）炭疽菌的病原学,革兰氏阳性，个体最大的杆菌之一，呈竹节,状，无鞭毛，在机体内或特殊培养条件下能形,成荚膜。,营养要求不严，需氧，最适温度3437,炭疽杆菌的营养细胞抵抗力不强，芽孢抵抗力,强，过氧乙酸、高锰酸钾、和甲醛对芽孢的杀,灭力较强。,31,抗原,菌体抗原,：多糖组分，耐热性强。,荚膜抗原,：由质粒决定，可以抵抗细胞的吞噬,作用，引起感染，对动物没有免疫保护力，不,能作为疫苗。,毒素抗原,：水肿因子（EF）；致死因子（LF）,；保护性抗原（PA）；单独组分无毒性，成对,结合才能获得毒素活性。,32,3）炭疽疫苗,（1）目前人用炭疽疫苗,减毒活疫苗,铝胶培养上清液疫苗,（2）炭疽疫苗的生产工艺与检定,生产用菌株,人、兽用的炭疽活疫苗生产均采用无荚膜具毒,素（cap,-,tox,+,）菌株，我国采用的的A16R菌,种均由药品生物制品检定所分发。,33,培养及收获,生产用培养基采用牛肉汁琼脂或其他批准培养,基,半成品配置及分装,用灭菌的50%甘油将原液稀释成每ml含菌数,410,9,成品检定,鉴别试验、外观、纯菌试验、特异性毒性试验,活菌数测定、浓度测定、效力测定,34,疫苗规格及有效期,安瓿瓶装，10人份含菌210,9,，28避光,保存运输，有效期两年。,（3）目前人用炭疽疫苗的缺点,毒力不稳定,采用划痕接种，免疫效果不均一,副反应较大,免疫保护力持续时间比较短,35,2、结核疫苗,病原菌为结核杆菌，能引起人畜共患结核病,（1）流行概况,全世界约1/3人口感染；,每年约1600万人患病，,其中300多万人死于结核病。,中国治疗难题：发现率低；,无法接受正规治疗或没钱治疗；,耐药性,36,（2）传染与传播方式,主要由呼吸道传染，,少数由消化道和皮肤粘膜的损伤处侵入。,传播方式：飞沫传染,痰液传染,食物传染,接触传染,37,（3）结核杆菌的潜伏和复燃,结核杆菌类脂质等成分能对抗溶酶体中酶的破坏,作用，使细菌在巨噬细胞内繁殖，导致巨噬细胞,裂解死亡，病状扩散至邻近淋巴结，形成原发感,染灶，当机体抗感染力较强时，淋巴结病灶逐渐,纤维化和钙化，此时病灶内的结核杆菌处于休眠,期，并潜伏下来，几年或十几年后，结合杆菌可,以重新复燃，引起成年人肺结核。,38,（4）结合杆菌抗药性,伴随着结核病回升的另外一个问题是抗药性的,产生，多重抗药性的发生率也越来越高，研制,和开发有效的结合新疫苗势在必行。,39,2）结核杆菌的病原学,革兰氏阳性，含分枝酸，具有抗酸性，胞壁,含大量脂质，有较强的抵抗力,灭菌方法,具有免疫佐剂活性,40,3）结核疫苗,卡介苗的生产工艺与检定,卡介苗（BCG）是牛型结合杆菌经培养后，收,集菌体，加入稳定剂冻干后制成的，用于预防,结核病,菌种,卡介菌D,2,PB302菌株,培养和收集,生产用培养基采用苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培,样基或液体苏通培养基，搜集菌膜压干，低温研磨，,加入稳定剂，制成原液。,41,半成品配置及冻干,用特定的保护剂稀释成半成品，无菌分装到安,瓿瓶内,成品检定,鉴别试验、外观、溶解时间、水分、纯菌试验,、无有毒分枝杆菌试验、活菌计数、效力测定,疫苗规格及有效期,10人份含卡介菌0.40.6mg，28避光,保存运输，有效期一年。,42,（4）新型结核疫苗的研究方向,以BCG为载体的基因工程结核疫苗,营养缺陷型结核减毒活疫苗（牛型/人型）,结核亚单位疫苗,结核DNA疫苗,3、鼠疫疫苗,（1）,概述：,鼠疫是由鼠疫杆菌引起的自然疫源性烈性传染病。,主要以,“,鼠蚤人,”,为主要传播方式。,43,（2）,鼠疫杆菌的病原学,鼠疫杆菌属肠杆菌科，耶尔森氏菌属。,革兰染色阴性短小杆菌。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。,抗原和免疫原性,44,（3）,鼠疫疫苗的生产工艺与检定,菌种：,采用鼠疫杆菌弱毒菌株EV株,培养及收获：,培养基：厚金格尔琼脂培养基（pH6.87.2）,肉眼检查及纯菌试验合格方可收获。,半成品配制及冻干,细菌比浊标准调整原液浓度，加冻干保护剂，分装。,成品检定：,鉴别试验、理化实验、纯菌试验、特异性毒性试验、,活菌数测定、浓度测定、菌形检查、效力测定,疫苗规格及效期,10人份含菌810,9,，,28避光保存运输，有效期一年。,45,第四节 类毒素疫苗,一、概述,类毒素是一种主动免疫制剂，用于细菌毒素性,疾病的预防。,46,1.,有关毒素的几个概念,细菌毒素：致病细菌产生的特异性毒性物质,外毒素：细菌在生长过程中产生，可扩散或,自溶后释放到菌体外,内毒素：菌体细胞壁的结构成分，生存时不,释放，死亡后释放至外界,类毒素：外毒素经处理后去除毒性但仍保留,免疫原性,47,2.,细菌外毒素的特性,1）毒性强,2）亲组织性,3）抗原性,4）双组分结构蛋白质,48,3.,类毒素的生产,1）产毒,人工培养产毒细菌获得毒素,菌种,产毒力强、稳定,产毒培养基,49,培养基应符合下面几个方面的要求,（1）能提供产毒必要的成分,（2）能调节影响产毒诸因素的平衡,（3）能缓解对产毒有害物质的作用,（4）能保护已经产生的毒素,（5）不能含有对人有害或引起过敏反应的物质,50,培养方法,根据菌种的特性与具体的实验来决定,2）脱毒,影响因素：温度、pH、甲醛浓度、毒素,3）精制,适用于规模化生产，条件温和，避免对抗原的,损伤,51,4.,毒性逆转及其相关因素,毒素类毒化后仍有毒性逆转的可能，与毒性逆,转有关的因素有：,稀释,脱毒条件,小分子物质的影响,52,二、常用细菌类毒素疫苗,1.,白喉类毒素,1）概述,由白喉杆菌引起的急性呼吸道传染病，产生外,毒素引起局部炎症及组织坏死,53,2）白喉杆菌的病原学,（1）形态及生活习性：革兰氏阳性棒状杆菌,，需氧或兼性厌氧，抵抗力较弱,（2）分型：重型、中间型、轻型，流行中的,多为轻型，引起的症状最轻,（3）白喉毒素（Diphtheria toxin）的分子,结构及致病机制,54,3）白喉类毒素的生产工艺与检定,（1）生产工艺,菌株：PW8或由其筛选得到,产毒培养基：氮源、能源、生长因子、无机,离子,培养：严格控制杂菌污染,精制：硫酸铵、活性炭分段盐析法或其他适,宜方法,脱毒：甲醛脱毒后进行脱毒检查,吸附精制白喉类毒素：以Al（OH）,3,吸附剂,为免疫佐剂,55,（2）白喉类毒素的检定,鉴别试验,外观,化学检定,安全试验,保护力试验,56,2.,破伤风类毒素,1）概述,破伤风梭菌兼性厌氧，营养型菌抵抗力不强，,芽孢具有强大的抵抗力，产生溶血素和神经,毒素两种毒素，最毒的生物毒素之一，每mg,可杀死2亿只小白鼠,57,2）破伤风类毒素的生产,（1）菌株,毒力高、抗原性好、稳定,（2）培养基,厌氧培养基，含有丰富的营养和刺激产毒成分,（3）深层静止培养法培养,（4）甲醛脱毒,（5）精制,（6）,Al（OH）,3,佐剂吸附,58,第五节 细菌多糖疫苗,引起人类疾病并带有,荚膜多糖,的细菌主要有：,b型流感嗜血杆菌（Hib）,肺炎球菌,流行性脑膜炎双球菌（流脑）,伤寒杆菌,59,荚膜多糖是细菌细胞壁的主要成分，是一种强毒力因子。其致病力来自于荚膜多糖的抗吞噬作用。,根据荚膜多糖的化学结构和免疫学特性可将细菌分为不同的血清型。,A群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产工艺：,一、菌种,生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟菌CMCC29201（A4）菌株。,二、培养及收获,生产用的培养基采用改良的半综合液体培养基或其他适宜的培养基，采用培养罐液体培养。,60,三、培养物的收集和杀菌,于对数生长期的后期或静止期的前期中止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，,合格后加甲醇杀菌或56度加热10min杀菌。,四、多糖的提纯和精制,全过程应在(85)低温室内进行。,1、去核酸,2、沉淀多糖,3、多糖的精制,冷酚提取法,61,五、半成品配制,将多糖原液加入无菌无热原质乳糖，并用灭菌,注射用水稀释，使每人用剂量疫苗含多糖30,g，乳糖2.53mg,六、分装及冻干,按生物制品分装和冻干规程进行,62,七、成品检定,1、鉴别试验,2、外观,3、化学检定,4、核酸含量,5、,O-,乙酰基含量,6、唾液酸含量,7、特异性试验,